大鼠灌胃朱砂與復(fù)方牛黃消炎膠囊后汞的藥代動(dòng)力學(xué)研究

宋曉妮　陸宇婷　楊丹億　汪生　杭太俊　宋敏

[摘要]復(fù)方牛黃消炎膠囊作為清熱解毒、鎮(zhèn)靜消炎的經(jīng)典復(fù)方，朱砂是其發(fā)揮藥效的主要成分之一。該實(shí)驗(yàn)采用HNO3HClO4消解體系結(jié)合冷原子原子熒光光譜（CVAFS）分析技術(shù)檢測(cè)大鼠全血中的汞元素。研究大鼠灌胃給藥不同劑量朱砂和復(fù)方牛黃消炎膠囊后，全血中汞的藥代動(dòng)力學(xué)行為，探討中藥復(fù)方配伍對(duì)汞體內(nèi)代謝過(guò)程的影響。研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃高、中、低3個(gè)劑量朱砂和復(fù)方牛黃消炎膠囊后，全血中汞均呈非線(xiàn)性藥代動(dòng)力學(xué)特征。大鼠灌胃復(fù)方牛黃消炎膠囊后，與單味朱砂相比，全血中汞元素的tmax，Ke，CL/F顯著降低，Cmax/dose，AUC/dose，t1/2顯著增加，Vz/F，MRT不存在顯著差異，提示經(jīng)復(fù)方配伍后，汞元素在全血中吸收的總量顯著增加且吸收速度加快，但消除速度減慢，提示長(zhǎng)期服用可能會(huì)引起汞在體內(nèi)的蓄積。

[關(guān)鍵詞]朱砂； 復(fù)方牛黃消炎膠囊； 汞； 全血； 冷原子原子熒光光譜（CVAFS）

[Abstract]Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule was a classical compound prescription with the efficacy of heatclearing， detoxification， sedation and antiinflammation， with cinnabaris as one of its active ingredients The study focuses on the pharmacokinetics of mercury in rats after oral administration of cinnabaris and Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule， in order to explore the effect of combined traditional Chinese medicines on mercury metabolism In this study， the method of nitricperchloric acid digestion system coupled with cold atomicatomic fluorescence spectroscopy （CVAFS） was adopted to accurately determine mercury in whole blood of rats Fufang Niuhueng Xiaoyan capsule had three dose schemes of oral administration， namely equivalent clinical dose， 3 times of equivalent clinical dose and 10 times of equivalent clinical dose； And the doses of oral administration of cinnabaris was calculated according to that of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule SPF grade healthy SD rats were fasted overnight before the oral administration with cinnabaris suspension （or Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule suspension） After oral administration of different doses of cinnabaris， no obvious changes in tmax and MRT were observed， while Cmax/dose， AUC048 h/dose and AUC0∞/dose decreased with the increase in dose， indicating that total mercury absorption in body was declining As the dose increased， Ke， CL/F decreased， and t1/2 increased， indicating that the elimination slowed down， and mercury metabolism showed nonlinear dynamic characteristics within a certain range of dose （22220 mg·kg-1） The total mercury metabolism in the whole blood of rats after oral administration with different doses of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule also showed nonlinear dynamic characteristics The results were correlated with the low solubility of cinnabaris in the body Compared with cinnabaris， Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule showed no obvious changes in V/F and MRT， while Ke， CL/F， tmax decreased， and t1/2， Cmax/dose， AUC048 h/dose， AUC0∞/dose increased significantly The results showed that Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule accelerated absorption， slowed down elimination and improved the total absorption of mercury in the whole blood， indicating that Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule may contain components for promoting absorption and alleviating elimination of mercury Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule had an impact on the pharmacokinetics of cinnabaris， and longterm administration of cinnabaris （Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule） was possible to cause accumulation of mercury in the body This study could explain changes in efficacy of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule， evaluate the rationality of compound medicines containing toxic elements and provide scientific basis for the rational and safe use of Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule

[Key words]cinnabaris； Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule； mercury； blood； cold atomfluorescence spectroscopy （CVAFS）

復(fù)方牛黃消炎膠囊（Fufang Niuhuang Xiaoyan capsule）作為清熱解毒、鎮(zhèn)靜消炎的中成藥，歷經(jīng)數(shù)百年的流傳應(yīng)用，發(fā)展成為目前《中國(guó)藥典》收載的由人工牛黃、黃芩、梔子、朱砂、珍珠母、郁金、雄黃、冰片、石膏、水牛角濃縮粉、鹽酸小檗堿11味中藥加工成的復(fù)方制劑[1]。作為含汞（朱砂）的中成藥，其用藥的安全性值得關(guān)注，因服用含朱砂中成藥而發(fā)生的中毒事件時(shí)有發(fā)生[23]。由此可見(jiàn)，探討中成藥中復(fù)方配伍對(duì)汞代謝的影響是十分有必要的。

目前，對(duì)于中藥中朱砂的的研究主要針對(duì)單味朱砂的慢性毒性研究[4]，但對(duì)朱砂中汞的藥代動(dòng)力學(xué)報(bào)道較少[5]，僅進(jìn)行朱砂高劑量單次給藥試驗(yàn)[6]，對(duì)中藥復(fù)方配伍對(duì)汞體內(nèi)代謝變化的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用HNO3HClO4消解體系結(jié)合冷原子原子熒光光譜（CVAFS）分析技術(shù)，對(duì)朱砂及復(fù)方牛黃消炎膠囊在大鼠體內(nèi)的汞的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行比較研究。

1材料與方法

11儀器AF610 D冷原子原子熒光光譜儀（北京瑞利分析儀器公司），AF2型汞元素?zé)晒饪招年帢O燈，Explorer超純水機(jī)（上海沉黃科學(xué)儀器有限公司），BS 21s型1/10萬(wàn)天平（德國(guó)賽多利斯公司），BS 110s型1/萬(wàn)天平（天津市泰斯特儀器有限公司），高級(jí)臺(tái)式封閉電爐（天津市泰斯特儀器有限公司），所有玻璃儀器均用20%的硝酸浸泡24 h以上，并用超純水洗凈。

12藥品與試劑復(fù)方牛黃消炎膠囊（牛黃消炎靈膠囊）（云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)WLKA1307）經(jīng)冷原子原子熒光光譜法測(cè)定（n=3）汞含量為680%，水飛朱砂（鳳凰縣紅飛藥用朱砂有限責(zé)任公司，批號(hào)20160101）經(jīng)冷原子原子熒光光譜法測(cè)定（n=3）汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8524%，含量均以汞元素計(jì)。汞單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW08617 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)15031），硝酸、高氯酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)儀器有限公司，優(yōu)級(jí)純），超純水（1825 MΩcm，Explorer SERIES Water Purification System，上海沉黃科學(xué)儀器有限公司），重鉻酸鉀（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純），氫氧化鉀（南京化學(xué)試劑有限公司，分析純），硼氫化鉀（純度>95%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2方法

21復(fù)方牛黃消炎膠囊與水飛朱砂灌胃溶液取復(fù)方牛黃消炎膠囊內(nèi)容物適量，研成細(xì)粉，混勻，以05% CMCNa分別制成質(zhì)量濃度為15（臨床等效劑量組），45，150 g·L-1的混懸液，給藥前充分振搖使之分散均勻；取水飛朱砂適量，研成細(xì)粉，以05% CMCNa分別制成質(zhì)量濃度為11，33，110 g·L-1的混懸液，給藥前充分振搖使之分散均勻。

22儲(chǔ)備液制備精密量取汞單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 g·L-1）05 mL至100 mL量瓶中，加5% HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀釋?zhuān)ㄈ莺髶u勻，得5 mg·L-1的儲(chǔ)備液I；精密量取1 mL的儲(chǔ)備液Ⅰ至50 mL量瓶中，加5% HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀釋?zhuān)ㄈ莺髶u勻，得100 μg·L-1的儲(chǔ)備液Ⅱ，置4 ℃保存，臨用前用5%HNO3005% K2Cr2O7水溶液稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作液。

23動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，8～12周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）20130006。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25 ℃，濕度在50%～60%。換氣次數(shù)每小時(shí)20次以上，12 h照明。實(shí)驗(yàn)前禁食過(guò)夜（12 h），自由飲水（去離子水）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼料和使用指導(dǎo)原則，并通過(guò)中國(guó)藥科大學(xué)倫理委員會(huì)的同意。

24氫化合物發(fā)生原子熒光的條件以2%的硝酸溶液為載流；01% KBH402% KOH的水溶液為還原劑；蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速為100 r·min-1；載氣流量400 mL·min-1；輔助氣流量400 mL·min-1；負(fù)高壓-270 V；主燈電流30 mA；原子化器溫度：冷原子（低溫，200 ℃）。

25全血樣品的處理取全血02 mL，置50 mL凱氏燒瓶中，加入HNO3HClO4（4∶1）5 mL，混勻，過(guò)夜。次日置電熱板上，于120～140 ℃加熱，保持微沸，必要時(shí)補(bǔ)加HNO3適量，加熱至溶液澄清透明，溶液體積約1 mL，停止加熱，取下放冷。用5% HNO3005% K2Cr2O7轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。同法制備空白溶液。

26動(dòng)物實(shí)驗(yàn)72只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分為6組，禁食過(guò)夜后灌胃復(fù)方牛黃消炎膠囊混懸液（或朱砂混懸液），于給藥后0，025，05，075，1，15，2，3，4，6，8，12，24，36，48 h于大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血02 mL至含有肝素鈉的離心管中，置-80 ℃保存待測(cè)。按人和動(dòng)物間體表面積折算設(shè)計(jì)給藥劑量，復(fù)方牛黃消炎膠囊混懸液的3個(gè)濃度水平對(duì)應(yīng)3個(gè)不同的灌胃劑量，分別相當(dāng)于成人的臨床等效劑量（03 g·kg-1），3倍臨床等效劑量（09 g·kg-1），10倍臨床等效劑量（30 g·kg-1）。按照復(fù)方牛黃消炎膠囊處方中朱砂的含量（以生藥計(jì)）進(jìn)行折算，設(shè)計(jì)朱砂的給藥劑量。

3結(jié)果

31標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和定量限分別取500 μg·L-1的汞單元素溶液儲(chǔ)備液10，20，40，80，160 μL至50 mL的凱氏燒瓶中，然后按照25項(xiàng)方法進(jìn)行操作，得到質(zhì)量濃度分別為5，10，25，50，100，200，400 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)全血樣品。以汞元素的峰面積（Y）對(duì)血藥濃度（X，μg·L-1）進(jìn)行直線(xiàn)回歸。在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)全血中汞元素的線(xiàn)性響應(yīng)良好，回歸方程為Y=304X+73936（r=0999 6），定量下限為5 μg·L-1。

32回收率、精密度和準(zhǔn)確度考察了血藥濃度5，10，25，100 μg·L-1的加樣回收率（n=6）。結(jié)果均在9720%～1091%，均值為（1046±41）%。CVAFS測(cè)定的批間跟批內(nèi)精密度良好，RSD分別在40%～95%，32%～88%。準(zhǔn)確度良好（表1）。

33穩(wěn)定性考察了全血樣品（5，10，25，100 μg·L-1）-80 ℃冰箱放置的穩(wěn)定性，凍融穩(wěn)定性以及消解結(jié)束后配制的樣品溶液室溫放置穩(wěn)定性。結(jié)果表明全血樣品在-80 ℃冰箱冰凍保存24 h，反復(fù)凍融3次，消解結(jié)束后樣品溶液室溫放置45 h的穩(wěn)定性均良好，滿(mǎn)足測(cè)定需要。

34藥代動(dòng)力學(xué)研究采用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法測(cè)定全血中汞元素的濃度，并設(shè)置低、中、高濃度的質(zhì)控樣品（含汞單元素質(zhì)量濃度分別為5，25，100 μg·L-1）。采用WinNonlin 21處理血藥濃度數(shù)據(jù)，達(dá)峰濃度和達(dá)峰時(shí)間采用實(shí)測(cè)值。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)tmax，t1/2，Ke，MRT進(jìn)行MannWhitney

U檢驗(yàn)，對(duì)lncmax/dose，lnAUC048 h/dose，lnAUC0∞/dose，lnVz/F，lnCL/F進(jìn)行t檢驗(yàn)。

35汞元素總量的分析大鼠灌胃高、中、低劑量朱砂和復(fù)方牛黃消炎膠囊后，其血藥濃度時(shí)間曲線(xiàn)如圖1～3。從圖中可以看出在給藥后的05～8 h全血中汞含量較高，隨后降低并趨于平穩(wěn)，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

4討論

汞對(duì)巰基有高度的親和力，血液中95%左右的巰基存在于紅細(xì)胞，故汞可迅速結(jié)合紅細(xì)胞，同時(shí)汞離子還與富含巰基的白蛋白結(jié)合[7]，所以汞在血漿跟血細(xì)胞中均有分布，而血細(xì)胞中汞的含量更高，因此選擇全血作為研究汞在血液中動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的生物樣品。

大鼠灌胃不同劑量朱砂或相當(dāng)劑量復(fù)方牛黃消炎膠囊后，隨著劑量的增加，全血中汞的Cmax/dose，AUC/dose，Ke均顯著降低，t1/2顯著增加，說(shuō)明在此劑量范圍內(nèi)（22～220 mg·kg-1），全血中汞的代謝呈現(xiàn)非線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)特征，隨著劑量的增加汞吸收的相對(duì)量變少，可能是因?yàn)橹焐盀殡y溶性藥物，在人體內(nèi)的溶解度不會(huì)隨著劑量的增加而增加。Ke顯著降低，t1/2，CL/F顯著增加，說(shuō)明隨著劑量的增加全血中汞的消除變慢。

復(fù)方牛黃消炎膠囊組與單味朱砂組相比，配伍后tmax顯著提前，說(shuō)明復(fù)方配伍加快了全血中朱砂的吸收速度。汞吸收加快，可能是因?yàn)閺?fù)方中冰片的存在，冰片作為使藥，具有促透作用[8]，同時(shí)黃芩的主成分黃芩素能夠提高細(xì)胞膜的親水性[9]，也可能提高藥物的吸收速度。配伍后Cmax/dose，AUC/dose顯著增加，說(shuō)明復(fù)方配伍增加了汞元素在全血中的總量，原因可能是黃芩中的黃芩苷與汞結(jié)合，從而提高汞元素在體內(nèi)的溶出[10]。配伍后Ke和CL/F顯著降低，t1/2顯著增加，說(shuō)明復(fù)方配伍減慢了朱砂在體內(nèi)的消除，增加了汞在體內(nèi)蓄積的可能，長(zhǎng)期服用可能會(huì)引起汞在體內(nèi)的蓄積?？傊?，朱砂中的汞經(jīng)復(fù)方牛黃消炎膠囊中多味中藥配伍后，加快了吸收的速度和程度而減慢了消除，增加了汞在全血中的暴露總量，而對(duì)此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因以及結(jié)合藥效分析配伍的合理性將有待進(jìn)一步探索。

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[責(zé)任編輯張燕]