印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞增殖和凋亡的影響

邵雪花， 賴 多， 毛根林， 徐漢虹

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞增殖和凋亡的影響

邵雪花1,2， 賴 多2， 毛根林1， 徐漢虹1

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

【目的】探討印楝素對小菜蛾P(guān)lutellaxyllostella胚胎細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的機(jī)制。【方法】將體外培養(yǎng)的小菜蛾胚胎細(xì)胞分為印楝素處理組和未處理組，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖的抑制率，激光共聚焦鏡檢PI染色后的細(xì)胞死亡和DAPI染色后的凋亡小體，通過Western-blotting檢測各組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)情況以及通路蛋白Akt的磷酸化水平?！窘Y(jié)果】印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性，24 h的IC50為4.4 μg·mL-1。印楝素處理后的細(xì)胞經(jīng)PI染色后能明顯觀察到死亡細(xì)胞，DAPI染色后可見凋亡小體； Caspase-3蛋白發(fā)生剪切，并且抑制Akt的磷酸化水平。【結(jié)論】印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并通過抑制Akt信號通路的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生依賴于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。

印楝素； 小菜蛾; 胚胎細(xì)胞； 凋亡； 增殖

細(xì)胞凋亡(Apoptosis) 是一種特殊的細(xì)胞死亡方式，又稱程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death, PCD)，指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動死亡過程[1]。在形態(tài)學(xué)方面，細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)聚集、核酸內(nèi)切酶活化和出現(xiàn)凋亡小體等特征。發(fā)生過程包括凋亡的起始、凋亡小體形成和凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬并消化。通常情況下，細(xì)胞凋亡是為了維持各器官的穩(wěn)定性，受機(jī)體內(nèi)調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時(shí)，可引起細(xì)胞過度增殖或過度凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和相關(guān)疾病的發(fā)生[2-3]。印楝素作為植物源農(nóng)藥的典型代表，被認(rèn)為是最優(yōu)秀的生物農(nóng)藥之一，最適合于商品化開發(fā)的植物源殺蟲劑[4-6]。天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué))最早在國內(nèi)開展了印楝素生物活性及作用機(jī)理的研究，經(jīng)過幾代人的努力取得了一定進(jìn)展。在細(xì)胞水平陸續(xù)證實(shí)了印楝素能夠抑制粉紋夜蛾CabbagelooperHi-5、斜紋夜蛾SpodopteralituraSL-1、草地貪夜蛾SpdopterafrugiperdaSf9細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞骨架正常功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-11]，并于2016年證實(shí)了印楝素A可通過PI3K/Akt/Tor信號通路誘導(dǎo)斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[12]。小菜蛾P(guān)lutellaxyllostella是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲，也是對印楝素最為敏感的害蟲之一，但是，印楝素在小菜蛾細(xì)胞方面的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道，其分子靶標(biāo)至今不明[13-14]，這嚴(yán)重地制約了印楝素的科學(xué)使用。本文以小菜蛾胚胎細(xì)胞為研究對象，探討印楝素脅迫作用下對細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的機(jī)制，以期獲得印楝素抑制昆蟲細(xì)胞增殖的分子機(jī)理，為印楝素的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

印楝素，由天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%；小菜蛾胚胎細(xì)胞系,由福建農(nóng)林大學(xué)饋贈。Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8試劑盒)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、PI、DAPI、β-Tubulin鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 等購自碧云天生物技術(shù)公司；Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；p-Drosophila Akt (Ser505) 抗體和裂解Caspase-3 (Asp175) 抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8方法檢測細(xì)胞毒性 CCK-8試劑盒是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測的試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜化合物(Formazan)。細(xì)胞增殖越多越快，顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

于96孔板中加入對數(shù)生長期的小菜蛾胚胎細(xì)胞100 μL(細(xì)胞密度為5 000孔-1)，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基，加入含有印楝素分別為0.312 5、 0.625、 1.25、 2.5、 5、10、 20和40 μg·mL-1細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，對照含有φ為0.1% DMSO的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，空白對照的孔中加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，在450 nm測定光密度。

1.2.2 PI和DAPI染色鏡檢 在激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中加入1 mL含小菜蛾胚胎細(xì)胞的Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基和φ為10%胎牛血清培養(yǎng)細(xì)胞，48 h后棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度印楝素的細(xì)胞培養(yǎng)液，對照加入φ為0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。24 h后，用無菌的PBS洗滌3次，每次10 min；加入1 mL 3.7 g·L-1甲醛固定細(xì)胞5 min，去除甲醛，PBS洗滌3次，每次10 min；然后分別加入少量 PI和DAPI染色液，覆蓋住樣品即可，室溫放置3～5 min。染色結(jié)束后用PBS清洗3次，每次10 min；使用激光共聚焦顯微鏡檢測死亡細(xì)胞和凋亡小體，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 Western-blotting分析 在六孔板中每孔加入1 mL含小菜蛾胚胎細(xì)胞的昆蟲培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度印楝素的細(xì)胞培養(yǎng)液，對照加入含φ為0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。24 h后收集細(xì)胞，加入150～250 μL裂解液RIPA(在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L-1)，充分裂解后，10 000～14 000 r·min-1離心3～5 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量，具體步驟參照試劑盒說明書。定量后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用一抗4 ℃孵育過夜，緩慢搖動；洗膜后加入體積比1∶1 000稀釋度的辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，室溫孵育2 h；將膜用TBST洗滌3次，每次10 min。最后加入ECL發(fā)光液，利用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯色。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS19.0單向方差分析(SPSS, Chicago, USA)，比較試驗(yàn)組與對照組平均數(shù)之間的差異，判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞毒力的影響

利用CCK-8法檢測印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞的抑制率，從結(jié)果(圖1)中可以看出，印楝素在較低濃度(0.625 μg·mL-1)時(shí)對小菜蛾胚胎細(xì)胞就表現(xiàn)出明顯的抑制作用，處理濃度大于5 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞抑制率高于50%，細(xì)胞抑制率隨印楝素處理濃度增加呈上升趨勢。印楝素處理小菜蛾胚胎細(xì)胞24 h后的抑制中濃度為4.4 μg·mL-1。

圖1 印楝素處理小菜蛾胚胎細(xì)胞24 h的細(xì)胞抑制率

Fig.1 The inhibitory rate of azadirachtin onPlutellaxyllostellaembryonic cells in 24 h after treatment

2.2 PI熒光檢測死亡細(xì)胞

熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜對細(xì)胞核染色。將不同濃度的印楝素處理細(xì)胞24 h后，利用激光共聚焦在激發(fā)波長為535 nm處進(jìn)行檢測并拍照。結(jié)果(圖2)表明，未經(jīng)印楝素處理的細(xì)胞，由于生理狀態(tài)下的正常損傷也有微量的細(xì)胞膜破損，PI染色后出現(xiàn)少量紅色熒光；當(dāng)1.25 μg·mL-1印楝素處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，出現(xiàn)了大量的紅色熒光細(xì)胞。經(jīng)Photoshop取色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果(圖3)表明，熒光強(qiáng)度隨印楝素處理濃度的增加而增強(qiáng)。

A:未經(jīng)處理的正常細(xì)胞(CK)，B、C、D分別為:1.25、 2.5、 5 μg·mL-1印楝素處理24 h；箭頭所指為死亡細(xì)胞。

圖2 印楝素處理小菜蛾胚胎細(xì)胞后的PI染色鏡檢結(jié)果

Fig.2 Microscopic examination ofPlutellaxyllostellaembryonic cells stained with PI after treatment of azadirachtin

圖3 不同濃度印楝素處理PI染色的細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)百分比(PI)

Fig.3 The percentage of PI staining cells in total cells after treated with different concentrations of azadirachtin

2.3 DAPI染色鏡檢凋亡小體

DAPI是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光。細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征之一是細(xì)胞核固縮，在局部區(qū)域發(fā)生核碎裂出現(xiàn)凋亡小體，通過DAPI染色在激光共聚焦顯微鏡下能夠?qū)⒅旅軡馊镜牡蛲鲂◇w與正常細(xì)胞核區(qū)別開，這一染色鏡檢技術(shù)已用于昆蟲細(xì)胞凋亡的檢測[15-16]。用不同濃度印楝素處理小菜蛾胚胎細(xì)胞24 h后對誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色鏡檢，結(jié)果見圖4和圖5。在各組細(xì)胞中均出現(xiàn)核碎裂引起的凋亡小體。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，印楝素處理后24 h細(xì)胞中發(fā)生的凋亡小體率與處理濃度呈正相關(guān)。這一結(jié)果顯示印楝素具有誘導(dǎo)小菜蛾胚胎的趨勢，且在24 h內(nèi)具有濃度依賴性。

A:未經(jīng)處理的正常細(xì)胞(CK)，B、C、D、E、F分別為: 0.625、1.25、2.5、5、10 μg·mL-1印楝素處理24 h；箭頭表示細(xì)胞中被DAPI染色的凋亡小體。

圖4 印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞的凋亡小體
Fig.4 Apototic bodies ofPlutellaxyllostellaembryonic cells induced by azadirachtin

圖5 凋亡小體發(fā)生率 (統(tǒng)計(jì)樣本中出現(xiàn)凋亡小體的點(diǎn)數(shù)與細(xì)胞總數(shù)之比，DAPI)

Fig.5 Incidence rate of apoptotic bodies (percentage of apoptotic bodies in total cells，DAPI)

2.4 印楝素誘導(dǎo)細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子(Key executioner)之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白，例如PARP。Caspase-3的激活需要將沒有活性的全長Caspase-3(35 000)在Asp 28和Ser 29之間以及Asp 175和Ser 176之間進(jìn)行剪切，產(chǎn)生有活性的肽段。通過Western-blotting檢測裂解Caspase-3的表達(dá)水平，結(jié)果(圖6)顯示，經(jīng)印楝素處理后出現(xiàn)明顯雜交信號帶。說明印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞產(chǎn)生依賴于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。

CK:未經(jīng)處理的正常細(xì)胞， A、B、C、D分別為:1.25、2.5、5、10 μg·mL-1印楝素處理24 h。

圖6 Western-blotting檢測印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞中裂解Caspase-3表達(dá)

Fig.6 Western-blotting results of cleaved Caspase-3 levels inPlutellaxyllostellaembryonic cells induced by azadirachtin

2.5 Akt信號通路在印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞凋亡中的作用

PI3K/Akt/Tor信號通路的主要成員有 PI3K、Akt、 Tor、p70S6K1、PTEN 等。p-Akt是體內(nèi)重要的磷酸化酶，下游的作用底物繁多，可以通過磷酸化直接或間接影響(激活或抑制)下游 Tor、Bcl-2、GSK、Caspase、Tuberin、Foxo 家族等，進(jìn)而發(fā)揮其廣泛而復(fù)雜的生理作用。圖7的結(jié)果顯示，印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞24 h后，p-Akt蛋白表達(dá)量與對照相比出現(xiàn)了明顯的抑制。表明印楝素可通過抑制Akt信號通路的活化誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。

CK:未經(jīng)處理的正常細(xì)胞， A、B、C分別為:1.25、2.5、5 μg·mL-1印楝素處理24 h。

圖7 印楝素對Akt信號通路的影響
Fig.7 Effect of azadirachtin on Akt signal pathway

3 討論與結(jié)論

印楝素作為植物源農(nóng)藥的典型代表，對昆蟲的生長發(fā)育表現(xiàn)出明顯的抑制作用。早在1993 年，Rembold 和Annadurai 曾報(bào)道印楝素可影響草地貪夜蛾Sf9 卵巢細(xì)胞的增殖和蛋白合成。大量研究表明，印楝素可以導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞的增殖抑制，例如粉紋夜蛾Hi-5、斜紋夜蛾SL-1、草地貪夜蛾Sf9 等[7-12]。本文采用CCK-8方法證實(shí)了印楝素可抑制小菜蛾胚胎細(xì)胞的增殖。PI熒光探針可以作為晚期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞的指示劑，不同濃度的印楝素處理細(xì)胞24 h后，經(jīng)PI染色后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨印楝素處理濃度的增加而增強(qiáng)。

早期研究表明，印楝素可以誘導(dǎo)P53蛋白參與的細(xì)胞周期阻滯和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10]。在草地夜蛾Sf9細(xì)胞中印楝素可通過誘導(dǎo)溶酶體釋放組織蛋白酶從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。本文通過DAPI染色鏡檢凋亡小體，研究了印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞的凋亡發(fā)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡隨印楝素處理濃度增加而增強(qiáng)。Caspase-3蛋白是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，Caspase-3的激活需要將沒有活性的全長Caspase-3在Asp 28和Ser 29之間以及Asp 175和Ser 176之間進(jìn)行剪切，產(chǎn)生有活性的17 000肽段[17]。Caspase-3的激活常被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)。在本文中可以清晰地觀察到剪切型Caspase-3，表明印楝素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是依賴于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。

Akt蛋白具有絲-蘇氨酸激酶活性，參與細(xì)胞周期調(diào)控等重要作用。Akt可使Caspase-9的Ser 196位點(diǎn)磷酸化而失活、阻止線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[18-22]。Shao等[12]前期研究證實(shí)了印楝素A可通過抑制p-Akt而誘導(dǎo)斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞發(fā)生自噬。本文研究發(fā)現(xiàn)印楝素誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞24 h后，p-Akt蛋白表達(dá)量與對照相比出現(xiàn)了明顯的抑制。表明印楝素可通過抑制Akt信號通路的活化誘導(dǎo)小菜蛾胚胎細(xì)胞凋亡。

本文以小菜蛾胚胎細(xì)胞為研究對象，探討了印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并通過抑制Akt信號通路的活化誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生依賴于Caspase-3的Ⅰ型凋亡，揭示了印楝素抑制小菜蛾胚胎細(xì)胞增殖的分子機(jī)理，為印楝素的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

[1] 張曉暉, 姚天明, 黃高昇, 等. 細(xì)胞凋亡的最新研究進(jìn)展[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 23(12): 42- 44.

[2] NEZHA F, COHEN C, RAHAMAN J, et al. Comparative immunohistochemical studies of bcl-2 and P53 proteins in benign and malignant ovarian endometriotic cysts[J]. Cancer, 2002, 94(11): 2935-2940.

[3] NASU K, NISHIDA M, KAWANO Y, et al. Aberrant expression of apoptosis-related molecules in endometriosis: A possible mechanism underlying the pathogenesis of endometriosis[J]. Rerrod Sci, 2011, 18(3): 206-218.

[4] IMMARAJU J A. The commercial use of azadirachtin and its integration into viable pest control programmes[J]. Pestic Sci, 2015, 54(3): 285-289.

[5] VASSILIOU V A. Botanical insecticides in controlling Kelly’s citrus thrips (Thysanoptera: Thripidae) on organic grapefruits[J]. J Econ Entomol, 2011, 104(6): 1979-1985.

[6] SRIVASTAVA S, SRIVASTAVA A K.Invitroazadirachtin production by hairy root cultivation of azadirachta indica in nutrient mist bioreactor[J]. Appl Biochem Biotech, 2012, 166(2): 365-378.

[7] 李文歐, 徐漢虹, 張志祥, 等. 印楝素對粉紋夜蛾Hi-5細(xì)胞的毒性機(jī)理[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 51(8): 824-829.

[8] 鐘國華, 水克娟, 呂朝軍, 等. 印楝素對SL1的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用[J]. 昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 51(6): 618-627.

[9] 程杏安, 黃勁飛, 胡美英, 等. 印楝素誘導(dǎo)Sf9細(xì)胞凋亡的顯微和超微形態(tài)變化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(4): 52-58.

[10]HUANG J F, SHUI K J, LI H Y, et al. Antiproliferative effect of azadirachtin onSpodopteralituraSl-1 cell line through cell cycle arrest and apoptosis induced by up-regulation of p53[J]. Pestic Biochem Phys, 2011, 99(1): 16-24.

[11]WANG Z, CHENG X G, MENG Q Q, et al. Azadirachtin-induced apoptosis involves lysosomal membrane permeabilization and cathepsin L release inSpodopterafrugiperdaSf9 cells[J]. Int J Biochem Cell B, 2015, 64: 126-135.

[12]SHAO X H, LAI D, ZHANG L, et al. Induction of autophagy and apoptosisviaPI3K/AKT/TOR pathways by azadirachtin A inSpodopteralituracells[J]. Sci Rep-UK, 2016, 6: 35482.

[13]FISHEL F M. IRAC’s insecticide mode of action classification[M]. Florida: Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2008: 1-5.

[14]WANG H, LAI D, YUAN M, et al. Growth inhibition and differences in protein profiles in azadirachtin-treatedDrosophilalarvae[J]. Electrophoresis, 2014, 35(8): 1122-1129.

[15]WEI W, GAI Z, AI H, et al. Baculovirus infection triggers a shift from amino acid starvation-induced autophagy to apoptosis[J]. PLoS One, 2012, 7(5): e37457.

[16]WU F, LI Y, WANG F, et al. Differential function of the two Atg4 homologues in the aggrephagy pathway inCaenorhabditiselegans[J]. J Biol Chem, 2012, 287(35): 29457-29467.

[17]李小明, 孫志賢. 細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白酶Caspase-3[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 1999, 1: 6-9.

[18]ROSEN N, SHE Q B. Akt and cancer is it all mTOR?[J]. Cancer Cell, 2006, 10(4): 254-256.

[19]XIN M G, DENG X M. Nicotine inactivation of the proapoptotic function of bax through phosphorylation[J]. J Biol Chem, 2005, 280(11): 10781-10789.

[20]SONG G, OUYANG G L, BAO S D. The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival[J]. J Cell Mol Med, 2005, 9(1): 59-71.

[21]GIBSON E M, HENSON K S, HANEY N, et al. Epidermal growth factor protects epithelial-derived cells from tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis by inhibiting cytochromecrelease[J]. Cancer Res, 2002, 62(2): 488- 496.

[22]KIM E C, YUN B S, RYOO I J, et al. Complestatin prevents apoptotic cell death: Inhibition of a mitochondrial caspase pathway through AKT/PKB activation[J]. Biochem Bioph Res Co, 2004, 313(1): 193-204.

【責(zé)任編輯 周志紅】

Effects of azadirachtin on proliferation and apoptosis of Plutella xyllostella embryonic cells

SHAO Xuehua1,2, LAI Duo2, MAO Genlin1, XU Hanhong1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/ College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510640, China)

【Objective】 To investigate the effect and mechanism of azadirachtin on proliferation and apoptosis inPlutellaxyllostellaembryonic cells. 【Method】P.xyllostellaembryonic cells were divided into azadirachtin treated and untreated groups, the inhibition rate of cells proliferation was detected using CCK-8 kit. The cell death and apoptotic body were observed using laser confocal microscope after stained by PI and DAPI respectively. The expression of Caspase-3 and the phosphorylation of pathway protein Akt were detected using Western-blotting.【Result】Azadirachtin had significant inhibitory effect on the proliferation ofP.xyllostellaembryonic cells, and the effect was dose-dependent. IC50was 4.4 μg·mL-1in 24 h. Dead cells could be observed in azadirachtin treated group after stained by PI, and apoptotic body could be found in the same group after stained by DAPI. Caspase-3 protein was cleaved and Akt phosphorylation was inhibited.【Conclusion】 Azadirachtin has significant inhibitory effect on the proliferation ofP.xyllostellaembryonic cells. By inhibiting the activation of Akt signaling pathway, azadirachtin can induce cells to produce Caspase-3-dependent type I apoptosis.

azadirachtin;Plutellaxyllostella; embryonic cell; apoptosis; proliferation

2016- 02- 21 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

邵雪花(1983—)，女，博士，E-mail: sxh19831017@163.com; 通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail: hhxu@scau.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(31471793，31601699)

S482.1

A

1001- 411X(2017)04- 0019- 06

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1923.006.html

邵雪花， 賴 多， 毛根林， 等.印楝素對小菜蛾胚胎細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):19- 24.