楊曉云， 江騰輝， 黃其亮， 徐漢虹

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 廣東 廣州510642；2廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心， 廣東 廣州510500； 3 廣東省環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510655)

印楝素水解動(dòng)力學(xué)研究及水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

楊曉云1， 江騰輝2， 黃其亮3， 徐漢虹1

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 廣東 廣州510642；2廣東省農(nóng)業(yè)有害生物預(yù)警防控中心， 廣東 廣州510500； 3 廣東省環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510655)

【目的】系統(tǒng)研究印楝素在水溶液中的水解?！痉椒ā抗枘z柱層析法和半制備液相色譜法分離純化w為44.56%的印楝素原藥中的印楝素A，采用核磁共振儀和高效液相色譜定性、定量測(cè)定分離得到的印楝素A，建立一種檢測(cè)水樣中印楝素殘留的高效液相色譜方法?！窘Y(jié)果】核磁共振儀和高效液相色譜測(cè)得印楝素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為90.37%和91.82%。當(dāng)印楝素添加水平為0.1、1.0和5.0 mg·kg-1時(shí)，水樣中印楝素的平均回收率為92.53%～94.12%，變異系數(shù)為0.35%～0.84%，最小檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.012 mg·L-1。印楝素在pH 4.0～6.0的緩沖溶液中穩(wěn)定，當(dāng)pH大于8.0時(shí)，印楝素降解加快，降解半衰期從pH 8.0的14.856 h 降到pH 10.0的0.033 h。在pH 6.0的緩沖溶液中，25、35、45 ℃條件下印楝素的降解半衰期分別為24.68、13.69和2.36 d，而在pH 7.0的緩沖溶液中印楝素的降解半衰期分別為9.35、6.51和0.94 d。在pH 2.0的緩沖溶液中分離純化水解產(chǎn)物得到印楝素A內(nèi)酯衍生物。【結(jié)論】印楝素在堿性環(huán)境下極不穩(wěn)定，而在弱酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定。溫度對(duì)印楝素的降解影響很大，隨著溫度的升高印楝素降解加快。

印楝素； 殘留； 水解動(dòng)力學(xué)； 水解產(chǎn)物； 硅膠柱層析法； 高效液相色譜; 核磁共振

印楝Azadirachtaindica植株中發(fā)現(xiàn)的以印楝素為主的400余種殺蟲(chóng)活性物質(zhì)，可防治10目400余種農(nóng)林、倉(cāng)庫(kù)和衛(wèi)生害蟲(chóng)[1-3]。農(nóng)藥的水解是農(nóng)藥的一個(gè)主要環(huán)境化學(xué)行為，包括農(nóng)藥在水環(huán)境中的微生物降解、化學(xué)降解和光降解，它是評(píng)價(jià)農(nóng)藥在水體中殘留特性的重要指標(biāo)，其降解速率受農(nóng)藥的性質(zhì)與水環(huán)境條件等制約，而水解只是影響農(nóng)藥含量的一個(gè)因素，其他因素如農(nóng)藥的施用量、稀釋程度、吸附、生物富集等也影響農(nóng)藥在水環(huán)境中的存在狀況[4-5]。影響農(nóng)藥水解的因素很多，如反應(yīng)介質(zhì)溶劑化能力的變化將影響農(nóng)藥、中間體或產(chǎn)物的水解反應(yīng)；離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑量的改變將影響到溶劑化的能力[6]，并且因此改變水解速率。此外還可能存在普通酸、堿和沉積物及痕量金屬催化的特殊介質(zhì)效應(yīng)[7-9]。有研究從水分含量、能量和溫度的角度進(jìn)行了農(nóng)藥降解試驗(yàn)[10-12]。 印楝素的穩(wěn)定性是田間使用時(shí)面臨的首要問(wèn)題[13]。關(guān)于印楝素的檢測(cè)，已有許多相關(guān)研究報(bào)道[14-17]，本文研究pH、溫度以及不同水質(zhì)對(duì)印楝素水解的影響，擬建立一種檢測(cè)水樣中印楝素殘留的高效液相色譜方法，并對(duì)印楝素在pH 2.0的緩沖溶液中的水解產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化、鑒定，以期為印楝素的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用珠江水采集于珠江中山大學(xué)江段；稻田水采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田；地表水采集于火爐山森林公園；水庫(kù)水采集于龍洞霄雞坳水庫(kù)；湖水采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)人工湖；純水為實(shí)驗(yàn)室自制。試驗(yàn)所用緩沖溶液配方參考文獻(xiàn)[18]： 1) pH 1.0：0.2 mol·L-1的HCl 47.5 mL+0.2 mol·L-1的 KCl 25 mL； 2) pH 2.0： 0.2 mol·L-1的HCl 5.3 mL+0.2 mol·L-1的KCl 25 mL； 3) pH 3.0： 0.2 mol·L-1的HCl 10.2 mL+0.2 mol·L-1的KHC8H4O425 mL； 4) pH 4.0： 0.1 mol·L-1的NaOH 0.4 mL+0.2 mol·L-1的KHC8H4O425 mL； 5) pH 5.0： 0.1 mol·L-1的NaOH 23.9 mL+0.2 mol·L-1的KCl 25 mL； 6) pH 6.0：0.1 mol·L-1的NaOH 5.7 mL+0.2 mol·L-1的KH2PO425 mL； 7) pH 7.0：0.1 mol·L-1的NaOH 29.6 mL+0.2 mol·L-1的KH2PO425 mL； 8) pH 8.0： 0.1 mol·L-1NaOH 46.8 mL+0.2 mol·L-1KH2PO425 mL； 9) pH 9.0： 0.1 mol·L-1NaOH 21.3 mL+0.2 mol·L-1(H3BO3+KCl)25 mL； 10) pH 10.0： 0.1 mol·L-1的NaOH 43.9 mL+0.2 mol·L-1的(H3BO3+KCl)25 mL； 11) pH 11.0：0.1 mol·L-1的NaOH 5.1 mL+0.2 mol·L-1的Na2HPO425 mL； 12) pH 12.0：0.1 mol·L-1的NaOH 26.9 mL+0.2 mol·L-1的Na2HPO425 mL； 13) pH 13.0：0.2 mol·L-1的NaOH 66 mL+0.2 mol·L-1的KCl 25 mL,以上溶液均加蒸餾水定容至100 mL。

1.2 方法

1.2.1 水樣理化性質(zhì)檢測(cè) 玻璃電極法測(cè)定pH、紫外分光光度法測(cè)定總氮含量、鉬酸銨分光光度法測(cè)定總磷含量、重鉻酸鹽法測(cè)定化學(xué)需氧量、酚二磺酸分光光度法測(cè)定硝酸鹽氮含量、納氏試劑比色法測(cè)定氨氮含量。

1.2.2 印楝素及印楝素降解產(chǎn)物柱層析分離 確定洗脫系統(tǒng)：根據(jù)待分離物質(zhì)在GF254板上的分離效果確定洗脫系統(tǒng)和梯度。裝柱：將起始洗脫劑溶液V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶7加入硅膠，充分?jǐn)嚢枰耘懦鰵馀?，一次性加入固定好的層析柱中，打開(kāi)下部活塞，使溶劑緩緩流出，同時(shí)輕輕敲打柱體(注意保持柱面平整)以排出氣泡，將流出的洗脫劑加回柱頂部反復(fù)沖洗柱中硅膠，直到硅膠面不再下降為止。柱層析硅膠與分離樣品的質(zhì)量比為15～20。拌樣：樣品溶于少量的丙酮溶劑中，滴入硅膠中(200～300目),邊滴邊攪拌，等丙酮完全揮發(fā)后，用研磨棒將樣品碾勻。上樣：將拌好樣品的硅膠通過(guò)漏斗加入到層析柱的上端，用少量石油醚清洗研缽、漏斗和柱壁上的樣品，等樣品沉降形成均勻的薄層后，再加入約1 cm的無(wú)水硫酸鈉或石英砂，然后加入流動(dòng)相洗脫。洗脫：分別選用正己烷、乙酸乙酯不同體積配比的混合液作為洗脫液。定量接取餾分并蒸干。TLC點(diǎn)樣：收集的不同樣品用毛細(xì)管吸取少量的樣品溶液，點(diǎn)于薄層層析板底端約1cm處，各樣點(diǎn)成一條直線(xiàn)，與板底線(xiàn)平行。展開(kāi)劑的高度低于樣品線(xiàn)。TLC展開(kāi)劑為V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=2∶1，隨配隨用，乙酸乙酯與正己烷的比例隨展開(kāi)效果的不同而變化。待溶劑線(xiàn)展至層析板頂端未至硅膠邊緣時(shí)，取出層析板，自然晾干， 放入充滿(mǎn)碘蒸氣的碘缸中顯色。對(duì)收集的組分進(jìn)行TLC檢測(cè)，將只出現(xiàn)1個(gè)點(diǎn)的組分根據(jù)比移值(Rf)是否相同進(jìn)行合并。

1.2.3 印楝素水解產(chǎn)物的分離鑒定 準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g印楝素溶于100 mL pH為2.0的緩沖液中(加少量甲醇以提高印楝素的溶解度)。然后將該反應(yīng)液置于70 ℃的水浴鍋中，于4 h后進(jìn)行萃取、濃縮，硅膠柱層析分離。

1.2.4 印楝素及印楝素降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 核磁共振氫譜(1H NMR)、核磁共振碳譜(13C NMR)用Bruker Avance-600 型超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定，以氘代三氯甲烷(CDCl3)為溶劑，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。

1.2.5 印楝素殘留分析前樣品處理 取50 mL已過(guò)濾水樣(pH 6.8)于250 mL分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3次，用量分別為30、20和20 mL，靜置分層，萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水濾入250 mL的圓底燒瓶中，在40 ℃條件下減壓濃縮到1 mL左右，用甲醇定容到3 mL，待測(cè)。水樣中印楝素殘留直接采用二氯甲烷進(jìn)行萃取[19]。

1.2.6 色譜檢測(cè)條件 定量檢測(cè)采用外標(biāo)法。色譜柱為Agilent TC-C18(5 μm)，250 mm×4.6 mm，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=40∶60，流速為1 mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在上述檢測(cè)條件下印楝素的保留時(shí)間為9.80 min。

1.2.7 不同pH條件下的水解 取潔凈且已滅菌的20 mL具塞刻度試管，分為13組，每組30個(gè)。準(zhǔn)確移取0.5 mg·mL-1的印楝素丙酮溶液2 mL于具塞刻度試管中，待溶劑揮發(fā)近干時(shí)，分別加入適量的 pH為1.0～13.0的緩沖液至20 mL刻度處，振蕩使之混和均勻，使印楝素的初始質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，密封后置于(25±1) ℃恒溫箱中降解 (黑暗避光)，每處理3個(gè)重復(fù)。

在加藥當(dāng)日(0 d)和加藥后1、3、5、7、9、15、20、25、30 d取樣測(cè)定pH為2.0～7.0的緩沖溶液中印楝素的殘留量；而pH 1.0和pH為8.0～13.0的緩沖溶液在加藥后0、2、4、6、8、10 h取樣測(cè)定印楝素的殘留量。

1.2.8 不同溫度條件下的水解 取潔凈且已滅菌的具塞刻度試管，分為6組，每組24個(gè)。準(zhǔn)確移取0.5 mg·mL-1的印楝素丙酮溶液2 mL于具塞刻度試管中，待溶劑揮發(fā)近干時(shí)，分別加入適量的pH 7.0的緩沖溶液至20 mL刻度處，振蕩使之混和均勻，使印楝素的初始質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，密封后分別置于(25±1)、(35±1)、(45±1) ℃的恒溫環(huán)境中降解(黑暗避光)，每處理3個(gè)重復(fù)。在加藥當(dāng)日(0 d后)和加藥后1、3、5、7、9、15、20、25、30 d取樣測(cè)定印楝素的殘留量。

1.2.9 在實(shí)際水樣中的水解 取潔凈且已滅菌的具塞刻度試管，分為5組，每組30個(gè)。準(zhǔn)確移取0.5 mg·mL-1的印楝素丙酮溶液2 mL于具塞刻度試管中，待溶劑揮發(fā)近干時(shí)分別加入適量的pH為1.0～10.0的緩沖液以及5種環(huán)境天然水樣作為試驗(yàn)對(duì)象，使樣品中印楝素的初始質(zhì)量分別為0.5、1.0、5.0 mg·L-1，加入適量的NaCl，用二氯甲烷萃取、回收，計(jì)算添加回收率。相同處理后使印楝素的初始質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，密封后置于(25±1) ℃恒溫箱中降解(黑暗避光)，每處理3個(gè)重復(fù)。在加藥當(dāng)日(0 d)和加藥后1、3、5、7、9、15、20、25、30 d取樣測(cè)定印楝素的殘留量。

將印楝素在5種天然水體中的降解半衰期與各水體性質(zhì)如pH、總氮含量、總磷含量、化學(xué)需氧量、硝酸鹽氮含量和氨氮含量進(jìn)行單因子線(xiàn)性回歸分析，分析影響印楝素降解的顯著理化因素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)所測(cè)峰面積，計(jì)算樣本中農(nóng)藥的殘留量(R)，公式如下：

式中，ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg·L-1；S1為注入標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，S2為注入樣品溶液的峰面積，V為樣品溶液最終定容體積，mL；V1為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積，μL；V2為樣品溶液進(jìn)樣體積，μL；m為稱(chēng)樣質(zhì)量，g。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件分析，麥夸特法將水解試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程得光解速率常數(shù)(k)。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 硅膠柱層析分離純化 對(duì)w為44.56%的印楝素原藥進(jìn)行大柱初步分離并經(jīng)TLC鑒定，對(duì)比印楝素原藥、印楝素原藥中純度較高的餾分A和印楝素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC法得到的色譜圖(圖1a～1c)，根據(jù)保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)該餾分A(圖1b)與印楝素標(biāo)準(zhǔn)品譜圖吻合，進(jìn)而對(duì)餾分再經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚+乙酸乙酯洗脫，經(jīng)HPLC分析(圖1d)，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖1c比較，分析、計(jì)算得到印楝素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.37%。

2.1.2 印楝素結(jié)構(gòu)鑒定 經(jīng)1H NMR和13C NMR分析，其值與文獻(xiàn)基本一致[20]，證實(shí)該晶體為印楝素，其核磁共振譜的化學(xué)位移13C NMR與文獻(xiàn)值的比較見(jiàn)表1，印楝素結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 High efficiency liquid chromatography

Tab.1 13C NMR data of azadirachtin ×10-6

2.2 降解產(chǎn)物的分離鑒定

通過(guò)研究印楝素在純凈水中水解過(guò)程的液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)印楝素在水解后出現(xiàn)了多個(gè)水解產(chǎn)物峰， 印楝素水解產(chǎn)物經(jīng)萃取、濃縮后，樣品經(jīng)硅膠柱層析分離純化,得到一種純度較高的印楝素A內(nèi)脂衍生物,經(jīng)1H NMR和13C NMR分析，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，其1H NMR譜見(jiàn)圖4a，13C NMR譜見(jiàn)圖4b。

2.3 印楝素的水化學(xué)降解

2.3.1 印楝素在水體中的添加回收試驗(yàn) pH為1.0和pH為8.0～10.0的緩沖溶液中的添加回收率比較低，少于80%，因?yàn)橛￠卦趬A性和偏酸性的條件下不穩(wěn)定，容易降解，而pH大于11.0時(shí)，難以回收到印楝素。其他情況下添加回收率為82.49%～94.31%，變異系數(shù)最大為2.88%，符合殘留檢測(cè)條件。

2.3.2 印楝素的降解試驗(yàn) 印楝素在pH 2.0～7.0的緩沖溶液中的降解趨勢(shì)見(jiàn)圖5，采用麥夸特法將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用動(dòng)力學(xué)方程擬合，結(jié)果見(jiàn)表2?？梢钥闯鲇￠卦趐H 4.0、5.0、6.0的緩沖溶液中比較穩(wěn)定，半衰期分別為22.87、36.33和24.68 d。

印楝素在pH 8.0～10.0和pH 1.0的緩沖溶液中的降解趨勢(shì)見(jiàn)圖6，采用麥夸特法將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用動(dòng)力學(xué)方程擬合(表2)。從圖6和表2可以看出印楝素在pH 1.0和堿性條件下降解很快，在pH為1.0、 8.0、9.0和10.0緩沖溶液中降解的半衰期分別為0.10、0.62、0.10和0.03 d，而在pH大于11.0的緩沖液中的半衰期小于10 min。

圖3 印楝素水解產(chǎn)物印楝素A內(nèi)酯衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)試

Fig.3 Structure of azadirachtin A lactone derivative of azadirachtin hydrolysate

圖4 印楝素內(nèi)脂衍生物的1H NMR和13C NMR圖譜Fig.4 1H NMR and 13C NMR spectra of azadirachtin derivatives

圖5 印楝素的降解曲線(xiàn)Fig.5 Degradation curves of azadirachtin

由表2可以看出，印楝素在pH 4.0～6.0的緩沖溶液中比較穩(wěn)定，而當(dāng)pH大于8.0時(shí)，印楝素降解速率顯著加快，降解半衰期從pH 8.0的0.62 d降到pH 10.0的0.03 d，而pH大于11.0時(shí)則難以檢測(cè)到印楝素的殘留，印楝素在pH小于3.0的緩沖溶液中的半衰期下降的趨勢(shì)小于pH大于8.0的下降趨勢(shì)?？傊￠卦趬A性環(huán)境下不穩(wěn)定，而在弱酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定。

表2 印楝素的動(dòng)力學(xué)分析Tab.2 Kinetic analysis of azadirachtin

圖6 印楝素在pH 1.0、8.0、9.0、10.0緩沖溶液中的降解曲線(xiàn)

Fig.6 Degradation curves of azadirachtin in buffer solutions at pH 1.0, 8.0, 9.0 and 10.0

2.3.3 溫度對(duì)印楝素水解速率的影響 印楝素在模擬天然水體中不同溫度下的降解趨勢(shì)見(jiàn)圖7，采用麥夸特法將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用動(dòng)力學(xué)方程擬合，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，溫度對(duì)印楝素在模擬天然水體中的降解影響很大，在pH 6.0的緩沖溶液中，25、35和45 ℃下的降解半衰期分別為24.68、13.69和2.36 d，而在pH 7.0的緩沖溶液中分別為9.35、6.51和0.94 d，可見(jiàn)，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，印楝素的降解速率明顯加快，也可以看出，水體的pH對(duì)印楝素的降解也有很大的影響。

圖7 印楝素在模擬天然水體不同溫度下的降解曲線(xiàn)

Fig.7 Degradation curves of azadirachtin in simulated natural water at different temperatures

表3 印楝素在模擬天然水體不同溫度下的降解動(dòng)力學(xué)方程

Tab.3 Degradation kinetic equations of azadirachtin in simulated natural water at different temperatures

pHθ/℃動(dòng)力學(xué)方程相關(guān)系數(shù)(r)半衰期/d6.025Ct=44.36e-0.0281t0.997624.6835Ct=45.08e-0.0506t0.994313.6945Ct=47.63e-0.2940t0.99242.367.025Ct=43.04e-0.0741t0.99779.3535Ct=45.57e-0.1060t0.99456.5145Ct=45.98e-0.7370t0.99990.94

2.3.4 印楝素在天然水體中的水解動(dòng)力學(xué) 印楝素在天然水體中的降解結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，印楝素在水庫(kù)水中的降解半衰期最長(zhǎng)，為37.06 d，在湖水中的半衰期最短，為6.43 d，在地表水和稻田水中降解的半衰期相差不大，分別為15.90和14.91 d，在珠江水中的降解半衰期相對(duì)較小，為12.19 d。將印楝素在水體中降解的半衰期與水體理化性質(zhì)進(jìn)行單因子線(xiàn)性回歸分析(表 5)，從表5可以看出印楝素在水體中的降解與pH表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.995 9，而與總氮含量、總磷含量、化學(xué)需氧量、硝酸鹽氮含量和氨氮含量的相關(guān)性很差。

表4 印楝素在天然水體中的降解動(dòng)力學(xué)方程

Tab.4 Degradation kinetic equations of azadirachtin in natural water

水體動(dòng)力學(xué)方程相關(guān)系數(shù)(r)半衰期/d珠江水Ct=46.76e-0.0569t0.997412.19稻田水Ct=45.98e-0.0465t0.989714.91地表水Ct=45.72e-0.0436t0.996615.90湖水Ct=44.79e-0.1080t0.99426.43水庫(kù)水Ct=44.96e-0.0180t0.995037.06

表5 印楝素降解半衰期與水體理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

Tab.5 Analysis of the correlation between the degradation half-life of azadirachtin and physical/chemical properties of water

理化性質(zhì)回歸方程1)相關(guān)系數(shù)(r)pHy=183.570-23.5370x0.9959總磷含量y=20.995-11.1230x0.2855總氮含量y=27.190-2.3678x0.4980化學(xué)需氧量y=18.449-0.0093x0.0447硝酸鹽氮含量y=20.352-2.7261x0.3768氨氮含量y=16.873+0.8906x0.3191

1)y為印楝素半衰期，x為對(duì)應(yīng)的理化性質(zhì)。

3 結(jié)論

印楝素在不同溫度下的水解試驗(yàn)表明，溫度對(duì)其降解影響較大，在pH 6.0的緩沖溶液中，25、35和45 ℃下的降解半衰期分別為24.68、13.69和2.36 d，而在pH 7.0的緩沖溶液中分別為9.35、6.51、0.94 d，可見(jiàn)，當(dāng)溫度高于35 ℃時(shí)，印楝素A的降解速率明顯加快，所以在印楝素的儲(chǔ)存過(guò)程中，要盡量避免高溫。在研究印楝素水解產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPLC色譜圖上顯示有多個(gè)水解產(chǎn)物峰，但只分離到1種純度較高的產(chǎn)物，通過(guò)硅膠柱層析對(duì)印楝素的水解產(chǎn)物進(jìn)行了分離及結(jié)構(gòu)鑒定，確定分離的水解產(chǎn)物為印楝素A內(nèi)酯衍生物。其他的水解產(chǎn)物有待進(jìn)一步的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。本研究通過(guò)硅膠柱層析對(duì)w為44.56%的印楝素原藥進(jìn)行分離純化，可以得到w為90%以上的印楝素原藥。水解試驗(yàn)表明，印楝素在弱酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定，而堿性環(huán)境下極不穩(wěn)定。印楝素在天然水體中的降解受pH影響顯著，而與總氮含量、總磷含量、化學(xué)需氧量、硝酸鹽氮和氨氮含量等因子的相關(guān)性不明顯。

印楝素水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征、合成及其在環(huán)境中的歸宿與生態(tài)毒理效應(yīng)還有待進(jìn)一步的研究。

[1] 榮曉東， 徐漢虹， 趙善歡. 植物性殺蟲(chóng)劑印楝的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2000(2): 9-14.

[2] 譚衛(wèi)紅， 宋湛謙. 天然植物殺蟲(chóng)劑印楝素的研究進(jìn)展[J]. 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 10(1): 23-29.

[3] 趙淑英， 王秋， 羅萬(wàn)春. 印楝植物農(nóng)藥的研究進(jìn)展[J]. 濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 18(2): 145-149.

[4] 張宗炳， 樊德方， 錢(qián)傳范， 等. 殺蟲(chóng)藥劑環(huán)境毒理學(xué)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1989: 25-89.

[5] 蔡道基. 農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)研究[M]. 北京: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社， 1999: 78-83.

[6] WEI J， FURRER G， SCHULIN R. Kinetics of carbosulfan degradation in the aqueous phase in the presence of a cosolvent[J]. J Environ Qual， 2000， 29(5): 1481-1487.

[7] 王連生. 有機(jī)污染化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社， 1990: 208-255.

[8] SARMAH A K， KOOKANA R S， DUFFY M J， et al. Hydrolysis of triasulfuron， metsulfuron-methyl and chlorsulfuron in alkaline soil and aqueous solutions[J]. Pest Manag Sci， 2000， 56(5): 463-471.

[9] WET J， FURRIE G， KAUFMANN S， et al. Influence of clay minerals on the hydrolysis of carbamate pesticides[J]. Environ Sci Technol， 2001， 35(11): 2226-2232.

[10]韓丙軍， 何書(shū)海， 林靖凌， 等. 溫度影響印楝素A及同系物降解動(dòng)力學(xué)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥， 2007(6): 30-34.

[11]韓丙軍， 陳麗霞， 黃華平， 等. 印楝素A降解動(dòng)力學(xué)研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2008(1): 97-101.

[12]嚴(yán)亞麗， 陳麗霞， 彭黎旭. 水分影響印楝素及同系物降解動(dòng)力學(xué)研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009(5): 30-32.

[13]徐勇， 郭鑫宇， 項(xiàng)盛， 等. 植物源殺蟲(chóng)劑印楝素研究開(kāi)發(fā)及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥， 2014(5): 31-37.

[14]羅應(yīng)蘭， 劉宏程. 超聲波固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中印楝素及類(lèi)似物殘留量[J]. 農(nóng)藥， 2016 (12): 915-917.

[15]周穎， 安瑩， 燕傳勇， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中印楝素A和B的殘留量[J]. 理化檢驗(yàn)， 2016， 52(11): 1292-1296.

[17]POZO O J， MARIN J M， SANCHO J V， et al. Determination of abamectin and azadirachtin residues in orange samples by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. J Chromatogr A， 2003， 992(1/2): 133-140.

[18]楊克武， 莫漢宏， 安鳳春， 等. 有機(jī)化合物水解的研究方法[J]. 環(huán)境化學(xué)， 1994， 13(3): 206-209.

[19]樊德方. 農(nóng)藥殘留分析與檢測(cè)[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1982: 8-26.

[20]SHAUN J， DAVID E. Supercritical fluid extraction of oil and triterpenoids from neem seeds[J]. Phytochem Analysis， 1997， 8(5): 228-232.

【責(zé)任編輯 霍 歡】

Study on hydrolysis kinetics of azadirachtin and structure analysis of hydrolysate

YANG Xiaoyun1， JIANG Tenghui2， HUANG Qiliang3， XU Hanhong1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture，South China Agricultural University， Guangzhou 510642，China； 2 Agricultural Pest Prevention and Control Center of Guangdong Province，Guangzhou 510500，China； 3 Guangdong Vocational and Technotogical School of Environmental Protection，Guangzhou 510655，China)

【Objective】 To study hydrolysis of azadirachtin in water systematically.【Method】Azadirachtin A from the 44.56% azadirachtin TC was isolated and purified by silica column chromatography and semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC). The chemical structure and content of isolated azadirachtin A were identified by nulear magnetic resonance (NMR) and HPLC. A method for determining azaditachtin residue in water by HPLC was established. 【Result】The mass fractions of azadirachtin A were 90.37% and 91.82% detected by NMR and HPLC respectively. When azadirachtin was added with the concentrations of 0.1, 1.0 and 5.0 mg·kg-1, the average recovery rates of azadirachtin from water samples ranged from 92.53% to 94.12%, the variation coefficients ranged from 0.35% to 0.84%, and the minimum detection limit was 0.012 mg·L-1. Azadirachtin was stable in buffer solutions with pH varying from 4.0 to 6.0. When pH was above 8.0, hydrolysis of azadirachtin was accelerated, and the degradation half-life was 14.856 h at pH 8.0 and declined to 0.033 h at pH 10.0. The degration half-lives of azadirachtin in buffer solutions at pH 6.0 were 24.68, 13.69 and 2.36 d under 25, 35 and 45 ℃ temperature respectively, while were 9.35, 6.51 and 0.94 d at pH 7.0. A lactone derivative of azadirachtin was obtained by isolating and purifing hydrolysate in buffer solution at pH 2.0. 【Conclusion】Azadirachtin is extremely unstable in alkaline environment while relatively stable in weak acid environment. Temperature has a great effect on the degradation of azadirachtin and the degradation accelerates as temperature increases.

azadirachtin； residue； hydrolysis kinetics； hydrolysate； silica column chromatography； HPLC； nuclear magnetic resonance

2017- 03- 01 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

楊曉云(1966—)，男，苗族，副教授，博士，E-mail：yxyhyxy@scau.edu.cn；通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@csau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(20377015)

S828

A

1001- 411X(2017)04- 0041- 07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1924.014.html

楊曉云， 江騰輝， 黃其亮， 等.印楝素水解動(dòng)力學(xué)研究及水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):41- 47.