陸繼源，王小三，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

油脂深加工

響應(yīng)面優(yōu)化酶法酯交換催化合成中長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)甘三酯

陸繼源，王小三，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

采用響應(yīng)面法對(duì)脂肪酶Lipozyme 435在無溶劑體系中催化中鏈甘三酯(MCT)和大豆油酯交換反應(yīng)合成中長(zhǎng)鏈甘三酯的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,并采用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜在正離子模式下對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的甘三酯構(gòu)型進(jìn)行分析。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)中長(zhǎng)鏈甘三酯含量具有極顯著性影響(P<0.01)。最佳反應(yīng)條件為大豆油與MCT質(zhì)量比60∶40，反應(yīng)時(shí)間4.36 h，反應(yīng)溫度89 ℃，加酶量(以底物質(zhì)量計(jì))5.5%。在此條件下，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量達(dá)到84.15%。CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy和LOCa為反應(yīng)產(chǎn)物的主要甘三酯構(gòu)型。

中長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)甘三酯；Lipozyme 435；酯交換；響應(yīng)面；甘三酯構(gòu)型

中長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)甘油三酯(MLCT)是指一個(gè)甘油骨架同時(shí)含有中碳鏈脂肪酸和長(zhǎng)碳鏈脂肪酸的甘三酯。MLCT具有快速供能，減少脂肪積累的營(yíng)養(yǎng)代謝優(yōu)勢(shì)[1-3]，同時(shí)具有煙點(diǎn)低，不易起泡的優(yōu)良煎炸特性[4-5]，在食品、醫(yī)藥行業(yè)需求與日俱增，市場(chǎng)潛力巨大。

目前，國(guó)內(nèi)外合成MLCT的方法主要有酶法和化學(xué)法。與化學(xué)法相比，酶法催化反應(yīng)條件溫和、節(jié)省能源、脂肪酶專一性強(qiáng)、副反應(yīng)少、產(chǎn)品容易回收、對(duì)環(huán)境沒有污染，所得產(chǎn)物的安全性更高[6]。近年來學(xué)者們對(duì)于酶法制備MLCT的研究重點(diǎn)在酸解和酯化上，而對(duì)酶法酯交換合成的研究報(bào)道很少，多集中在新資源油料上。Zhao等[7]利用脂肪酶Lipozyme RM IM催化香樟籽油和山茶油酯交換反應(yīng)合成MLCT含量55.81%的結(jié)構(gòu)脂。Khodadadi等[8]研究了有機(jī)溶劑體系下，Novozym 435催化亞麻籽油和辛酸甘油三酯的酯交換合成工藝，合成了MLCT含量46.21%的產(chǎn)品。

本研究以大豆油和中鏈甘三酯(MCT)為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化脂肪酶Lipozyme 435催化合成MLCT的反應(yīng)條件，旨在減少酶的用量，縮短反應(yīng)時(shí)間，為酶法制備MLCT的工業(yè)化推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆油：中糧東海糧油(張家港)有限公司；中鏈甘三酯：浙江建德千島化工有限公司；Lipozyme 435：諾維信生物技術(shù)有限公司；正己烷、甲醇、異丙醇、乙腈，均為色譜純；無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、Tris緩沖液、膽酸鈉、鹽酸、乙醚，均為分析純。

Agilent 7820A氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；ELSD 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Grace公司；Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀，沃特世科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MLCT的催化合成

將大豆油和MCT按一定質(zhì)量比混合，加入到密閉的容器中，加入脂肪酶Lipozyme 435，在一定溫度下，磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后，停止加熱，反應(yīng)物轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min 離心5 min，將脂肪酶和油分離，得到含有中長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)甘三酯的產(chǎn)物。

1.2.2 分析方法

產(chǎn)物脂肪酸組成的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[9]。

產(chǎn)物甘三酯結(jié)構(gòu)測(cè)定采用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜。超高壓液相色譜條件：色譜柱為Thermo Hypersil Gold柱(2.1 mm×100 mm,粒徑1.9 μm)；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇-水(體積比19∶19∶2)，流動(dòng)相B為異丙醇(流動(dòng)相A、B中均添加5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)；柱溫35℃；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：ESI電離源，正離子模式；毛細(xì)管電壓3.1 kV，錐孔電壓40.0 V，離子源溫度120℃，脫溶劑溫度450℃；錐孔氣流速80.0 L/h，脫溶劑氣流速600 L/h；掃描方式MSE，一級(jí)碰撞電壓6 V，二級(jí)碰撞電壓20～40 V；掃描間隔時(shí)間0.3 s；掃描范圍100～1 200；采集時(shí)間15 min，碰撞氣體為氬氣。

表1 超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜洗脫條件

產(chǎn)物中MLCT含量的測(cè)定：參考文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)Central Composite Design原理，在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以影響MLCT含量的3個(gè)重要因素反應(yīng)時(shí)間(A)、反應(yīng)溫度(B)和加酶量(以底物質(zhì)量計(jì))(C)為自變量，以產(chǎn)物中MLCT含量(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。因素水平見表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 因素水平

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Design Expert軟件進(jìn)行回歸擬合，并進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化后, 獲得回歸方程：Y=58.03+12.92A+34.47B+2.99C+8.51AB+0.038AC+3.258E-003BC-5.13A2-18.75B2-2.14C2。

回歸方程方差分析見表4。

表4 回歸方程方差分析

2.2 響應(yīng)面分析

圖1為4%加酶量的反應(yīng)條件下，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)中長(zhǎng)鏈甘三酯含量的影響。從圖1可以看出，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量的最大值出現(xiàn)在90～105℃和1.5～5.5 h的范圍內(nèi)。在較高溫度下，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)升到極大值后出現(xiàn)下降趨勢(shì)；在反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)的情況下，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量隨反應(yīng)溫度的變化也呈現(xiàn)類似的趨勢(shì)，這主要與酶的催化活性有關(guān)。反應(yīng)溫度的控制非常重要，由于酶促催化反應(yīng)是一個(gè)熱動(dòng)力學(xué)過程，影響著酶的催化活性、底物的溶解狀態(tài)及黏度、底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)速度等[11]。反應(yīng)溫度升高，可使酯交換程度和反應(yīng)速度提高。但反應(yīng)溫度過高時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致酶變性失活。

圖2為反應(yīng)時(shí)間3 h條件下，反應(yīng)溫度和加酶量交互作用對(duì)中長(zhǎng)鏈甘三酯含量的影響。從圖2可以看出，中長(zhǎng)鏈甘三酯最高含量出現(xiàn)在90～105℃和2%～7%加酶量的范圍內(nèi)。隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量上升。這主要是由于反應(yīng)溫度升高導(dǎo)致脂肪酶的活性升高，脂肪酶Lipozyme 435具有高的熱穩(wěn)定性，適合在90℃以上的高溫體系下催化酯交換反應(yīng)。反應(yīng)速度與加酶量符合動(dòng)力學(xué)關(guān)系[12]；當(dāng)加酶量增加時(shí)，反應(yīng)速度亦隨之增大；當(dāng)加酶量增大到一定程度，底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力的影響已開始大于酶催化反應(yīng)速度的影響，其反應(yīng)速度的增量減少，酶的催化效率降低。

圖3為反應(yīng)溫度70℃條件下，加酶量和反應(yīng)時(shí)間交互作用對(duì)中長(zhǎng)鏈甘三酯含量的影響。從圖3可以看出，較高的加酶量和較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間得到較高的中長(zhǎng)鏈甘三酯含量。加酶量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)中長(zhǎng)鏈甘三酯含量的交互作用不顯著，反應(yīng)時(shí)間影響的顯著性要高于加酶量?？傮w來看，在加酶量為3%～7%時(shí)，相同的反應(yīng)時(shí)間條件下中長(zhǎng)鏈甘三酯含量較高。

圖1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間交互影響

圖2 反應(yīng)溫度和加酶量交互影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間和加酶量交互影響

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化及模型驗(yàn)證

利用Design Expert軟件對(duì)酶催化MCT和大豆油酯交換反應(yīng)合成中長(zhǎng)鏈甘三酯的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到最佳的反應(yīng)條件為：大豆油與MCT質(zhì)量比60∶40，反應(yīng)時(shí)間4.36 h，反應(yīng)溫度88.8℃，加酶量5.5%(以底物質(zhì)量計(jì))。考慮到實(shí)際操作的局限性，將工藝參數(shù)中的反應(yīng)溫度調(diào)整為89℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，中長(zhǎng)鏈甘三酯含量分別為84.78%、83.96%和83.71%，平均含量為84.15%，模型預(yù)測(cè)值為84.36%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值相近，說明該響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)是有效的。

2.4 產(chǎn)物脂肪酸組成分析

表5為酯交換產(chǎn)物及原料物理混合油的脂肪酸組成。其中中碳鏈脂肪酸C8∶0、C10∶0來自原料MCT，其余脂肪酸來自原料大豆油。酯交換產(chǎn)物的具體反應(yīng)條件為上述最佳反應(yīng)條件。

表5 原料物理混合油及酯交換產(chǎn)物的脂肪酸組成 %

從表5可以看出，酯交換反應(yīng)前后的總脂肪酸組成無顯著性差異，主要是酯交換反應(yīng)過程中，脂肪酸在甘三酯分子內(nèi)和分子間碳鏈骨架上發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此總脂肪酸組成基本不發(fā)生變化。但是脂肪酸在甘三酯碳鏈骨架上的位置重新分布會(huì)造成物理混合油和酯交換產(chǎn)物不同位置脂肪酸組成的顯著變化。酯交換反應(yīng)后，sn-2位上中碳鏈脂肪酸(MCFA)含量下降，而不飽和脂肪酸(UFA)含量則提高到 65.16%。sn-2位上的不飽和脂肪酸能夠在體內(nèi)被快速地消化和吸收，為人體提供必需脂肪酸，有益人體健康。同時(shí)sn-1,3位上的MCFA可以實(shí)現(xiàn)快速供能和降低體內(nèi)脂肪積累的生理功能。因此，酯交換合成的MLCT結(jié)構(gòu)脂能夠提供食用油的基本營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)代謝優(yōu)勢(shì)，在食用領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

2.5 產(chǎn)物甘三酯組成

采用常規(guī)HPLC-ELSD法對(duì)原料物理混合油和自制中長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)甘三酯的甘三酯組成進(jìn)行初步分析，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，16 min之前出峰為MCT，32 min 之后出峰為長(zhǎng)鏈甘三酯，中間峰為MLCT。由圖4a可知，原料物理混合油中不含MLCT，圖4b顯示酯交換后有大量MLCT生成。

HPLC不能準(zhǔn)確提供甘三酯構(gòu)型信息，因此進(jìn)一步采用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOFMS)在正離子模式下分析了酯交換產(chǎn)物的甘三酯構(gòu)型，結(jié)果見表6。

注：Cy, C8∶0; Ca, C10∶0; P, C16∶0; S, C18∶0; O, C18∶1; L, C18∶2; Ln, C18∶3。下同。

圖4 原料物理混合油(a)和酯交換產(chǎn)物(b)

續(xù)表6

TAG[M+NH4]+ [DAG]+碎片離子CENsCyCaLn650.61489.50461.46355.3630CyCyL624.61463.47327.3230CyCyP600.61439.48327.3332CyCyS627.61465.49327.3234CyCaL652.61491.48463.44355.3332CaCaLn678.61489.51383.432CaCyP628.61467.52439.48355.3634CaCyO654.61493.53465.49355.3634CaCyS656.71495.52467.49355.3636LnLnCy756.72595.59461.4732LCaCa680.71491.52383.3934LLnCy758.72597.63463.47461.4734CaCaP656.71467.51383.3936CaCaO682.71493.54383.3936CyLL760.72599.64463.4836LnPCy734.72573.61461.46439.4836LnLCa786.82597.62491.52489.4936SCaCa684.71495.54383.3938LPCy736.72575.64463.48439.4738LOCy762.82601.64465.49463.4838LLCa788.82599.64491.5238PPCy712.72551.61439.4840OPCy738.82577.64465.49439.4740OOCy764.82603.67465.540LOCa790.82601.63493.54491.5240PPCa740.82551.61467.5142OPCa766.82577.64493.54467.5142LnLnO894.94599.65597.6244OOCa792.83603.67493.5442LLL896.94599.6442LLnP870.93597.62575.62573.6242SPCa768.82579.66495.54467.5144SOCa794.83605.68495.55493.5344LLO898.94601.65599.6344LLP872.93599.65575.6344OOL900.94601.64603.6746LOP874.93601.64577.66575.6146LPP848.93575.62551.6146OOO920.94603.6748OOP876.93603.67577.6548OPP850.93577.66551.6248SOP878.93605.66579.65577.6450

從表6可以看出，MLCT結(jié)構(gòu)脂中共檢測(cè)到45種構(gòu)型的甘三酯(不包含異構(gòu)體)，MCT的主要甘三酯構(gòu)型為CyCyCy、CyCyCa和CyCaCa，大豆油則為L(zhǎng)LL、LLnP、LLP、LLO和LOP。結(jié)合圖4可知，經(jīng)過酯交換反應(yīng)，產(chǎn)物中甘三酯的種類發(fā)生明顯變化，CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy和LOCa成為主要甘三酯構(gòu)型，而原料物理混合油中的主要甘三酯LLL、LLO、LLP、CyCyCy和CyCyCa的含量則大幅降低。

3 結(jié) 論

響應(yīng)面法優(yōu)化得到Lipozyme 435催化酯交換合成中長(zhǎng)鏈甘三酯的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)時(shí)間4.36 h，反應(yīng)溫度89℃，加酶量5.5%，大豆油與MCT質(zhì)量比60∶40。最佳條件下中長(zhǎng)鏈甘三酯平均含量為84.15%。采用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析了酯交換產(chǎn)物的甘三酯構(gòu)型，結(jié)果表明CyCyL、CyCyLn、LOCy、LPCy、OOCy 和LOCa為其主要甘三酯構(gòu)型。

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Optimization of Lipozyme 435-catalyzed synthesis of medium-and long-chain triglycerides using response surface methodology

LU Jiyuan, WANG Xiaosan, JIN Qingzhe, WANG Xingguo

(Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu，China)

The synthesis conditions of medium- and long-chain triglycerides by Lipozyme 435-catalyzed interesterification of soybean oil and medium-chain triglycerides in a solvent-free system was optimized by response surface methodology. The triglycerides structure of the product was analyzed by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) coupled with quadrupole time of flight mass spectrometry under positive ion model. The results showed that reaction temperature and reaction time had extremely significant influence on medium-and long-chain triglycerides content. The optimal reaction conditions were obtained as follows： mass ratio of soybean oil to medium-chain triglycerides 60∶40, reaction time 4.36 h, reaction temperature 89℃, and enzyme dosage 5.5%(based on the mass of substrate). Under these conditions, medium- and long-chain triglycerides content was 84.15%. The main triglycerides in the products were CyCyL, CyCyLn, LOCy, LPCy, OOCy and LOCa.

medium-and long-chain triglycerides; Lipozyme 435; interesterification; response surface methodology; triglycerides structure

2016-09-04；

2017-01-17

江蘇省自然科學(xué)基金——青年基金項(xiàng)目(BK20150137);政策引導(dǎo)類計(jì)劃(產(chǎn)學(xué)研合作)——前瞻性聯(lián)合研究項(xiàng)目(BY2016022-33)

陸繼源(1989)，男，在讀碩士，研究方向?yàn)楣δ苄杂椭?E-mail)lujiyuan@live.cn。

王小三，副教授，博士(E-mail)wxstongxue@163.com。

TS225.6;TQ641

A

1003-7969(2017)05-0015-05