程保平, 彭埃天, 宋曉兵, 凌金鋒, 崔一平, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

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廣東三個柑橘品種不同生育期的黃龍病菌含量動態(tài)變化研究

程保平, 彭埃天*, 宋曉兵, 凌金鋒, 崔一平, 陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640)

采用實時熒光定量PCR檢測了廣東省3個柑橘品種在不同生育期的黃龍病菌含量,探索其動態(tài)變化規(guī)律,為病害防控提供依據(jù)。結果表明,第一年,3個品種春梢期的黃龍病菌平均含量分別為3.52×105、4.76×105、1.03×105拷貝/g,顯著低于相應夏梢期(5.50×105、9.48×105、2.50×105拷貝/g)和秋梢期(5.32×105、9.84×105、2.59×105拷貝/g);夏梢期與秋梢期含量又顯著低于相應冬梢期(21.60×105、17.65×105、6.86×105拷貝/g)及果實成熟期(14.57×105、16.45×105、7.96×105拷貝/g);砂糖橘全年黃龍病菌含量與貢柑無顯著差異,但均顯著高于檸檬;第二年的數(shù)據(jù)與第一年類似,但砂糖橘和貢柑在多個生育期的含菌量比上年均顯著升高,而檸檬所有生育期菌量均無顯著變化。結果顯示:柑橘病樹內(nèi)的黃龍病菌含量在春梢期最低,夏梢、秋梢期次之,冬梢期及果實成熟期最高;‘檸檬’相對耐病,體現(xiàn)為含菌量相對較低、增速較慢。

柑橘黃龍病; 病原菌含量; 動態(tài)變化規(guī)律; 不同柑橘品種

柑橘黃龍病是世界柑橘產(chǎn)業(yè)中危害最大的病害[1],在亞洲、非洲和美洲的近50個國家(地區(qū))均有發(fā)生。其中,美國佛羅里達州80%以上柑橘樹近年發(fā)現(xiàn)感染此病[2-3]。我國是柑橘主產(chǎn)國,柑橘產(chǎn)業(yè)在我國農(nóng)村社會和經(jīng)濟中具有重要的地位和作用,但目前我國多數(shù)柑橘主產(chǎn)區(qū)都受到了該病的嚴重威脅。據(jù)調(diào)查,廣東省有24萬hm2橘園,年產(chǎn)值約300億,目前有超過1/3的橘園感染柑橘黃龍病,年損失達上百億元[4-7]。

柑橘黃龍病的病原為原核生物α-薄壁菌門變形菌綱的候選韌皮部桿菌屬,有亞洲種、非洲種和美洲種3個種[8]。目前在我國傳播的是亞洲種。該病菌主要由攜菌的接穗、苗木和木虱傳播[1, 9]。黃龍病菌可侵染柑橘屬、金柑屬、枳屬、酒餅簕屬、九里香屬、黃皮屬等屬植物,寄主廣泛,目前所有商業(yè)柑橘品種對黃龍病菌均不表現(xiàn)抗病,但不同的柑橘品種接種柑橘黃龍病菌后,出現(xiàn)癥狀的時間有所不同,目前原因尚不清楚[10-13]。

有研究認為,柑橘內(nèi)的黃龍病菌菌量呈現(xiàn)出明顯波動變化可能與寄主營養(yǎng)狀況和外界溫濕度變化等條件相關[14-16],但柑橘內(nèi)的黃龍病菌菌量變化與春、夏、秋、冬梢期及果實成熟期之間的關系尚無人報道。

本研究利用實時熒光定量PCR對同一地理區(qū)域內(nèi)的3個柑橘栽培品種在4個梢期和果實成熟期內(nèi)的黃龍病菌含量進行了檢測,探索病樹內(nèi)黃龍病菌在4個柑橘梢期和果實成熟期內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律,為黃龍病的綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Real-time PCR定量標準曲線的建立

插入黃龍病菌亞洲種16S rDNA的重組質(zhì)粒來自于本研究室,使用TaKaRa公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,然后將重組質(zhì)粒DNA原液按10倍梯度稀釋,使每個反應管內(nèi)的質(zhì)粒拷貝數(shù)為109、108、107、106、105、104、103、102、101個,分別以每個稀釋度的DNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測,3個重復。記錄儀器的Ct值。根據(jù)標準曲線獲得的線性回歸方程為:Y=-0.286X+11.924。Y為反應管中柑橘黃龍病菌16S rDNA靶標拷貝數(shù)的對數(shù)值,X為儀器Ct值。根據(jù)線性回歸方程計算每克病樣組織內(nèi)黃龍病菌量[17]=33.33×10-0.286X+11.924

1.2 熒光定量PCR 檢測的引物與步驟

20 μL的反應體系中引物終濃度為250 nmol/L,探針終濃度為150 nmol/L[18],緩沖液參照TaKaRa探針法實時熒光定量PCR試劑盒說明書。PCR反應程序:95℃預變性20 s;然后95℃ 5 s,58℃ 40 s,40個循環(huán)。所有的PCR試驗均以本研究室保存于防蟲網(wǎng)室內(nèi)的健康柑橘葉脈DNA為陰性對照,以保存于防蟲網(wǎng)內(nèi)的感染黃龍病的柑橘葉片為陽性對照,柑橘定期以噴粉法施用多菌靈、吡蟲啉等農(nóng)藥防控病蟲害。試驗使用儀器為Roche,LightCycler?480Ⅱ型實時熒光定量PCR。

1.3 柑橘不同梢期及果實成熟期內(nèi)含菌量變化測定

于第一年(2014年度)春梢期(2月14日、3月14日、4月15日),夏梢期(5月15日、6月16日、7月15日),秋梢期(8月15日、9月15日、10月15日),冬梢期(11月14日、12月15日)及果實成熟期(1月15日),在廣東省廣州市大豐柑橘基地內(nèi),在相似侵染環(huán)境中感染柑橘黃龍病的砂糖橘、貢柑和檸檬各8株3年生樹的成熟梢上采集病樣。每株樹采樣時先把樹冠分為東南西北四個方位,每個方位分別隨機采集兩片老熟葉片,每株樹采集8片葉片置于塑封袋,再保存于冰盒。制樣時清洗并晾干柑橘葉片,然后剪取葉片中脈放入滅菌研缽,加入液氮研磨成粉狀,從中取200 mg作為一個樣品,按Axygen基因組提取試劑盒(愛思進公司)說明書提取樣品的總基因組,最后進行實時熒光定量PCR檢測。每次采樣,每個栽培品種選擇8株樹,對每株樹分別采集樣品并檢測1次,第二年(2015年度)重復以上試驗,數(shù)據(jù)用SPSS statistics 19.0和T-test進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同梢期及果實成熟期內(nèi)砂糖橘、貢柑、檸檬內(nèi)含菌量Ct值變化

利用實時熒光定量PCR每月對病樣內(nèi)含菌量變化進行連續(xù)定量檢測。結果表明,所有被檢測樣品均顯陽性;黃龍病菌Ct值在不同梢期及果實成熟期內(nèi)有明顯的變化,第一年砂糖橘樹體含菌量平均Ct值的趨勢:春梢期>秋梢期>夏梢期>果實成熟期>冬梢期;貢柑:春梢期>夏梢期>秋梢期>果實成熟期>冬梢期;檸檬:春梢期>秋梢期>夏梢期>冬梢期>果實成熟期。表明砂糖橘、貢柑和檸檬春梢期含菌量Ct值均顯著高于夏梢期和秋梢期;夏梢期和秋梢期的含菌量Ct值又顯著高于冬梢期及果實成熟期(P<0.05);同一品種中,夏梢期與秋梢期的含菌量Ct值之間無顯著差異,冬梢期與果實成熟期含菌量Ct值之間無顯著差異(P>0.05)(圖1,表1)。第二年,同一品種的不同梢期及果實成熟期之間病原菌Ct值的對比分析結果與第一年類似(圖1,表1)。

圖1 柑橘含菌量Ct值在兩年內(nèi)的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic variation of pathogen Ct value in different diseased citrus plants in two years

栽培品種Cultivar第一年病菌含量Ct值 PathogenCtvalueinthefirstyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果實成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(28.07±1.25)aA(26.97±0.29)bB(27.06±0.44)bB(24.83±0.44)cC(25.57±0.64)cC貢柑Gonggan(27.45±1.00)aA(26.34±0.88)bB(26.27±0.8)bB(25.23±0.39)cC(25.33±0.39)cC檸檬Lemon(30.14±1.52)aA(28.59±1.15)bB(28.61±1.26)bB(26.83±0.90)cC(26.59±0.87)cC栽培品種Cultivar第二年病菌含量Ct值 PathogenCtvalueinthesecondyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果實成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(27.59±1.28)aA(25.92±1.19)bB(25.73±0.90)bB(23.85±0.95)cC(24.21±0.39)cC貢柑Gonggan(26.95±1.03)aA(25.63±1.28)bB(25.78±1.03)bB(24.24±1.37)cC(24.50±0.15)cC檸檬Lemon(29.29±1.25)aA(28.20±0.94)bAB(27.86±0.80)bBC(26.35±1.54)cC(26.58±0.56)cC

1) 同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著,不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。 Different lowercase letters and capital letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2.2 不同梢期及果實成熟期內(nèi)砂糖橘、貢柑、檸檬內(nèi)含菌量變化

根據(jù)柑橘黃龍病菌16S rDNA基因的Real-time PCR標準曲線線性回歸方程,把獲得的黃龍病菌菌量Ct值按1.1小節(jié)的方法轉化為每克植物組織內(nèi)的含菌量。第一年的平均黃龍病菌含量,砂糖橘:春梢期<秋梢期<夏梢期<果實成熟期<冬梢期;貢柑:春梢期<夏梢期<秋梢期<果實成熟期<冬梢期;檸檬:春梢期<夏梢期<秋梢期<冬梢期<果實成熟期。統(tǒng)計分析顯示:砂糖橘、貢柑和檸檬春梢期黃龍病菌含量均顯著低于夏梢期和秋梢期;夏梢期與秋梢期的黃龍病菌含量又顯著低于冬梢期及果實成熟期(P<0.05);但同一品種中,夏梢期與秋梢期的含菌量之間無顯著差異,冬梢期與果實成熟期樣品的含菌量之間也無顯著差異(P>0.05)(表2)。

第一年全年砂糖橘每克組織黃龍病菌平均含量在3.52×105～21.60×105拷貝之間,與貢柑每克組織平均含量4.76×105～17.65×105拷貝之間無顯著差異,但均顯著高于檸檬每克組織平均含菌量1.03×105～7.96×105拷貝(圖2,表2)。

第二年,每個品種不同梢期及果實成熟期之間及3個品種之間的含菌量對比分析結果與第一年的類似,但與第一年相比,3個品種中的黃龍病菌含量均有所升高,其中砂糖橘和貢柑春梢期的含菌量升高不明顯,其余生育期均明顯升高;檸檬不同梢期及果實成熟期的平均含菌量升高均不明顯。

圖2 砂糖橘、貢柑、檸檬樣品內(nèi)黃龍病菌含量在兩年內(nèi)的動態(tài)變化Fig.2 Dynamic variation of pathogen titers in different diseased citrus plants in two years

栽培品種Cultivar第一年病菌拷貝/105·g-1 Targetgenecopynumbersinthefirstyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果實成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(3.52±2.55)dA(5.50±1.02)cA(5.32±1.57)cA(21.60±5.62)aA(14.57±4.85)bA貢柑Gonggan(4.76±2.74)cA(9.48±4.71)bA(9.84±5.57)bA(17.65±5.16)aA(16.45±3.96)aA檸檬Lemon(1.03±0.95)cB(2.50±2.23)bB(2.59±2.42)bB(6.86±3.62)aB(7.96±4.21)aB栽培品種Cultivar第二年病菌拷貝/105·g-1 Targetgenecopynumbersinthesecondyear春梢期Springshootsperiod夏梢期Summershootsperiod秋梢期Autumnshootsperiod冬梢期Wintershootsperiod果實成熟期Fruitmaturationperiod砂糖橘Shatangju(4.70±2.98)cA(15.04±13.97)bA(14.59±9.22)bA(49.91±27.45)aA(34.38±9.90)aA貢柑Gonggan(7.03±5.71)cA(17.49±11.70)bA(14.69±10.20)bA(45.06±32.58)aA(27.61±2.70)aA檸檬Lemon(1.61±1.32)cB(2.84±1.57)bB(3.44±1.90)bB(12.71±11.72)aB(7.40±2.31)aB

1) 同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著,同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示在0.05水平差異顯著。 Different lowercase letters in the same row and different capital letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 討論

本研究對柑橘不同梢期及果實成熟期內(nèi)的黃龍病菌含菌量動態(tài)檢測顯示:3個廣東柑橘栽培品種春梢期的黃龍病菌含量顯著低于夏梢期與秋梢期;夏梢期與秋梢期的含菌量又顯著低于冬梢期及果實成熟期,這說明柑橘病樣內(nèi)的黃龍病菌含量變化與不同的柑橘生育期可能存在特定的關系?？赡苁且驗榇骸⑾?、秋梢期內(nèi),氣候適宜,柑橘營養(yǎng)吸收傳導能力強,樹勢旺壯,樹體強健,抑制延緩了黃龍病菌的危害;而冬梢及柑橘果實成熟的生育期內(nèi),氣候適宜度降低,樹體營養(yǎng)集中流向果實,加之冬季根系吸收能力減弱,導致病樹營養(yǎng)失衡、樹勢轉弱,從而難以抑制黃龍病的危害。檢測結果顯示,連續(xù)兩年樹體菌量波動趨勢總體相似,但不同年度同個月份的菌量波動趨勢并不完全一致,反映了不同栽培及氣候條件對菌量的影響。因此,根據(jù)黃龍病菌在不同季節(jié)梢期的自然消長規(guī)律,做好梢期栽培管理、培養(yǎng)健壯發(fā)達根系、提高柑橘營養(yǎng)吸收傳導、保證病樹的營養(yǎng)平衡、提高柑橘樹勢、促進樹體強健可能是延緩黃龍病危害的田間實用方法,值得探索。本試驗結果可為黃龍病最佳防控時期的選擇提供一定參考依據(jù),對柑橘黃龍病的防控具有一定指導意義[19-21]。

有研究認為,目前所有的商業(yè)柑橘品種對黃龍病菌均不抗病,但不同品種柑橘感染黃龍病后出現(xiàn)病癥的時間不同,癥狀嚴重程度也有所區(qū)別,其中檸檬接種黃龍病菌后病癥較輕[10-13, 22-23]。本研究使用熒光定量PCR對黃龍病菌進行定量檢測,探索了在相似侵染環(huán)境中感染柑橘黃龍病的3個柑橘品種貢柑、砂糖橘、檸檬的耐病性,結果表明:第一年砂糖橘的黃龍病菌全年平均含量與貢柑的全年平均含菌量無顯著差異,但均顯著高于檸檬的全年平均含菌量。第二年,3個品種之間的平均含菌量對比也有相似結果,但與第一年相比,3個品種的黃龍病菌含量均有所升高,其中砂糖橘和貢柑多個生育期的含菌量均顯著升高;而檸檬的含菌量升高均不顯著。這說明貢柑、砂糖橘、檸檬均不是抗黃龍病品種,但檸檬相對耐病,表現(xiàn)為植株內(nèi)的黃龍病菌菌量相對較低,病菌增速相對較慢。

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Dynamic variation ofCandidatusLiberibacter asiaticus titer in three citrus cultivars at different growth periods in Guangdong Province

Cheng Baoping, Peng Aitian, Song Xiaobing, Ling Jinfeng, Cui Yiping, Chen Xia

(PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

In order to provide references for synthetically preventing Huanglongbing disease, the dynamic variation of Huanglongbing pathogen was investigated in different growth periods of three citrus cultivars with real-time quantitative PCR detection method. The results showed that in the first year, average pathogen titers on the three citrus cultivars in spring shoots period were 3.52×105, 4.76×105, and 1.03×105copy/g, respectively, significantly lower than titers in summer shoots periods (5.50×105, 9.48×105, and 2.50×105copy/g) and autumn shoots period (5.32×105, 9.84×105and 2.59×105copy/g). Furthermore, the pathogen titers in summer shoots and autumn shoots periods were significantly lower than titers in winner shoots period (21.60×105, 17.65×105, 6.86×105copy/g) and fruit maturation period (14.57×105, 16.45×105and 7.96×105copy/g). Average pathogen titers in the Shatangju cultivars had no difference with titers in the Gonggan cultivars, but both were significantly higher than those in lemon. The data of the second year was similar to those of the first year, but the pathogen titers in the four growth periods of citrus Shatangju and Gonggan cultivars were significantly higher than those in the same period of the first year. The pathogen titers in all the 5 growth periods of lemon in the second year were samilar to that in the first year. The results showed that dynamic variation of Huanglongbing pathogen had a certain relationship to the different growth periods of citrus, lemon had higher disease tolerance, which mainly reflected in the lower titers and multiplication rate of the pathogen in the tree.

CandidatusLiberibacter asiaticus; bacteria titer; dynamic variation; different citrus cultivars

(責任編輯：楊明麗)

2016-10-09

2016-11-11

廣東省重大科技計劃專項(2014B020203003);廣東省自然科學基金(2014A030310198);廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項(2016LM1077)

S 412

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.037

* 通信作者 E-mail: pengait@163.com