張玉卓 任輝 余翔 許銀坤 許獻光 丁富平 黃進 張進*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué), 廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 廣東 廣州 510405

隨著年齡的增長，骨髓內(nèi)微環(huán)境的改變，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs)分化成骨細(xì)胞數(shù)量的減少和成骨能力的減弱[1,2]，造成骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)。臨床發(fā)現(xiàn)，OP表現(xiàn)在骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)破壞與骨質(zhì)量降低的同時，骨髓脂肪組織顯著增多[3,4]。調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)微環(huán)境，促進BMSCs成骨分化[5]，對于防治OP具有重要意義。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨生髓，因此，探討補腎方藥促進BMSCs成骨分化有一定的臨床意義。但其作用機制的相關(guān)研究仍然較少，近年來報道FNDC5、BMP2基因在成骨分化過程中起重要調(diào)控作用[6,7]。本研究擬采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs，分別用高、低劑量金匱腎氣丸血清和空白血清、和干預(yù)BMSCs成骨分化過程，通過CCK8檢測、AKP活性檢測、ALP染色、RT-q PCR和Western-blotting等方法對金匱腎氣丸促BMSCs的成骨分化能力及其作用機制進行了初步探討。

1 實驗材料

1.1 藥物

金匱腎氣丸:制附子(先煎)6 g、桂枝 6 g、生地黃30 g、山藥15 g、山茱萸15 g、澤瀉12 g、茯苓12 g、牡丹皮12 g (北京同仁堂股份有限公司提供)。以上藥物加水漫過藥面2 cm,浸泡30 min后, 先煎附子30 min,再納入其他藥物,大火煮沸后再煎30 min,第2煎加水量為第1煎的1/2,共煎2次,每次煎得藥150 mL, 合并煎液,過濾,濃縮至120 mL,高溫、高壓滅菌,5 ℃冷藏備用。

1.2 動物

SD大鼠24只，雄性，SPF級，3月齡，體質(zhì)量150～180 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(粵)2013-0092。

1.3 分組、動物含藥血清制備及給藥

將24只大鼠隨機分成3組(每組8只)，分別為：金匱腎氣丸低劑量組(SD組)、金匱腎氣丸高劑量組(SG組)和空白對照組(CON組)。藥劑量按照人與大鼠體表面積折算，SD組給藥劑量為13 mg/kg/d，SG組給藥劑量為26 mg/kg·d，CON組給予和SD組相同體積的生理鹽水。各組每天灌胃兩次，上下午各一次，連續(xù)1周，最后一次給藥2小時后10%水合氯醛麻醉后，無菌條件下腹主動脈取血，4 ℃凝固，離心3 000 rpm，15 min，獲取血清：正常血清，低劑量含藥血清、高劑量含藥血清。

1.4 試劑

CCK8試劑盒(上海貝博公司)；AKP活性檢測試劑盒(南京建成公司)；ALP染色試劑盒、蛋白裂解液(碧云天公司)；10%水合氯醛、胰蛋白酶PBS緩沖液(廣州化學(xué)試劑廠)；RNA提取盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄盒及qPCR擴增盒(TAKARA公司)；一抗：abcam。蛋白提取試劑主要包括：Tris-HCl、Triton X-100、BSA、cocktail蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒(Thermo公司)；RNA提取試劑主要包括：DEPC水、氯仿、異丙醇、75%乙醇、溴化乙錠、瓊脂糖(廣州化學(xué)試劑廠)，Trizol提取試劑盒(TAKARA公司)。qPCR試劑包括：PrimeScript TM RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄盒(TAKARA公司)。

1.5 儀器

超微量分光光度計(NanoDrop Technologies)，分析天平(德國賽多利斯集團公司)，高速冷凍離心機(Sigma公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡(NIKON 公司)，超凈工作臺(ESCO公司)。T100梯度PCR儀、CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad 公司，美國)，全波長酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)。

2 方法

2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)、傳代

選取4～6周齡大鼠，用10%水合氯醛麻醉，75%酒精消毒下半身，無菌條件下取出雙下肢股骨和脛骨，暴露髓腔，用預(yù)先配好的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基沖洗髓腔，收集骨髓沖洗液，離心后，吸取下層含BMSCs，接種于培養(yǎng)瓶中，置入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換一次液。細(xì)胞長滿后(細(xì)胞融合約80%)，吸走培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗細(xì)胞后，加入2.5 g/L的胰蛋白酶消化45秒左右，加入少量10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打培養(yǎng)瓶底，將消化混合液離心，吸取下層BMSCs細(xì)胞層，按1∶2比例傳代。

2.2 含藥血清分組干預(yù)BMSCs

應(yīng)用金匱腎氣丸高、低劑量含藥血清和空白血清分別干預(yù)BMSCs，分組為SG組、SD組和CON組。各組干預(yù)1、3、5、7、10天后CCK8檢測BMSCs增殖、毒性作用；分別在干預(yù)第3天和7天時檢測AKP活性、ALP染色評估BMSCs成骨分化活性及能力，PCR及Western-blotting檢測FNDC5、BMP2的mRNA及蛋白表達。

2.3 CCK8檢測

BMSCs以2000細(xì)胞/孔種植到96孔板，用于CCK8檢測。10% FBS基培養(yǎng)一天，確認(rèn)BMSCs貼壁后，應(yīng)用含藥血清和空白血清分組干預(yù)，每組細(xì)胞在干預(yù)培養(yǎng)的第 1、3、5、7、10 天進行CCK8檢測，每孔加入 CCK8 工作液10 μL，孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞450 nm 處的吸光度(OD 值)。每個時間點設(shè) 6個復(fù)孔，重復(fù)該實驗3次，最后匯總每次測得的OD值，取平均值進行統(tǒng)計分析。

2.4 AKP活性檢測

BMSCs以2×104細(xì)胞/孔種植到6孔板，應(yīng)用含藥血清分組干預(yù)，分別在第3、7天，取細(xì)胞上清液進行AKP活性檢測。具體步驟如下：(1)按表1配置反應(yīng)液。(2)上述加樣完畢后，充分混勻，37 ℃水浴15 min反應(yīng)。(3)每孔加入50 mL顯色劑。(4)輕輕振搖孔板混勻，用酶標(biāo)儀在波長520 nm下，測定各孔吸光度值。(5)AKP活性計算：AKP活性=(測量空-空白孔)/(標(biāo)準(zhǔn)孔-空白孔)×0.1 mg/mL×100 mL。

表1 加樣體系Table 1 Sample adding System

注：“-”表示該孔不用添加該項目。
Note: “-”No sample needs to be added to that cell.

2.5 ALP染色

BMSCs以2×104細(xì)胞/孔種植到6孔板，應(yīng)用含藥血清分組干預(yù)，在第7天時進行ALP染色。ALP染色具體步驟：(1)固定細(xì)胞：吸走培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌3～5次，4%多聚甲醛適當(dāng)固定，并適當(dāng)洗滌3～5次，每次3～5分鐘，末次洗滌結(jié)束后,吸走洗滌液；(2)按試劑盒說明配置BCIP/NBT染色工作反應(yīng)液；(3)加入1 mL BCIP/NBT染色工作液(確保能充分覆蓋細(xì)胞)；(4)室溫避光孵育30分鐘(可適當(dāng)增加時間，最長可達24小時)，直至顯色至預(yù)期深淺；(5)去除BCP/NBT染色工作液，純水(蒸餾水)洗滌1～2次即可終止顯色反應(yīng)。

2.6 熒光定量(RT-qPCR)檢測

BMSCs以2×104細(xì)胞/孔種植到6孔板，應(yīng)用含藥血清分組干預(yù)，在第3、7天時每組各取3個培養(yǎng)孔細(xì)胞進行RT-qPCR檢測。應(yīng)用TAKARA MiniBEST Universal提取試劑盒提取各組BMSCs總RNA，Thermo全波長酶標(biāo)儀分析RNA濃度和純度，PrimeScriptTM RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄盒進行cDNA合成反應(yīng)，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ操作步驟，使用Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR 儀進行兩步法熒光定量分析，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 1min延伸，40個循環(huán)，每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)孔， 擴增用引物序列見表2。

表2 引物設(shè)計Table 2 The primer sequences

2.7 Western-blotting(WB)檢測

BMSCs以2×104細(xì)胞/孔種植到6孔板，應(yīng)用含藥血清分組干預(yù)，在第3、7天時每組各取3個培養(yǎng)孔細(xì)胞進行WB檢測。應(yīng)用RIPA液裂解細(xì)胞提取各組細(xì)胞蛋白，離心獲取上清蛋白后，應(yīng)用BCA 法進行蛋白定量。以RIPA調(diào)整蛋白濃度，樣品終濃度為4.0 μg/μL，加入 5×蛋白樣品緩沖液，95 ℃ 5分鐘。根據(jù)目的蛋白的分子量制膠，常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。 轉(zhuǎn)膜后將膜完全浸沒于5%BSA-TBST中水平搖床室溫孵育6小時進行封閉。用 5%BSA-TBST 稀釋一抗(FNDC5稀釋為1∶1000，BMP2稀釋為1∶1000，β-actin 1∶10000)，4 ℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜3次后相應(yīng)二抗室溫孵育 40分鐘(1∶10000)。TBST洗膜3次后ECL顯影，膠片曝光。

圖3 7天時各組AKP染色情況Fig.3 AKP staining results in each group at the 7th day

3 統(tǒng)計學(xué)處理

4 結(jié)果

4.1 金匱腎氣丸對BMSCs增殖、毒性的作用

CCK8法測定各組細(xì)胞各時間點的吸光度值可發(fā)現(xiàn)：隨著時間的增加，從第1天到第7天，BMSCs增殖呈上升趨勢，雖然第3～5天時略有下降，但下降值無統(tǒng)計學(xué)差異。且各組間增加程度無統(tǒng)計學(xué)差異。第7～10天，BMSCs增殖呈現(xiàn)下降趨勢。詳見圖1。

圖1 三組細(xì)胞生長增殖曲線Fig.1 Cell growth value curve groups of three groups

4.2 金匱腎氣丸對BMSCs成骨活性的影響

如圖2所示，AKP活性檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)3天時，SG組AKP活性高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，SD組AKP活性雖然與CON組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但SD組AKP活性高于CON組。7天時，SG、SD組AKP活性均高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 三組AKP活性注：與CON組比較,*P<0.05;SG組與SG、CON組相比，**P<0.05Fig.2 AKP activity of the three groupsNote: *P<0.05,vs. CON group;SG Group vs.SD and CON Group,**P<0.05

4.3 金匱腎氣丸對BMSCs成骨分化能力的影響

如圖3所示，含藥血清干預(yù)7天時，ALP染色結(jié)果顯示，SG組和SD組ALP染色陽性率均高比CON組，說明金匱腎氣丸含藥血清干預(yù)兩組成骨分化能力較CON組更強。而SG組ALP染色率高于SD組，說明SG組成骨分化能力強于SD組。

4.4 金匱腎氣丸對BMSCs中 FNDC5、BMP2 mRNA表達的影響

圖4 各組 FNDC5 mRNA和BMP2 mRNA表達注：與CON組比較,*P<0.05; 與CON組比較,**P<0.01；SD組與SG組相比，#P<0.05Fig.4 The expression results of FNDC5 mRNA and BMP2 mRNA of BMSCs in different groupsNote:*P<0.05, vs.CON group;**P<0.01, vs.CON group; SG Group vs.SD Group, #P<0.05

如圖4所示，3天時，SD組FNDC5 mRNA表達顯著高于CON組和SG組(P<0.01)，SG組和CON組雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但SG組有高于CON組趨勢；SG組和SD組BMP2 mRNA表達顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。7天時，SG組FNDC5 mRNA表達均高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SD組FNDC5 mRNA表達高于SG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SG組和SD組BMP2 mRNA表達均顯著高于CON組(P<0.01)，但SG組和SD組BMP2 mRNA表達無明顯差異。

4.5 金匱腎氣丸對BMSCs FNDC5、BMP2蛋白水平的影響

圖5 各組第3、7天FNDC5、BMP2蛋白水平情況注：與CON組比較,*P<0.05; 與CON組比較,**P<0.01；SD組與SG組相比，#P<0.05Fig.5 The levels of FNDC5 and BMP2 protein at the 3th and 7th day in each groupNote:*P<0.05, vs.CON group;**P<0.01, vs.CON group; SG Group vs.SD Group, #P<0.05

如圖5所示，3天時， SG組、SD組FNDC5、BMP2蛋白水平顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。SG、SD兩組無統(tǒng)計學(xué)差異。7天時，SG組、SD組FNDC5蛋白水平顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且SD組FNDC5水平高于SG組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SG組、SD組BMP2蛋白水平均亦高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，SG、SD兩組之間的BMP2蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異。

5 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主骨生髓。骨髓藏于髓腔內(nèi)，滋養(yǎng)骨骼，骨的生長發(fā)育依賴腎氣的滋養(yǎng)與推動。骨髓中的成體干細(xì)胞的分化能力與分化方向代表骨髓的功能，由“腎”主導(dǎo)，當(dāng)前研究認(rèn)為調(diào)節(jié)“腎”的陰陽可以調(diào)控BMSCs的分化功能。BMSCs成骨分化受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中FNDC5和BMP2是特異性成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6-8]。補腎中藥對BMSCs成骨分化作用的研究是目前探索中醫(yī)藥防治OP作用機制的熱點之一。本研究通過對金匱腎氣丸調(diào)控FNDC5、BMP2對BMSCs成骨分化的作用的研究，豐富補腎中藥治療OP起效的作用機制內(nèi)涵。金匱腎氣丸方中附子、肉桂、熟地、山藥、山萸肉合用，有溫陽暖腎，補腎填精，化腎氣、行水之功效。澤瀉、丹皮、茯苓以瀉 助補。全方溫而不燥，滋而不膩，陰中求陽，是補腎陽的經(jīng)方，用于治療腎陽不足證，也可用于骨質(zhì)疏松的治療[9,10]。

CCK8檢測是檢測細(xì)胞增殖和毒性的重要指標(biāo)之一[11]。本研究中CCK8檢測發(fā)現(xiàn)：隨著時間的增加，從金匱腎氣丸含藥血清干預(yù)第1天到第7天，各組BMSCs增殖整體呈上升趨勢，雖然第3～5天時略有下降，但下降值無統(tǒng)計學(xué)差異；各組增加程度無統(tǒng)計學(xué)差異。提示金匱腎氣丸具有較強的促BMSCs增殖作用，起作用與空白組含藥血清相當(dāng)，且無明顯毒性作用，說明金匱腎氣丸是一種有潛力的促成骨分化藥物。

堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP/AKP)是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志[12]。AKP由成骨細(xì)胞分泌，其活性可反映成骨細(xì)胞功能的強弱。骨組織中含有豐富的AKP，集中于成骨細(xì)胞表面或周圍,當(dāng)成骨細(xì)胞增殖、分化時會出現(xiàn)血清AKP活性上升,因此,進行AKP活性檢測和ALP染色能夠敏感的評估骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。本研究發(fā)現(xiàn)各組含藥血清干預(yù)BMSCs第3、7天時,SG和 SD組AKP活性均高于CON組。ALP染色與CON組相比，可見SG和SD組均具有更高的染色陽性率，雖然干預(yù)第3天時SD與CON組AKP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但SD組顯示出高于CON組的趨勢，以上結(jié)果提示金匱腎氣丸能夠促進BMSCs成骨分化。

FNDC5即III型纖維連接蛋白域蛋白5(Human Fibronectin type III domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5)，2002年首次提出frcp2 (即為FNDC5)主要為FNIII 家族中的一員，主要在骨骼肌、腦和肝臟中表達[13]。FNDC5是由骨骼肌分泌的一種薄膜蛋白[6,13]，在能量代謝方面有一定的改善作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NDC5含量與骨骼肌含量呈正相關(guān)[14]。此外，F(xiàn)NDC5在皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪中也表達這種蛋白[15]。FNDC5 被認(rèn)為是用于治療代謝性疾病的潛在靶點[6,13]。本研究中，含藥血清干預(yù)3天時，SD組FNDC5 mRNA呈上調(diào)趨勢，其表達高于CON、SG組，但SG、CON組無統(tǒng)計學(xué)差異；WB結(jié)果也提示SG、SD組FNDC5、BMP2蛋白水平均顯著高于CON組(P<0.01)。含藥血清干預(yù)7天時，SG、SD組FNDC5 mRNA表達較CON組上調(diào)(P<0.05)。同時期的WB結(jié)果也提示SG組、SD組FNDC5蛋白水平顯著高于CON組(P<0.01)。FNDC5基因表達上調(diào)與金匱腎氣丸促進BMSCs提示可能與FNDCs上調(diào)相關(guān)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)是影響新骨形成的常見因子,對骨原細(xì)胞的分化起決定性作用,是促進成骨的主要因子[12]。BMPs家族有40多種成員，其中BMP2是轉(zhuǎn)化生長因子fi (TGF-13)超家族中的多功能細(xì)胞因子,可促進細(xì)胞增殖，提高其AKP活性[12]。BMP2信號通路是與骨形成密切相關(guān)的通路，BMP2基因是公認(rèn)的與成骨密切相關(guān)的基因[6-8]，能促進成骨分化，有研究證明，BMP2對 BMSCs的成骨分化具有促進作用[16]。本研究中，各組干預(yù)BMSCs 3天時， SG、SD組BMP2 mRNA表達較CON組上調(diào)(P<0.05)，且同時期SG、SD組BMP2蛋白水平顯著高于CON組(P<0.01)。7天時，SG、SD組BMP2 mRNA表達均高于CON組。且同時期SG、SD組BMP2蛋白水平均高于CON組(P<0.05)，SG、SD兩組之間的BMP2蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異。因此，BMP2基因和蛋白表達上調(diào)提示金匱腎氣丸具有促進成骨分化的作用。FNDC5和BMP2在mRNA表達及蛋白水平上呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，均高于CON組，二者共同上調(diào)，提示二者可能通過協(xié)同作用促進成骨分化。

綜上，本研究結(jié)果結(jié)果初步證明金匱腎氣丸能促進BMSCs增殖，增加BMSCs成骨分化活性和分化能力。這有可能是通過上調(diào)FNDC5、BMP2基因的表達來實現(xiàn)的。FNDC5和BMP2二者共同上調(diào)，提示金匱腎氣丸可通過上調(diào)FNDC5和BMP2促進BMSCs成骨分化。這一初步的結(jié)論尚需要進一步驗證，并探討其詳細(xì)的調(diào)控作用與機制。FNDC5和BMP2的進一步研究在OP 的機制闡明及靶點預(yù)測方面具有重要意義。