張興桃，張東京，董 增，常志強(qiáng)，湯懷潁

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州，234000

?

超臨界CO2萃取景天三七總黃酮的工藝優(yōu)化

張興桃，張東京，董 增，常志強(qiáng)，湯懷潁

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，宿州，234000

以景天三七為材料，采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取景天三七總黃酮，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)研究萃取溫度、壓力、夾帶劑對(duì)總黃酮提取效果的影響，正交試驗(yàn)法研究超臨界CO2萃取景天三七總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果表明，景天三七的總黃酮類化合物萃取的最佳條件為萃取壓力300 Bar、萃取溫度45℃、夾帶劑為80%乙醇，總黃酮化合物的含量為19.54 mg/g，方差分析表明夾帶劑和溫度對(duì)提取效果影響顯著。經(jīng)重復(fù)性驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定，適用于景天類植物總黃酮的提取。

景天三七；總黃酮；正交設(shè)計(jì)；超臨界CO2萃取

景天三七(SedumaizoonL.)為景天科植物，味甘，微酸，是一種藥用價(jià)值較高的保健植物，具有止血、消炎、鎮(zhèn)痛等作用[1]，有研究表明景天三七的有效主要成分是黃酮、景天庚糖、果糖和有機(jī)酸等[2]?？傸S酮具有抗腫瘤、抗癌、清熱解毒、護(hù)肝、延緩衰老等藥用功能[3-4]。

超臨界CO2萃取技術(shù)在中藥有效成分的提取上具有操作簡(jiǎn)單、純度高等諸多優(yōu)點(diǎn)[5]。目前超臨界CO2萃取景天三七總黃酮的研究較少，本研究旨在用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化超臨界CO2萃取工藝，確定提取景天三七總黃酮的最佳方案。

1 材料與方法

1.1 材 料

景天三七幼苗在光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)至開(kāi)花，材料為開(kāi)花期前期的景天三七全草。

1.2 試劑與主要儀器

1.2.1 試 劑

無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、鹽酸、鋅粉等(均為分析純)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(100 mg,100080-201409，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，高純度CO2。

1.2.2 主要儀器

超臨界萃取系統(tǒng)(HA120-50-02，美國(guó)Water公司)，紫外分光光度計(jì)(U-3100，日本島津公司)，冷凍干燥機(jī)(FD-2A，上海田楓實(shí)業(yè)公司)，電子天平(FA2004N，上海圣科有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-5299，鄭州亞榮儀器有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 景天三七的預(yù)處理

取花期的景天三七全草洗凈，吸水紙吸水，放到-20℃冰箱中冷凍12 h，冷凍干燥機(jī)干燥，取出放入中藥材粉碎機(jī)，過(guò)40目篩，密封，存放陰涼干燥處。每次分裝1 g景天三七干粉用濾紙包好裝入超臨界CO2萃取萃取釜中，擰緊萃取蓋，檢漏。超臨界CO2萃取工藝系統(tǒng)流程如下：

1.3.2 技術(shù)流程

粉碎干燥的景天三七→過(guò)篩→稱3g→超臨界CO2萃取→分離純化總黃酮→鑒定→含量測(cè)定→確定最佳工藝。

1.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品放入真空干燥箱中，120℃減壓干燥至恒重，精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用60%乙醇溶解，搖勻，定容至100 mL，配成0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液待用，避光放置。量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于6支10 mL比色管中。在501 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定

精密量取配制的景天三七總黃酮溶液1.0 mL和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，分別放置于10 mL比色管中，用50%乙醇稀釋至刻度5.0 mL，加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)為5% NaNO2溶液，搖勻，靜止5 min，加入0.4 mL 5% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置5 min，再加4 mL 4%NaOH，用50%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置10 min。紫外分光光度計(jì)在300～600 nm之間進(jìn)行波長(zhǎng)掃描[6]，在501 nm處找到最大吸收峰，確定該波長(zhǎng)為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.5 總黃酮含量的計(jì)算

分別在10 mL比色管中加入稀釋10倍后的景天三七提取液0.0 mL與1.0 mL。在501 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光度A。將A代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸線性方程中得出濃度，然后按照下列方程計(jì)算總黃酮的含量。根據(jù)數(shù)據(jù)得出用超臨界CO2萃取黃酮類物質(zhì)的最佳條件。

式中，P表示總黃酮含量(mg/g)，C表示總黃酮濃度(mg/mL)，N表示萃取液的稀釋倍數(shù)，V表示萃取液的體積(mL)，W表示景天三七原料投料量(g)。

1.3.6 單因素實(shí)驗(yàn)

以萃取壓力、萃取溫度、夾帶劑濃度為3個(gè)單因素，每個(gè)因素分別設(shè)計(jì)5個(gè)水平，3次重復(fù)，其中一個(gè)因素改變，其他因素不變。設(shè)定萃取時(shí)的壓力分別為150、200、250、300、350 Bar，設(shè)溫度分別為35、40、45、50、55℃，夾帶劑分別為體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%乙醇5個(gè)水平。

1.3.7 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

以15 mL/min為流速，設(shè)置夾帶劑濃度(80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇)、萃取壓力(200、250、300 Bar)和溫度(40、45、50 ℃)為3個(gè)因素，設(shè)立3個(gè)水平。用正交軟件進(jìn)行方案設(shè)計(jì)，平行3次(表1)。

表1 正交因素水平表

1.3.8 景天三七萃取液的純化結(jié)晶

采用超臨界CO2萃取法得到景天三七總黃酮萃取液，然后將萃取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，去除萃取液中的乙醇，得到總黃酮水溶液，最后將該溶液放入冷凍干燥機(jī)干燥至粉末，即得到總黃酮粉末。

1.3.9 黃酮類物質(zhì)的鑒定

將冷凍干燥所得的總黃酮粉末置于50 mL小燒杯中，加入25 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇充分溶解，取適量的溶液置于10 mL試管中，滴加四五滴濃鹽酸，搖勻后再加入適量鋅粉，發(fā)生劇烈反應(yīng)。根據(jù)HCl-鋅粉的顏色反應(yīng)，觀察反應(yīng)的顏色變化。黃酮類物質(zhì)具有鄰酚羥基，可與鋅離子形成黃色或橙紅色絡(luò)合物，使用HCl-鋅粉反應(yīng)可以鑒別是否有總黃酮物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.3.6的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸曲線方程為y=0.0114x+0.015,其R2=0.9989(圖1)。

圖1 蘆丁吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 溫度對(duì)總黃酮萃取量的影響

溫度為30℃～50℃時(shí)，總黃酮含量與溫度呈正相關(guān)，溫度為50℃時(shí)總黃酮含量最高為17.59 mg·g-1，表明總黃酮的量隨萃取溫度的升高而增加，但溫度超過(guò)50℃時(shí)，總黃酮量呈下降趨勢(shì)(圖2)。

圖2 溫度對(duì)景天三七總黃酮萃取量的影響

2.2.2 夾帶劑濃度對(duì)總黃酮萃取量的影響

乙醇濃度在50%～80%時(shí)，總黃酮含量不斷上升。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為18.32 mg/g；當(dāng)乙醇濃度超出80%時(shí)，總黃酮含量呈下降趨勢(shì)(圖3)。

2.2.3 萃取壓力對(duì)總黃酮萃取量的影響

萃取壓力200～300 Bar時(shí)，總黃酮含量上升較為明顯；當(dāng)萃取壓力為300 Bar，總黃酮含量達(dá)到最高，為19.22 mg·g-1；萃取壓力超過(guò)300 Bar時(shí)，總黃酮含量呈下降趨勢(shì)(圖4)。出現(xiàn)此類情況可能是：其他條件不變時(shí)，分子間平均自由程與壓力呈負(fù)相關(guān)。但溶質(zhì)與溶劑間親和性增強(qiáng)，流體CO2的擴(kuò)散與滲透能力增大，提高了超臨界 CO2的溶解能力。

圖3 夾帶劑濃度對(duì)景天三七總黃酮萃取量的影響

圖4 壓力對(duì)景天三七總黃酮萃取量的影響

2.3 總黃酮鑒定

采用HCl-鋅粉顏色反應(yīng)鑒定景天三七總黃酮，所得結(jié)果如圖5所示。

圖5 正交試驗(yàn)提取物黃酮鑒定圖

2.4 正交實(shí)驗(yàn)分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，極差越大，顯著性越明顯。A(乙醇濃度)極差最大，為5.804，可以判斷夾帶劑乙醇濃度對(duì)景天三七總黃酮萃取量的影響最大；B(萃取壓力)和C(溫度)極差值分別為1.860和0.927，對(duì)總黃酮萃取量的影響較小。最佳提取工藝條件80%的乙醇作為夾帶劑、萃取壓力300Bar、溫度45℃條件下，總黃酮萃取量為19.54 mg/g(表2)。

表2 景天三七中提取總黃酮的正交設(shè)計(jì)直觀分析

方差分析表明，該模型P溫度=0.004<0.01，差異極顯著；P夾帶劑=0.002<0.01，P壓力=0.015<0.05，表明萃取、夾帶劑、溫度對(duì)垂盆草總黃酮的提取影響極顯著，壓力的影響顯著(表3)。

表3 景天三七中提取總黃酮的方差分析表

注：*表示P<0.05顯著， **表示P<0.01極顯著。

3 結(jié) 論

采用超臨界CO2萃取法提取景天三七中黃酮類，并運(yùn)用相應(yīng)的軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，結(jié)果表明：對(duì)景天三七中總黃酮萃取量的影響程度從高到低依次為夾帶劑濃度>萃取壓力>萃取溫度。以1.0 g樣品計(jì)，景天三七總黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為萃取壓力300 Bar、萃取溫度為45℃，以80%乙醇為夾帶劑，所提取出的總黃酮含量為19.54 mg/g。超臨界CO2萃取法在提取景天三七總黃酮具有耗時(shí)短、無(wú)殘留溶劑和重金屬殘留、純度高等優(yōu)點(diǎn)。

[1]謝宗萬(wàn).中藥材品種論述：上冊(cè)[M].2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1989:79-80

[2]張晶晶，王晶，薛嬌，等．費(fèi)菜莖葉的化學(xué)成分[J]．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)．2010，27(8):635-638

[3]李秋紅，羅莉萍，葉文峰.超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的研究[J].食品科學(xué)，2006(12)：536-538

[4]萬(wàn)茵,謝明勇,董歡歡,等.超臨界CO2流體提取車前子總黃酮的工藝優(yōu)化[J]．南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：理科版,200731(2):160-163

[5]公衍玲,黃山,于慧榮.垂盆草總黃酮的酶法提取及其抑菌活性[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2010,28(2):114-115

[6]張珊珊,朱文嫻,趙曉紅,等.超臨界CO2萃取北方地區(qū)早園竹葉中總黃酮的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2011,32(6):143-147

(責(zé)任編輯：汪材印)

10.3969/j.issn.1673-2006.2017.05.034

2016-12-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21107078),宿州學(xué)院區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心課題(2015SZXTZXKFZD02、2015SZXTZXKF06)。

張興桃(1978-)，安徽宿松人，碩士，副教授，主要研究方向：植物分子生物學(xué)。

TS201.1

：A

：1673-2006(2017)05-0119-04