丁 健，阮成江，關(guān) 瑩，單金友

(1.資源植物研究所 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(大連民族大學(xué)), 遼寧 大連 116600;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 漿果研究所, 黑龍江 綏棱 152200)

檢測分析

沙棘果肉和種子發(fā)育過程中含油量及脂肪酸組成的對比分析

丁 健1，阮成江1，關(guān) 瑩2，單金友2

(1.資源植物研究所 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(大連民族大學(xué)), 遼寧 大連 116600;2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 漿果研究所, 黑龍江 綏棱 152200)

以2015年不同發(fā)育時(shí)期(6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日、8月19日、8月30日和9月10日)的沙棘品系“新俄3號”果實(shí)為材料，利用氯仿甲醇法測定含油量，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定脂肪酸組成，對比研究非種子組織(果肉)和種子油脂脂肪酸的變化規(guī)律。結(jié)果表明：除6月25日外，其他時(shí)期‘新俄3號’的干果肉含油量均高于種子；組織顏色顯著變化期間油脂迅速積累，但干果肉含油量增率大于種子；發(fā)育初期各脂肪酸在果肉和種子油脂間的含量差異很小，隨著果實(shí)的成熟，果肉油中高積累棕櫚酸和棕櫚油酸，而二者在種子油中的含量卻逐漸下降；種子油中高積累亞油酸和亞麻酸，而二者在果肉油中的含量卻相對很低；亞油酸與亞麻酸(種子)比值和單不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸(果肉和種子)比值均符合健康食用油的國際標(biāo)準(zhǔn)。

沙棘；果肉；種子；含油量；脂肪酸組成

沙棘(HippophaeL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬植物，多年生小喬木或灌木，其果實(shí)油脂中高積累多種人體必需脂肪酸(omega-3、omega-6和omega-7脂肪酸)[1]。沙棘種子和果肉是積累油脂的主要組織，但較低的含油量(種子為7%～11%，鮮果肉為1%～5%)制約了沙棘油的高效開發(fā)利用[2-4]。目前，對非種子組織(果肉)的油脂和脂肪酸合成積累模式研究較少，而它們在非種子組織和種子之間的分配規(guī)律也罕有報(bào)道。

在果肉中高積累棕櫚油酸(C16∶1n7，omega-7)的植物較少，棕櫚油酸常在魚和少數(shù)植物種子中積累。沙棘是我國唯一高積累棕櫚油酸的植物，其果油中C16∶1含量可達(dá)53%[5-6]。有研究表明棕櫚油酸在降脂、抗炎癥和胰島素敏感性方面作用明顯，能通過降低低密度脂蛋白膽固醇和提高高密度脂蛋白膽固醇來維護(hù)體內(nèi)甘油三酯水平[7]。沙棘種子油富含人體必需脂肪酸——亞油酸(C18∶2n6，omega-6)和亞麻酸(C18∶3n3，omega-3)，亞油酸在維護(hù)大腦功能、骨骼密度、體內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)等方面發(fā)揮重要作用，而亞麻酸具有預(yù)防和治療心腦血管疾病、關(guān)節(jié)炎、腫瘤和體內(nèi)炎癥等功效[1]。國際上食品、醫(yī)藥、保健品和化妝品等對沙棘油的需求每年超過3 000 t，但目前年產(chǎn)量少于1 800 t(98%產(chǎn)于我國)[3]。因此，分析沙棘油脂及其脂肪酸的合成、積累和分配規(guī)律，對高效開發(fā)利用沙棘油具有重要意義。

本研究以沙棘品系“新俄3號”果肉和種子為材料，分析它們在不同生長發(fā)育期間的油脂和脂肪酸的積累模式，揭示油脂和脂肪酸組成在果肉和種子之間的動態(tài)差異，為理解沙棘油脂和脂肪酸在果肉和種子中的合成、積累和分配機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蒙古沙棘亞種“新俄3號”，果實(shí)分別于2015年6月25日、7月6日、7月17日、7月28日、8月8日、8月19日、8月30日和9月10日采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所。完整的果實(shí)用錫紙包裹后置于液氮中速凍。樣品運(yùn)抵大連民族大學(xué)資源植物研究所，保存于-80℃冰箱備用。甲醇、正己烷和三氯甲烷為色譜純；氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鉀和無水硫酸鈉為分析純；三氟化硼-甲醇溶液和37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品。

Clarus680型氣相色譜及AxIONiQT型飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國PerkinElmer公司；BT48型冷凍干燥機(jī)，美國Millrock技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘果肉和種子含油量測定

采用氯仿甲醇法[2,4]測定含油量，冷凍干燥的樣品粉末轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，加入氯仿甲醇(體積比2∶1)旋渦混勻后超聲30 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一試管中，殘?jiān)寐确录状荚俅翁崛?，合并的上清液加入?/4體積的氯化鉀溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.88%)，收集下層液體至玻璃樣品瓶中，揮發(fā)至恒重。重復(fù)測定3次。含油量按下式計(jì)算。

含油量=(m1-m2)/m×100%

式中：m1為油脂和玻璃樣品瓶的質(zhì)量，g；m2為玻璃樣品瓶的質(zhì)量，g；m為干燥樣品粉末的質(zhì)量，g。

1.2.2 沙棘果肉和種子油脂脂肪酸組成分析

采用改進(jìn)的三氟化硼-甲醇法進(jìn)行甲酯化[8]，參考GB/T 17377—2008對脂肪酸組成進(jìn)行分析測定。

取干燥的樣品粉末于玻璃樣品瓶中，加入正己烷充分振蕩，混勻后加入氫氧化鉀-甲醇溶液，于60℃水浴30 min，冷卻后加入三氟化硼-甲醇溶液，再于60℃水浴30 min，冷卻后加入飽和氯化鈉溶液和正己烷，收集上清液用于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent DB-23(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230℃；載氣高純氦氣，載氣流速1 mL/min；自動進(jìn)樣器，進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1；柱箱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以15℃/min升至200℃，保持28 min；以10℃/min升至220℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊式離子源(EI)溫度230℃，傳輸線溫度215℃，檢測電壓1 700 V，溶劑延遲時(shí)間4.5 min，質(zhì)量掃描范圍(m/z)45～400 u。

脂肪酸的定性和定量：按照上述方法對37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，根據(jù)各脂肪酸甲酯的保留時(shí)間和NIST數(shù)據(jù)庫搜索到的m/z建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用eCipher軟件計(jì)算脂肪酸的峰面積，然后采用峰面積歸一化法進(jìn)行脂肪酸組成的定量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，采用Excel 2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果肉和種子含油量

不同植物、組織部位和發(fā)育時(shí)期的油脂積累模式差異明顯[9]。本研究觀察分析了沙棘結(jié)果初始期至成熟期(達(dá)77 d)的果肉和種子形態(tài)及含油量變化(見圖1)，獲得了生長周期最長的沙棘油脂積累模式。

注：*表示在P<0.05水平上差異顯著。下同。

由圖1可知，種子含油量在果實(shí)發(fā)育初期(6月25日—7月6日)有明顯下降過程，這與果實(shí)授粉后營養(yǎng)生長旺盛，且結(jié)構(gòu)未發(fā)育完全有關(guān)[10]。種子含油量在7月17日—7月28日期間增幅最大，種子顏色變化也最明顯；8月8日后種子含油量穩(wěn)定在14.2%左右，其油脂顏色呈亮黃色。沙棘種子的油脂積累模式與花生、芝麻和油菜相似[11-13]。

干果肉含油量一直呈上升趨勢(4.89%～40.59%)，7月17日—8月8日期間增幅最大，而且通過觀察發(fā)現(xiàn)果肉和果肉油的顏色變化也最明顯(由綠色轉(zhuǎn)為桔黃色)。6月25日—7月6日期間干果肉和種子含油量存在一個(gè)相同的時(shí)間點(diǎn)，7月6日后干果肉含油量增速逐漸加大，并顯著高于種子含油量?？梢?，果肉(由綠轉(zhuǎn)黃至桔黃色)和種子(由黃轉(zhuǎn)褐至黑色)顏色顯著變化期間(7月6日—8月8日)是油脂合成積累的重要時(shí)期，但果肉油的迅速積累期更長，含油量更高。

2.2 沙棘果肉和種子油脂脂肪酸組成

脂肪酸是油脂的重要組成部分，其不僅影響油脂的合成和積累，而且決定油脂的生理功能。沙棘品系“新俄3號”果肉(A)和種子(B)油脂在8月30日脂肪酸組成的氣相色譜圖見圖2。沙棘品系“新俄3號”果肉和種子生長發(fā)育期間油脂脂肪酸組成的變化見圖3。

由圖2可知，C16和C18脂肪酸是沙棘果肉和種子油中的主要脂肪酸。

由圖3可知，發(fā)育初期果肉油和種子油的各脂肪酸含量差異較小，6月25日的果肉油C16∶1n7、C18∶0和C18∶3n3含量與種子油非常相近；兩個(gè)組織的C18∶1n9含量在6月25日—7月17日期間相近；C18∶2n6含量在6月25日—7月6日期間幾乎相同，兩個(gè)組織顏色轉(zhuǎn)變期間各脂肪酸組成變化明顯，而后形成顯著差異。幾乎在整個(gè)發(fā)育期間，果肉油的C16∶0、C16∶1n7、飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量均高于種子油；而種子油的C18∶0、C18∶1n9、C18∶2n6、C18∶3n3、多不飽和脂肪酸(PUFA)和總不飽和脂肪酸(TUFA)含量均高于果肉油。

由圖3可知，果肉油的C16∶0(27.32%～45.16%)和C16∶1n7(0～31.96%)含量均呈上升趨勢；而種子油的C16∶0和C16∶1n7含量變化趨勢與果肉油相反，成熟種子油的C16∶0和C16∶1n7含量分別約為8%和0.4%。種子油中C18∶0和 C18∶1n9含量呈先上升后穩(wěn)定趨勢；而果肉油的C18∶0和C18∶1n9含量呈先上升后下降趨勢，7月17日達(dá)峰值。綜上表明，在沙棘果肉中存在相關(guān)調(diào)控位點(diǎn)限制了C16脂肪酸向C18脂肪酸的延伸，而促進(jìn)了C16∶0和C16∶1的合成積累[14]。C18∶1n7是沙棘油中的另一種omega-7脂肪酸，它是由C16∶1n7在酮酯酰-ACP合成酶Ⅱ(質(zhì)體中)或脂肪酸延伸酶1(細(xì)胞質(zhì)中)的催化下，增加2個(gè)碳原子而成[15]。7月17日后C18∶1n7含量穩(wěn)定，其在果肉油中的含量顯著高于種子油。果肉油的C18∶2n6和C18∶3n3含量一直呈下降趨勢，發(fā)育初期的含量分別為36.82%和24.02%，但成熟末期的含量分別僅為10.3%和0.18%。種子油的C18∶2n6和C18∶3n3含量分別在7月6日和6月25日后逐漸顯著高于果肉油，成熟期種子油的C18∶2n6和C18∶3n3含量分別約為41%和27%。綜上可見，沙棘果肉和種子油脂中不僅富含自然界稀有脂肪酸和人體必需脂肪酸，而且總不飽和脂肪酸含量分別高達(dá)50%和90%。

注：C16∶0，棕櫚酸；C16∶1n7，棕櫚油酸；C18∶0，硬脂酸；C18∶1n9，油酸；C18∶1n7，異油酸；C18∶2n6，亞油酸；C18∶3n3，亞麻酸。下同。

圖2 沙棘品系“新俄3號”果肉(A)和種子(B)油脂在8月30日脂肪酸組成的氣相色譜圖

注：SFA，飽和脂肪酸；MUFA，單不飽和脂肪酸；PUFA，多不飽和脂肪酸；TUFA，總不飽和脂肪酸。

圖3 沙棘品系“新俄3號”果肉和種子生長發(fā)育期間油脂脂肪酸組成的變化

2.3 食用油品質(zhì)相關(guān)的脂肪酸比例

沙棘品系“新俄3號”果肉和種子油脂脂肪酸比值的變化見表1。

表1 沙棘品系“新俄3號”果肉和種子油脂脂肪酸比值的變化

由表1可知，沙棘品系“新俄3號”成熟果肉油的MUFA與SFA比值約為1，而成熟種子油的MUFA與SFA比值低于2，均符合健康食用油的國際標(biāo)準(zhǔn)(MUFA 與SFA比值為1～1.6)[16]；尤其，沙棘種子油中有非常合理的C18∶2與C18∶3比值(0.96～1.68)[17]，常用來衡量食用油的品質(zhì)和保健價(jià)值。高C18∶2與C18∶3比值常與高患病率直接相關(guān)[18]，當(dāng)比值為2.5時(shí)，有助于抑制直腸癌細(xì)胞增殖；比值為2～3時(shí)，能有效抑制風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；比值為5時(shí)，有益于哮喘病患者；但比值達(dá)到10時(shí)，則對健康有不利影響[19]。沙棘種子油中較高的PUFA與SFA比值，表明沙棘種子中高積累人體必需的多不飽和脂肪酸。而果肉油中較低的PUFA與SFA比值和較高的C18∶2與C18∶3比值，與其PUFA(尤其C18∶3n3)含量較低有關(guān)，但花生油和葵花籽油的C18∶2與C18∶3比值分別可達(dá)411和744[20-21]。因此，在攝入高C18∶2與C18∶3比值食用油后，可合理攝入高C18∶3n3植物油，如牡丹籽油[22]、紫蘇油和亞麻籽油[23]等。

3 結(jié) 論

對8個(gè)時(shí)期的“新俄3號”果肉和種子含油量和油脂脂肪酸組成分析發(fā)現(xiàn)，果肉含油量一直呈上升趨勢(4.89%～40.59%)，種子油脂積累模式為先下降再上升至穩(wěn)定(14.2%)，7月6日后干果肉含油量一直顯著高于種子。發(fā)育初期的沙棘果肉和種子油的各脂肪酸含量差異很??；隨著果實(shí)發(fā)育，果肉油中高積累C16∶0和C16∶1n7，C18∶2n6和C18∶3n3呈下降趨勢；相反，種子油中高積累C18∶2n6和C18∶3n3，C16∶0和C16∶1n呈下降趨勢。發(fā)現(xiàn)顏色顯著變化期間是油脂和脂肪酸合成、積累和分配的重要時(shí)期。本研究為理解油脂、C16和C18脂肪酸在非種子組織(果肉)和種子間的合成、積累和分配機(jī)制提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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Comparison of oil contents and fatty acid compositions between developing sea buckthorn pulp and seed

DING Jian1, RUAN Chengjiang1, GUAN Ying2, SHAN Jinyou2

(1.Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization (Dalian Minzu University), Ministry f Education, Institute of Plant Resources, Dalian 116600, Liaoning, China; 2.Institute of Berries,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Suiling 152200, Heilongjiang, China)

The developing sea buckthorn pulps and seeds of the line ‘Xin’e 3’ were harvested as experimental materials on June 25, July 6, July 17, July 28, August 8, August 19, August 30 and September 10 in 2015. The oil content was determined by the method of chloroform methanol and the fatty acid composition was determined by GC-MS method. The accumulation and distribution patterns of oil and fatty acids between non-seed tissue (pulp) and seed were compared. The results showed that the oil contents in the developing dry pulps of ‘Xin’e 3’ were higher than that in seeds except for June 25. The rapid accumulations of oil occurred during the period of color transformation of tissue, and the increasing rates of oil content in dry pulps were higher than that in seeds. The content of each fatty acid between pulp oils and seed oils had minor differences in the early stage of development. The palmitic acid and palmitoleic acid in pulp oils were highly accumulated along with the maturation of fruit,while they decreased gradually in seed oils. The linoleic acid and linolenic acid were highly accumulated in seed oils, however, the contents of them in pulp oils were very low. The ratios of linoleic acid to linolenic acid in seeds and monounsaturated fatty acid to saturated fatty acid in seeds and pulps met the international standards of healthy edible oil.

sea buckthorn; pulp; seed; oil content; fatty acid composition

2016-09-13；

2017-01-13

國家自然科學(xué)基金(31570681)

丁 健(1983)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯臣N質(zhì)開發(fā)利用與遺傳育種(E-mail)mervyntin2901@aliyun.com。

阮成江，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)ruan@dlun.edu.cn。

TS225.1; TQ646

A

1003-7969(2017)05-0140-05