劉春靜 陳 雋 董 冰 陸相輝 李麗萍

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院婦三科,齊齊哈爾161000)

不同分型卵巢癌患者組織中瘦素mRNA表達的相關研究①

劉春靜 陳 雋②董 冰 陸相輝 李麗萍

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院婦三科,齊齊哈爾161000)

目的：探討不同分型卵巢癌患者組織中瘦素(Leptin)mRNA的表達差異及臨床價值。方法：收集我院2015年6月～2016年6月收治的卵巢癌患者129例及正常對照42例，于超聲引導下行卵巢穿刺活檢術，取少量卵巢周圍組織，提取總RNA并純化mRNA，運用RT-PCR技術檢測各組leptin mRNA的表達情況，并分析leptin表達與不同分期，不同病理分型相關性。結果：與正常對照組相比，各組卵巢組織中l(wèi)eptin mRNA的表達均有所升高(P<0.05)，且漿液性腺癌組leptin mRNA的表達尤為明顯(P<0.05)；漿液性腺癌組各臨床分期中，Ⅲ期卵巢組織中l(wèi)eptin mRNA的表達最為顯著(P<0.05)。結論：Leptin在不同分型不同分期卵巢癌組織中有一定表達差異，可能成為一種早期檢測、診斷卵巢癌的新型指標。

卵巢癌；病理分型；瘦素；mRNA

在女性常見的惡性腫瘤中，卵巢癌具有較高的發(fā)病率，僅次于宮頸癌和宮體癌[1,2]。大部分患者初期癥狀并不明顯，往往為腰腹部疼痛，或伴有腹脹等消化道癥狀，患者經(jīng)常出現(xiàn)未在意、未檢查、未治療的情況，待癥狀加重或擴散后，才做全面檢查及治療，但通常已屬中晚期，已錯過最佳治療時機，直接導致卵巢癌治愈率低而死亡率高[3,4]。目前，診斷卵巢癌的檢測指標多樣且繁瑣，綜合檢查后才可確診；活檢病理雖可快速、及早確診，但對患者自身有一定損傷。因此，尋找安全、簡單可早期確診卵巢癌的檢測指標已成為降低女性婦科疾病死亡率的當務之急。研究顯示，瘦素(Leptin)是一種脂肪因子類激素，不僅可調控進食，還具有影響胚胎發(fā)育、性成熟及免疫功能等作用[5-8]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，leptin血清水平在女性中明顯高于男性，提示機體中性激素對leptin表達有一定調控作用，而卵巢癌則為激素依賴性腫瘤[9-11]。Leptin的表達程度可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是否相關，尚不可知。筆者試通過檢測患者組織中l(wèi)eptin mRNA表達，以探究不同分型不同分期卵巢癌患者組織樣本中的差異，為尋找早期診斷卵巢癌檢測新指標提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 納入標準:(1)符合《2015NCCN卵巢癌臨床實踐指南(第1版)》[12]中的相關診斷標準；(2)經(jīng)臨床病理學檢查確診并分型；(3)研究開始前3個月未進行放化療者。排除標準:(1)排除內分泌紊亂患者，或者是雌激素紊亂患者；(2)非癌灶轉移，有嚴重心、肺、肝、腎等重要臟器功能不全、損傷或衰竭者；(3)有嚴重精神疾患者；(4)依從性差，中途退出者。

根據(jù)上述標準，收集我院2015年6月～2015年12月收治的卵巢癌患者129例，年齡36～48歲，平均(42.19±3.34)歲；病程8個月～21個月，平均(14.52±4.24)個月；病理分型:黏液性腺癌30例、子宮內膜樣腺癌33例、漿液性腺癌42例、鱗狀細胞癌24例；根據(jù)《2015NCCN卵巢癌臨床實踐指南(第1版)》中卵巢癌臨床分期診斷標準，將收集病例分為:Ⅰ期36例，Ⅱ期54例，Ⅲ期33例，Ⅳ期6例。同時收集40例同期來我院做疑似檢查，經(jīng)確診后排除附件良性及惡性腫瘤對照患者，年齡40～52歲，平均(46.33±2.72)歲。研究對象對所有研究內容知情同意，經(jīng)簽署知情同意書后，被納入本項目之中，于超聲引導下行卵巢穿刺活檢術，取少量卵巢周圍組織，-80 ℃冷藏備用。

1.1.2 試劑及儀器 Trizol(美國Invitrogen公司，15596018)；總RNA提取試劑盒(Promega公司，LS1040)；mRNA純化試劑盒(Promega公司，Z5210)；反轉錄試劑盒(Promega公司，A3500)；PCR擴增試劑盒(TaKaRa公司，DRR019A)；移液器(Eppendorf公司，research)；核酸電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-5)；臺式高速離心機(澳大利亞DYNAMICA公司，VElOCITY 18R)；PCR儀(美國Bio-Rad公司，T100)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，Chemi DOC XRS+)等；實驗引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 經(jīng)查閱Genebank，結合Primer 3在線軟件設計leptin引物，交由上海生工生物工程有限公司合成。leptin上游引物(FP):5′CCAAGATGGACCAGACACTG3′，下游引物(RP):5′GCCACCACCTCTCTGGAGTA3′，產(chǎn)物長度為220 bp；β-actin上游引物(FP):5′TCCTAGCACCATGAA-GATC3′；下游引物(RP)5′AAACGCAGCTCAGT-AACAG3′，產(chǎn)物長度為190 bp。

1.2.2 Leptin mRNA表達檢測[12]依據(jù)總RNA提取試劑盒及mRNA純化試劑盒提取并純化各組組織中RNA；依據(jù)反轉錄試劑盒按照以下過程反轉錄:已純化mRNA 1 μg中加無酶水，65℃孵育5 min；20 μl逆轉錄反應體系(10×RT Buffer 2 μl、MgCl225 mmol/L 4 μl、dNTP Mix 2 μl、RNA酶抑制劑 0.5 μl、AMV反轉錄酶 15 U、模板RNA l μg、RNase-free dH2O至20 μl)，37℃，15 min；98℃，5 min；5℃，5 min。依據(jù)PCR擴增試劑盒進行聚合酶鏈式反應，PCR反應總體系50 μl(5×PCR Buffer 10 μl、RNase-free dH2O 28.75 μl、Ex Taq HS 0.25 μl、FP 0.5 μl、RP 0.5 μl、cDNA 10 μl)，預變性95℃，3 min。擴增循環(huán):95℃，0.5 min；60℃，1 min，72℃，1 min；共40個循環(huán)。擴增完成后，將產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠上樣孔中，以5 V/cm恒定電壓電泳25 min，并于凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察、拍照，運用Image Lab軟件對瓊脂糖凝膠電泳條帶進行分析，得出leptin基因和β-actin基因相對表達量。

2 結果

2.1 不同分型不同臨床分期卵巢癌患者年齡、病程臨床基本資料比較 經(jīng)統(tǒng)計學分析，不同分型不同臨床分期卵巢癌患者年齡、病程等相關臨床基本資料無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，可比性較好。

2.2 不同分型卵巢癌中l(wèi)eptin mRNA的表達情況 如圖1A所示，不同分型卵巢癌中l(wèi)eptin總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示28S rRNA及18S rRNA條帶清晰，5S條帶模糊，說明RNA純度與完整性較好。

如圖1B、C所示，不同分型卵巢癌中l(wèi)eptin mRNA的表達情況:正常組leptin mRNA的表達較低；與正常對照組相比，其余各組leptin mRNA的表達均有所升高(P<0.05)，且漿液性腺癌組leptin mRNA的表達尤為明顯(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 不同分型卵巢癌患者年齡、病程臨床基本資料比較

Tab.1 Comparison in basic data among different kinds of ovarian cancer

GroupsClinicalstagenAge(year)Course(month)Mucinousadenocarcino-magroupⅠ1039.12±4.1112.11±2.37Ⅱ1138.24±3.3615.24±3.15Ⅲ844.57±2.5912.39±4.02Ⅳ140.36±3.2914.14±4.33Endometrioidadenocar-cinomagroupⅠ836.64±4.9113.67±2.95Ⅱ1545.55±3.878.99±6.15Ⅲ938.16±5.2614.95±4.29Ⅳ140.22±3.2714.52±4.66SerousadenocarcinomagroupⅠ1242.39±4.0313.89±3.57Ⅱ2041.19±5.1213.54±4.24Ⅲ843.02±1.2715.69±3.58Ⅳ238.95±5.8517.11±2.16Squamouscellcarcino-magroupⅠ641.45±6.4716.17±3.15Ⅱ844.64±4.5915.42±4.26Ⅲ838.29±5.3514.25±3.19Ⅳ240.18±5.1214.17±4.68

圖1 不同分型卵巢癌中l(wèi)eptin mRNA的表達情況Fig.1 mRNA expression of leptin in different kinds of ovarian cancerNote: 1.Mucinous adenocarcinoma group;2.Endometrioid adenocarcinoma group;3.Serous adenocarcinoma group;4.Squamous cell carcinoma group;5.Normal group;M.DNA marker.Compared with normal group,*.P<0.05.

圖2 漿液性腺癌組不同臨床分期leptin mRNA的表達情況Fig.2 mRNA expression of leptin in different clinical stages in serous adenocarcinoma groupNote: 1.Normal group；2.Clinical stage FIGO Ⅰ of serous adenocarcinoma；3.Clinical stage FIGO Ⅱ of serous adenocarcinoma；4.Clinical stage FIGO Ⅲ of serous adenocarcinoma；5.Clinical stage FIGO Ⅳ of serous adenocarcinoma；M.DNA marker.Compared with normal group,*.P<0.05.

2.3 漿液性腺癌組不同臨床分期leptin mRNA的表達情況 如圖2A所示，不同分型卵巢癌中l(wèi)eptin總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果顯示28S rRNA及18S rRNA條帶清晰，5S條帶模糊，說明RNA純度與完整性較好。

如圖2B、C所示，漿液性腺癌組不同臨床分期leptin mRNA的表達情況:與正常對照組相比，漿液性腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期leptin mRNA表達均較明顯，尤以Ⅲ期表達為顯著(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義。

3 討論

Leptin是一個16 kD、由146個氨基酸殘基組成的脂肪因子類激素，一些非脂肪細胞可合成并分泌leptin，如卵巢、乳腺上皮細胞、肌細胞和胎盤等[5,6]。衛(wèi)海燕等[9]收集78例中樞性早熟女童為研究對象，經(jīng)測量其身高、體質量及空腹血清檢測性激素及l(fā)eptin含量發(fā)現(xiàn)，性早熟女童各項檢測指標均高于對照女童，且leptin與黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)的具有較強相關性；李麗文等[10]同樣通過檢測并分析31例多囊卵巢綜合征患者血清中LH、FSH與leptin含量發(fā)現(xiàn)leptin升高與性激素分泌紊亂與多囊卵巢綜合征有一定相關性；性激素對leptin表達具有調控作用，而leptin的表達極有可能與卵巢癌等婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定的關系。本課題組通過收集不同分型卵巢癌患者，檢測不同患者組織中l(wèi)eptin mRNA表達，并分析卵巢癌患者組織樣本中的差異，以期探討leptin mRNA表達與卵巢癌發(fā)生的關系。

本實驗結果顯示，正常對照組leptin mRNA的表達較低；黏液性腺癌組、子宮內膜樣腺癌組、漿液性腺癌組及鱗狀細胞癌組leptin mRNA的表達均較正常對照組高(P<0.05)，此結果與郭玉琪等[13]學者研究結果基本一致，說明leptin在不同分型卵巢癌中均有所表達，其原因極有可能與leptin可通過調節(jié)TGF-β1、VEGF等細胞因子的表達，進而參與組織纖維化[14,15]有關。實驗過程中發(fā)現(xiàn)漿液性腺癌組leptin mRNA的表達尤為明顯，且該分型Ⅲ期卵巢癌組織leptin mRNA表達極其顯著，說明leptin在發(fā)病率及惡性程度相對較高的腺癌中有較高的表達，具有一定臨床意義，但其機制尚未知否。

綜上所述，在本實驗中，leptin于不同分型不同病理分期的卵巢癌組織中存在一定表達的差異，leptin有可能成為一種早期檢測、診斷卵巢癌的檢驗指標，但由于本實驗仍處于初步探索階段，病例的收集、實驗的設計及操作過程仍需進一步的增擴及改善，以期更深入研究leptin在不同分型卵巢癌中具體的表達機制。

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[收稿2017-01-19 修回2017-03-07]

(編輯 張曉舟)

Research on mRNA expression of leptin in different kinds of ovarian cancer

LIUChun-Jing,CHENJun,DONGBing,LUXiang-Hui,LILi-Ping.

TheThirdDepartmentofGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalCollege,Qiqihar161000,China

Objective:To explore the mRNA differential expression and clinical effect of leptin in different kinds of ovarian cancer.Methods: 129 patients with ovarian cancer and 42 controls were collected from Jun.2015 to Jun.2016 in our hospital.We got a small tissue by ovarian biopsy guided under the ultrasonic processing,detected the total RNA,purified mRNA and analyzed the correlation of the expression of leptin in different kinds and clinical stages of ovarian cancer.Results: Compared with the control groups,the mRNA expression of leptin in each group was increased(P<0.05),and the serous adenocarcinoma group increased obviously(P<0.05).Patients with clinical stage FIGO Ⅲ was significantly higher than other stages in serous adenocarcinoma group(P<0.05).Conclusion: Leptin could express in different kinds and clinical stages of ovarian cancer,and may be a new detection index for early diagnosis of ovarian cancer.

Ovarian cancer;Pathological types;Leptin;mRNA

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.027

①本文受齊齊哈爾市科學技術局項目資助(No.SFGG-201521)。

劉春靜(1979年-)，女，主治醫(yī)師，主要研究卵巢腫瘤的相關診斷和治療研究，E-mail：390009106@qq.com。

R71

A

1000-484X(2017)07-1084-04

②通訊作者，E-mail：390009106@qq.com。