李文婷,邊 斐,王翠萍,陳 高,張 燕,朱友峰,王世榮,岳壽松,*(.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山東濟(jì)南 25000; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300450)

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凝結(jié)芽孢桿菌RY237β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

李文婷1,2,邊 斐1,王翠萍1,陳 高1,張 燕1,朱友峰1,王世榮1,岳壽松1,*
(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山東濟(jì)南 250100; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300450)

為研究乳品中具有應(yīng)用價(jià)值的乳糖酶,以乳糖為唯一碳源,用鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)法,從產(chǎn)乳酸的細(xì)菌中篩選出了產(chǎn)乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性達(dá)4.98 U/mL,鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌。研究了乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì),該酶最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為50 ℃和6.0。該酶在溫度40～50 ℃具有良好的穩(wěn)定性;pH5.5～8.0表現(xiàn)穩(wěn)定,pH7.0出現(xiàn)酶活峰值。金屬離子Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Na+、Mg2+對酶活具有抑制作用,Cu2+對酶活具有完全抑制作用,EDTA對酶活具有激活作用。凝結(jié)芽孢桿菌RY237乳糖酶活性高、性能優(yōu)良,具有應(yīng)用價(jià)值。

凝結(jié)芽孢桿菌,分子鑒定,β-半乳糖苷酶,酶學(xué)性質(zhì)

乳糖酶又稱為β-半乳糖苷酶,廣泛存在于植物、微生物以及哺乳動(dòng)物腸道中。乳糖酶可催化乳糖水解為半乳糖和葡萄糖,對解決人體普遍存在的乳糖不耐具有重要意義,引起了廣泛關(guān)注[1-4]。目前只有來源于微生物的乳糖酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。產(chǎn)乳糖酶微生物種類具有多樣性,包括曲霉菌、酵母菌、放線菌、芽孢桿菌、乳酸菌等[5-9]。不同來源的乳糖酶性能有很大不同,用途也不一樣。霉菌產(chǎn)生的乳糖酶最適pH偏酸性(pH2.5～5.0),可應(yīng)用于酸性乳清和奶酪的水解;酵母菌和細(xì)菌所產(chǎn)乳糖酶最適pH近中性(分別為pH6～7和pH6.5～7.5),適于牛乳和鮮乳清的水解[10]。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)既能產(chǎn)乳酸又能形成芽孢,是一種重要的益生菌。近年有凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)乳糖酶研究的報(bào)道[11-14]。Batra等研究了從溫泉中分離的凝結(jié)芽孢桿菌RCS3乳糖酶性質(zhì),該菌在50 ℃產(chǎn)酶量最大,65 ℃酶活性最高,酶的最適pH6～7,在pH5～8范圍酶活表現(xiàn)穩(wěn)定,該酶良好的性能具有在乳品業(yè)開發(fā)的潛力[13]。宋春雷等對凝結(jié)芽孢菌桿菌L42產(chǎn)乳糖酶條件進(jìn)行優(yōu)化,總酶活力提高了10.8倍,達(dá)到7.1 U/mL,L42產(chǎn)酶最佳發(fā)酵溫度為50 ℃,該酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃,最適pH6.0[12]。Levin等報(bào)道,凝結(jié)芽孢桿菌L4的最適溫度為55 ℃,其最適pH在30 ℃和55 ℃分別為6.0和6.5[14]。由此可見,凝結(jié)芽孢桿菌乳糖酶性質(zhì)因菌株不同特點(diǎn)不同。因此,篩選具有高活性乳糖酶的凝結(jié)芽孢桿菌資源,研究乳糖酶性質(zhì),具有理論和實(shí)踐意義。

本研究對實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)乳酸菌株進(jìn)行乳糖酶篩選,鑒定了產(chǎn)乳糖酶能力強(qiáng)的菌株,并研究了乳糖酶性質(zhì),為該菌種的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)乳酸菌株LP1119、LP777、LP738、LC544、LC 868、LC 727、RY 237和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD18-T載體 TakaRa公司;pET28a(+) Novagen公司;鄰硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG,色譜純) Bio Basic Inc公司(上海生物工程有限公司分裝);鄰硝基苯酚(ONP,色譜純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ONPG磷酸鹽緩沖液 0.6025 g ONPG溶于100 mL磷酸鹽緩沖溶液;pH7.0磷酸鹽緩沖溶液 13.6 g磷酸二氫鈉、0.06 g硫酸鎂、0.126 g氯化錳溶于1L水;檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液 0.1 mol/L檸檬酸與0.2 mol/L磷酸氫二鈉混合;0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 0.2 mol/L的醋酸和0.3 mol/L的醋酸鈉混合后稀釋一倍;0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液 0.2 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L的氫氧化鈉混合;乳糖MRS(L-MRS)培養(yǎng)基(g/L) 牛肉膏10,酵母膏5,蛋白胨10,檸檬酸氫二銨2,磷酸氫二鉀2,乳糖20,MnSO4·H2O 0.23,MgSO4·7H2O 0.58,無水乙酸鈉5 g,吐溫-80 1 mL,pH6.4。

冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司;PCR儀 日本Takara公司;UP200s型超聲波破碎儀 德國Dr.Hielscher公司;TSQ-280型立式搖床 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;723型可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取6支試管分別加入200 μg/mL的ONP溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)足至1 mL。37 ℃水浴10 min。分別加入4 mL 0.5 mol/L Na2CO3。以第一只試管為空白,測OD420。以O(shè)NP濃度(mmol/L)為縱坐標(biāo),OD420為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3β-D-半乳糖苷酶活性的測定

1.3.1 酶的發(fā)酵與提取 將菌株接種于L-MRS培養(yǎng)基,37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)液4 mL,4 ℃、7000 r/min離心15 min,棄上清。菌體用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)洗滌、7000 r/min離心15 min。重復(fù)兩次。收集菌體并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)添加至4 mL,60 W超聲破碎15 min后于4 ℃、12000 r/min離心5 min,取上清液測酶活。

1.3.2 酶活性測定 取1 mL酶提取液,37 ℃水浴預(yù)熱5 min,加入已預(yù)熱至37 ℃的含20 mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液1.0 mL,37 ℃水浴反應(yīng)10 min,然后立即加入3 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),測OD420。以65 ℃加熱失活的酶液作為空白對照。一個(gè)酶活力單位(U)定義為:37 ℃條件下,1 min水解產(chǎn)生1 μmol ONP所需要的酶量。乳糖酶活力計(jì)算公式如下:

X=(C×20×N)/10,其中,X為乳糖酶活力;C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的ONP濃度;N為稀釋倍數(shù)。

1.4 菌株生理生化反應(yīng)

生理生化特性測定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法[15]。

1.5 16S rDNA基因的克隆、測序

菌株基因組DNA提取參照《精編分子生物學(xué)指南》[16]的方法略有改動(dòng)。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA通用引物。上游P1:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,下游P2:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3。以菌株基因組為模板,P1、P2為引物,PCR擴(kuò)增16S rDNA。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,選取正確的陽性克隆送上海生工測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將16S rDNA序列與GenBank里的已知核酸序列進(jìn)行BLAST分析。選取與該序列同源性較高的已知菌株的16S rDNA序列,利用MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.7β-D-半乳糖苷酶酶學(xué)性能

1.7.1 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性 最適反應(yīng)溫度:200 μL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋的酶液,30、40、50、60、70 ℃保溫5 min,同時(shí)將200 μL ONPG溶液依次在相同溫度下保溫5 min,將ONPG加入到酶液中,在各溫度下反應(yīng)10 min,加入600 μL Na2CO3終止反應(yīng)。計(jì)算各時(shí)間酶活與最高酶活的百分比,確定酶最適反應(yīng)溫度。

酶的熱穩(wěn)定性:200 μL磷酸鹽緩沖液稀釋的酶液,40、50、60、65 ℃保溫0、10、20、30、40、50 min。同時(shí)將200 μL ONPG溶液依次在相同溫度下進(jìn)行保溫,將ONPG加入到粗酶液中,37 ℃反應(yīng)10 min,加入600 μL Na2CO3終止反應(yīng),測OD420,以65 ℃加熱失活的酶液作為空白對照,以0時(shí)間酶活為100%,計(jì)算各時(shí)間酶活與最高酶活百分比。

1.7.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH:在最適溫度下,按1.3.2酶活測定方法,測定pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0條件下酶活性。計(jì)算各pH酶活與最高酶活的百分比,確定酶最適反應(yīng)pH。

pH穩(wěn)定性:將酶液分別置于pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的緩沖溶液中,37 ℃放置18 h,測定各pH條件下的酶活,以最高酶活為100%,計(jì)算各pH酶活與最高酶活百分比,測定酶的pH穩(wěn)定性[17-18]。

1.7.3 金屬離子和EDTA對酶活的影響 在酶促反應(yīng)體系中加入1 mol/L的Mn2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、EDTA溶液,使最終反應(yīng)體系中金屬離子的濃度為1 mmol/L,測定酶活力以加熱失活的酶液作為空白對照。不加金屬離子溶液的酶活作為對照,計(jì)算相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 ONPG標(biāo)準(zhǔn)曲線

以光密度OD420為橫坐標(biāo),ONP濃度為縱坐標(biāo)繪制乳糖酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)R2=0.998(圖1),說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于乳糖酶的測定。

圖1 β-半乳糖苷酶活性測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of β-galactosidase

2.2 產(chǎn)乳酸菌株的乳糖酶活性

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Unrooted phylogenetic tree based on the 16S rDAN sequence

將RY237、LC777、LP272、LP119、LC868,LP554和LC738菌株L-MRS培養(yǎng)基液體培養(yǎng)24 h,由于不同菌株培養(yǎng)液的光密度OD600存在差異,以光密度最低的菌株OD值0.7為標(biāo)準(zhǔn),把各菌株培養(yǎng)液的OD600調(diào)節(jié)為0.7,然后利用1.3.1中酶的提取方法收集菌體,磷酸緩沖液洗滌兩次,重新懸浮,超聲波破碎,離心取上清液測定各菌株酶活。結(jié)果表明,各菌株酶活高低依次為RY237(4.98 U/mL)、LC777(0.34 U/mL)、LP272(0.28 U/mL)、LP119(0.11 U/mL)、LC868(0.08 U/mL),LP554和LC738沒有檢測到乳糖酶活性(圖2)。關(guān)于乳酸菌乳糖酶報(bào)道較多,酶活一般在5 U/mL以下[17-20],RY237乳糖酶活性明顯高于已報(bào)道的乳糖酶,說明具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

圖2 不同菌株乳糖酶活性Fig.2 Activity of β-galactosidase in different strains

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化特征 菌株生長特征為:可以在15～55 ℃下生長,NaCl 7%時(shí)生長被抑制。生理生化反應(yīng)結(jié)果表明,RY237菌株能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,明膠不液化,能水解酪素和淀粉,不能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽,V-P實(shí)驗(yàn)陽性,接觸酶和過氧化氫酶陽性,卵黃反應(yīng)和吲哚產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)陰性,可發(fā)酵甘露糖、阿拉伯糖。菌株RY237生長特征和生理生化特性與凝結(jié)芽孢桿菌的特征吻合[15]。

表1 菌株RY237生理生化特征Table 1 Biological and physiological characteristics of strain RY 237

注:“+”,陽性反應(yīng);“-”,陰性反應(yīng)。

2.3.2 分子鑒定 測序結(jié)果表明,RY237菌株16S rDNA序列全長1450 bp。將該序列提交NCBI進(jìn)行BLAST,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)同源性最高,達(dá)99%。根據(jù)同源性比對結(jié)果,選出相關(guān)性較高和芽孢桿菌屬內(nèi)相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示其與Bacilluscoagulans聚為一族(圖3)。結(jié)合生理生化特征及16S rDNA分子鑒定結(jié)果,將RY237鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌,命名為BacilluscoagulansRY237。

2.4 RY237乳糖酶最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

酶最適反應(yīng)溫度是酶的重要性能,乳糖酶商業(yè)應(yīng)用中一般要求酶的最適溫度為37 ℃或更高[21]。本研究在pH7.0條件下,按照1.3.1對RY327提取乳糖酶,測定30～70 ℃范圍內(nèi)乳糖酶活性變化。結(jié)果表明,酶活性隨溫度升高而先增加后減少,40 ℃酶活上升到較高水平(最高值的90.6%),50 ℃酶活最高,60 ℃酶活為最高值的72.8%,之后快速下降,至70 ℃已檢測不到酶活(圖4)。由此可以確定菌株R237乳糖酶的最適溫度為50 ℃。該值與已報(bào)道的凝結(jié)芽孢桿菌乳糖酶的最適反應(yīng)溫度有所不同,鄭兆娟等報(bào)道凝結(jié)芽孢菌桿菌L42最適反應(yīng)溫度為65 ℃[11],另有最適反應(yīng)溫度為63 ℃[13]和55 ℃[14]的報(bào)道。說明RY327乳糖酶的性能與已報(bào)道的菌株性能不同。

圖4 不同溫度下乳糖酶活性變化Fig.4 Effect of temperature on activity of β-galactosidase

將酶分別置于40、50、60、65 ℃不同時(shí)間(10～50 min)測定酶活性。以最高值為100%,計(jì)算各溫度不同保溫時(shí)間的相對酶活。結(jié)果表明,乳糖酶活性在40 ℃和50 ℃具有較好的穩(wěn)定性,保溫30 min,酶活仍保持最高值90%以上(分別為92.1%和90.1%)。60 ℃穩(wěn)定性下降,保溫30 min,酶活只有最高值的62.8%;65 ℃酶活急劇下降,保溫20 min酶活僅為最高值的2.5%,至30 min已檢測不到酶活,說明該酶對熱敏感(圖5)。

圖5 乳糖酶熱穩(wěn)定性Fig.5 Termostability of β-galactosidase

2.5 RY237乳糖酶最適pH與pH穩(wěn)定性

按照1.3對RY327提取乳糖酶和乳糖酶的活性測定,圖6表明酶最適pH為6.0。乳糖酶最適pH決定了其不同用途,霉菌產(chǎn)生的乳糖酶最適pH偏酸性(pH2.5～5.0),可應(yīng)用于酸性乳清和奶酪的水解;酵母菌和細(xì)菌所產(chǎn)乳糖酶的最適pH近中性(分別為pH6～7和pH6.5～7.5),適于牛乳(pH6.6)和鮮乳清(pH6.1)的水解[10]。該結(jié)果說明凝結(jié)芽孢桿菌RY237在乳制品水解領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。

圖6 不同pH條件下乳糖酶酶活變化Fig.6 Effect of pH on activity of β-galactosidase

將酶液在不同的pH緩沖溶液中37 ℃保溫18 h,測定各pH條件下的酶活性,計(jì)算相對酶活。結(jié)果表明,酶在pH7.0酶活最高,最穩(wěn)定。37 ℃、pH5.5～8.5維持18 h,酶活保持80%以上(圖7),說明該酶在pH5.5～8.0范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性,該酶pH適應(yīng)范圍寬泛,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖7 乳糖酶pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of β-galactosidase

2.6 金屬離子和EDTA對乳糖酶活性的影響

圖8 金屬離子和EDTA對乳糖酶活力的影響Fig.8 Effect of metalic ions and EDTA on β-galactosidase activity

金屬離子對酶活具有激活或抑制作用,按照1.3.1對RY327提取乳糖酶,測定了金屬離子Mn2+、Mg2+、Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+對乳糖酶活性的影響。結(jié)果表明,上述7種金屬離子對酶活均有抑制作用,其中Cu2+對酶活具有完全抑制作用,剩余酶活依次分別為Ca2+(52.6%)、K+(57.6%)、Zn2+(59.4%)、Mn2+(61.8%)、Na+(64.1%)、Mg2+(72.7%)。EDTA對乳糖酶活具有激活作用(110.8%),可能在于EDTA對酶活性位點(diǎn)具有保護(hù)作用(圖8)。高曉峰研究植物乳桿菌產(chǎn)生的乳糖酶,金屬離子Mg2+、Mn2+對酶活性具有顯著的激活作用,而Cu2+、EDTA對酶活有較強(qiáng)的抑制作用[22]。說明酶的來源不同,性能不同。上述結(jié)果可作為酶活性調(diào)節(jié)與控制的理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究以乳糖為唯一碳源,利用ONPG作為底物,從產(chǎn)乳酸的細(xì)菌中篩選出了產(chǎn)乳糖酶活力高的菌株RY237,鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)RY237。研究了RY237乳糖酶的性質(zhì),結(jié)果表明,該酶在溫度40～50 ℃具有較高的酶活性(酶活為90.6%～100%),最適反應(yīng)溫度為50 ℃,低于已報(bào)道的凝結(jié)芽孢桿菌乳糖酶的最適反應(yīng)溫度,而且該酶在40～50 ℃具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性,說明其在高酶活區(qū)保持穩(wěn)定的性能,具備良好生產(chǎn)潛力。該酶的最適pH為6.0,7.0最穩(wěn)定,適于牛乳和乳清的水解。金屬離子對酶活抑制作用的影響為Cu2+>Ca2+>K+>Zn2+>Mn2+>Na+>Mg2+,Cu2+對酶活具有完全抑制作用,EDTA對乳糖酶活具有激活作用。因此,凝結(jié)芽孢桿菌RY237乳糖酶具有新穎性和較好的應(yīng)用潛力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究和開發(fā)乳糖酶提供了理論依據(jù)。

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Characterization ofβ-galactosidase fromBacilluscoagulansRY237

LI Wen-ting1,2,BIAN Fei1,WANG Cui-ping1,CHEN Gao1,ZHANG Yan1, ZHU You-feng1,WANG Shi-rong1,YUE Shou-song1,*

(1.Bio-Tech Research Center,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China; 2.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300450,China)

A novel lactase-producing bacterium RY237 was selected based onβ-galactosidase activity using lactose as sole carbon media,and was identified asBacilluscoagulansRY327. The activity of lactase reached 4.98 U/mL. The optimum temperature and optimum pH ofβ-galactosidase were 50 ℃ and 6.0,respectively. The enzyme was stable at pH5.5～8.0,with peak activity at pH7.0,and it was also stable at 40～50 ℃. The activity ofβ-galactosidase was inhibited by Ca2+,K+,Zn2+,Mn2+,Na+,Mg2+and completely inhibited by Cu2+. Its activity was promoted by ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA). The high activity,thermostability and pH-stability make this enzyme potentially useful in dairy industry.

Bacilluscoagulans;molecular identification;β-galactosidase;enzymatic characterization

2017-01-03

李文婷(1992-),女,碩士研究生,研究方向:發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā),E-mail:liwentinghaoye@163.com。

*通訊作者:岳壽松(1965-),男,博士,研究員,研究方向:微生物資源,E-mail:yueshousong@163.com。

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2017A01和CXGC2016B13);山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016GGH3111)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0111-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.022