楊移斌，胥寧，董靖，楊秋紅，劉永濤，艾曉輝

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430223；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100141)

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斑點(diǎn)叉尾鮰病原中溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性分析

楊移斌1,2,3，胥寧1,2,3，董靖1,2,3，楊秋紅1,2,3，劉永濤1,2,3，艾曉輝1,2,3

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430223；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100141)

對患出血病斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行病原分離、鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，以期為斑點(diǎn)叉尾鮰出血病的防控提供參考。從患病斑點(diǎn)叉尾鮰血水、腹水及重要組織器官中分離純化病原菌，并進(jìn)行分離株理化特性測定、gyrB序列分析及回歸感染實(shí)驗(yàn)，并通過K-B法進(jìn)行分離菌株藥物敏感性分析。結(jié)果顯示，回歸感染實(shí)驗(yàn)魚出現(xiàn)與自然發(fā)病類似癥狀，并經(jīng)細(xì)菌再分離獲得相同分離株，表明分離株是引發(fā)本次斑點(diǎn)叉尾鮰疾病的病原菌。分離株理化特性與溫和氣單胞菌基本一致，gyrB基因序列分析分離株與溫和氣單胞菌同源性達(dá)100%，故分離株鑒定為溫和氣單胞菌。分離株對多西環(huán)素及頭孢噻肟高度敏感，對氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星中度敏感。分離菌株是斑點(diǎn)叉尾鮰病原菌，緊急時(shí)可選用多西環(huán)素等藥物進(jìn)行防控。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(4):45-50]

斑點(diǎn)叉尾鮰；溫和氣單胞菌；分離鑒定；藥敏特性；回歸感染實(shí)驗(yàn)

斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalunespunctatus)又名溝鯰、美洲鯰等，其分類地位為于鯰形目(Siluriformes)、鮰科(Ictaluridae)[1]。自1984年由湖北水產(chǎn)科研機(jī)構(gòu)引入中國養(yǎng)殖推廣[2]，因其適應(yīng)中國養(yǎng)殖環(huán)境，并具有無肌間刺、肉質(zhì)鮮美及營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，迅速在國內(nèi)掀起養(yǎng)殖熱潮。目前斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖區(qū)域遍布全國幾十個(gè)省市，養(yǎng)殖總量不斷上升，形成了一個(gè)完整的產(chǎn)業(yè)鏈。但由于養(yǎng)殖過程中環(huán)境惡化，養(yǎng)殖技術(shù)水平跟不上產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[3-6]，大規(guī)模病害時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成了較大經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。2015年9月湖北仙桃某養(yǎng)殖場出現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰大規(guī)模死亡的病例。斑點(diǎn)叉尾鮰死亡呈暴發(fā)性，發(fā)病迅速，死亡快，死亡率高約為20%，死亡規(guī)格多為1.2～1.5 kg。其主要癥狀表現(xiàn)眼球突出，胸鰭腹鰭及頭部有出血，黏液增多，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)腎臟充血發(fā)黑，肝臟呈土灰色，脾臟黑色，腹腔有大量血水積聚，腸道出現(xiàn)紅腫無食物。取病魚腹水及血水分離純化出了1株優(yōu)勢菌，本研究對該優(yōu)勢菌進(jìn)行病原學(xué)分析、鑒定及藥敏特性研究，以期為斑點(diǎn)叉尾鮰病害防控增添新的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰取自湖北仙桃某養(yǎng)殖場；感染用斑點(diǎn)叉尾鮰(50～75 g)購置武漢白沙洲水產(chǎn)市場，體格健壯，活力強(qiáng)，無傷病，取暫養(yǎng)7 d無異常的活躍健康魚用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯、MH瓊脂、BHI液體培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 所用試劑、特異性引物及細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化

取體表嚴(yán)重出血的的斑點(diǎn)叉尾鮰數(shù)尾，在無菌環(huán)境下取血水、腹水及肝腎脾腸等用于細(xì)菌分離，用無菌接種環(huán)蘸取劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板上， 置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)大小、顏色均一，優(yōu)勢度較高的菌落再純化，分離得到優(yōu)勢菌1株，將其與25%甘油混勻后，于-80 ℃冰箱保藏。

1.2.2 回歸感染

將純化細(xì)菌接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)18 h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并調(diào)整菌懸液濃度[7]依次為2.8×104、2.8×105、2.8×106、2.8×107及2.8 × 108CFU/mL。

取健康的斑點(diǎn)叉尾鮰，分為A、B、C、D、E及F組，每組10尾實(shí)驗(yàn)魚，每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其中F組為對照組。實(shí)驗(yàn)過程中，溶氧6.0～7.5 mg/L，水溫23～26 ℃，隔日換水，水質(zhì)良好，不喂食。實(shí)驗(yàn)A、B、C、D、E組于腹鰭基部分別注射2.8 × 108～2.8 × 104CFU/mL不同濃度菌液0.1mL/尾，對照組F注射等量0.65%無菌生理鹽水。每6 h觀察斑點(diǎn)叉尾鮰活動(dòng)情況，同時(shí)記錄發(fā)病死亡斑點(diǎn)叉尾鮰，并進(jìn)行解剖觀察及細(xì)菌的再分離。

1.2.3 理化特性測定

將分離菌株接種于NA平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行革蘭氏染色，采用細(xì)菌生化微量鑒定管，參照文獻(xiàn)[8]測定生理生化指標(biāo)。具體指標(biāo)如下：硫化氫、運(yùn)動(dòng)性、M.R反應(yīng)、V-P 反應(yīng)、產(chǎn)生吲哚、KCN生長、鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、麥芽糖、鼠李糖、檸檬酸鹽、丙二酸鹽、半乳糖、甘油、尿素、山梨醇、阿拉伯糖、纖維二糖、明膠液化、D-葡萄糖產(chǎn)酸、D-葡萄糖產(chǎn)氣、D-甘露醇、D-甘露糖。

1.2.4 細(xì)菌分子鑒定

1.2.4.1gyrB基因分析 引物參照Yamamoto等[9]為UP1(正向引物)：5′-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCNGGN GGN AAR TTY GA-3′，UP2(反向引物)：5′-AGCAGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCNGCR TCN GTCAT-3′。其中，Y、N、R為混合堿基符號Y，表示C+T；N表示A+C+G+T；R表示A+G。PCR 反應(yīng)條件為參照邴旭文等[10]。擴(kuò)增片段直接送生工生物工程(上海)股份有限公司純化測序。

1.2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將純化菌株gryB基因與NCBI中已有序列進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果檢索出同源性較高的序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.2.5 藥敏特性分析

將純化得到的細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28 ℃振蕩(200 r/min)培養(yǎng)18 h后，調(diào)整菌液濃度為3.2×107CFU/mL。取150 μL菌液均勻涂布于MH平板上，等距離貼上不同藥物的藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)，確定致病菌株對藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

本研究從患病魚血水、腹水中分離到同一株優(yōu)勢菌，暫命名ah01。ah01株置于28 ℃培養(yǎng)24 h后，在NA平板上出現(xiàn)圓形、邊緣無缺刻、凸起、光滑、淡黃色的菌落(圖1)。

圖1 病原菌分離結(jié)果Fig.1 Result of pathogen separation

2.2 回歸感染

經(jīng)回歸感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示細(xì)菌ah01對斑點(diǎn)叉尾鮰有較強(qiáng)毒力，腹腔注射后，實(shí)驗(yàn)A、B組24 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)魚全部死亡，C組48 h內(nèi)全部死亡，D在15 d攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)束后總死亡率為80%，而對照組F與實(shí)驗(yàn)組E組未出現(xiàn)死亡。死亡斑點(diǎn)叉尾鮰出現(xiàn)體表大面積出血，肛門有大量血液流出，解剖其組織器官出現(xiàn)不同程度充血。經(jīng)過細(xì)菌再分離獲得一株與ah01相同的菌株，表明菌株ah01是斑點(diǎn)叉尾鮰病原菌。

2.3 細(xì)菌鑒定

經(jīng)生理生化特性分析，菌株ah01為革蘭氏陰性菌，詳細(xì)理化特性如表1所述。參考文獻(xiàn)[8]，初步判定ah01株生理生化特性與溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)一致。經(jīng)gyrB基因序列與NCBI已有序列比對，其結(jié)果表明菌株ah01與氣單胞菌屬種類同源性最高；系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖2)表明，ah01株與溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)聚為一支，同源性高達(dá)99%。結(jié)合ah01理化特性，因此綜合判定ah01株是溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。

表1 病原菌的生理生化特征Tab.1 Physiologic and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria strains

注: “+”示陽性; “-”示陰性; “d”示 11%～89%菌株為陽性。

圖2 基于菌株ah01的gyrB 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequence of ah01 strain

2.4 細(xì)菌藥敏特性

通過紙片擴(kuò)展法測試了菌株ah01對14種藥物的敏感性，具體如表2所述。結(jié)果顯示,分離菌株ah01對多西環(huán)素及頭孢唑林高度敏感；對氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星中度敏感；對阿莫西林、磺胺異噁唑、克林霉素、新霉素、鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素及苯唑西林耐藥。

表2 菌株ah01的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antibiotic sensitivity test of strain ah01

3 討論

細(xì)菌分子鑒定工具目前通用的是16S rDNA序列分析[11]，但近年來研究表明編碼DNA解旋酶B亞單位的基因(gyrB基因)兼具保守與變異性，其堿基相對進(jìn)化速度快，在細(xì)菌種間鑒定比16S rDNA更具有優(yōu)勢[12]。為此本研究采用測定分離株gyrB基因，經(jīng)過同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，分離菌株ah01溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)聚為一支，并經(jīng)常規(guī)形態(tài)學(xué)、理化特性鑒定，故綜合判定ah01株為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)又名寡源氣單胞菌及蘇伯利氣單胞菌，隸屬于氣單胞菌科、氣單胞菌屬[13]。溫和氣單胞菌廣泛分布于養(yǎng)殖環(huán)境中，是條件病原菌，其主要致病因子是多種溶血素及腸毒素，具備感染發(fā)病率高、發(fā)病迅速及死亡快等特點(diǎn)[14]，常引起水生動(dòng)物大規(guī)模發(fā)病[15]。主要報(bào)道病例包括鱘、似鯰高原鰍、泥鰍、加州鱸、鱉類及高體革等皮膚潰爛[16-21]，羅非魚急性敗血[22]及黃顙魚肌肉腐爛[23]等。同時(shí)溫和氣單胞菌也可導(dǎo)致人類食物中毒、腹瀉等病癥[24-25]，亦可引起禽類發(fā)病[26-28]，因此溫和氣單胞菌屬于人-畜-魚共患病原菌。本研究中患病斑點(diǎn)叉尾鮰出現(xiàn)嚴(yán)重出血，與溫和氣單胞菌引起羅非魚發(fā)病癥狀類似，從患病斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離到菌株ah01，經(jīng)過回歸感染及鑒定，確定溫和氣單胞菌為斑點(diǎn)叉尾鮰此次發(fā)病的病原菌。本研究豐富了斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病理論內(nèi)容，也表明溫和氣單胞菌對水生動(dòng)物的危害正在進(jìn)一步增大。

本研究從湖北仙桃養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離得到溫和氣單胞菌對多西環(huán)素及頭孢噻肟高度敏感；對氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星等3種藥物中度敏感；對新霉素、鏈霉素、妥布霉素及慶大霉素等9種抗生素耐藥。由此可知，分離菌株ah01具有較強(qiáng)的耐藥性，對大多數(shù)水產(chǎn)常用抗生素都耐藥。為此在養(yǎng)殖過程時(shí)首先應(yīng)當(dāng)選擇合適養(yǎng)殖模式，充分改善養(yǎng)殖環(huán)境，通過投喂中草藥或者注射疫苗等方式進(jìn)行預(yù)防，必要時(shí)選擇多西環(huán)素等高度敏感藥物進(jìn)行治療，與此同時(shí)注意用量及療程，做到精準(zhǔn)用藥，輪換用藥，確保減少耐藥菌株的產(chǎn)生。另本次藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他地區(qū)分離的溫和氣單胞菌耐藥情況有差異[29-31]，其主要原因可能在于養(yǎng)殖環(huán)境及用藥情況不同造成的。

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Isolation and identification ofAeromonassobriafromIctalunespunctatusand its antimicrobial susceptibility

YANG Yibin1,2,3, XU Ning1,2,3, DONG Jing1,2,3, YANG Qiuhong1,2,3, LIU Yongtao1,2,3, AI Xiaohui1,2,3*

(1. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2. Hubei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center, Wuhan 430223, China; 3. Key Laboratory of Control of Qualityand Safety for Aquatic Products, Ministry of Agriculture, Beijing 100141, China)

The present study reports isolation, identification and antibiotic sensitivity of a pathogen fromIctaluruspunctatusuffering from bleeding disorder. The pathogenic bacteria were isolated and purified from blood and important tissues and organs ofIctaluruspunctatu. The identification of the isolated was conducted, using the biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determination. The artificial infection test was performed, and antimicrobial susceptibility test was conducted by K-B method. The bacterial strains isolated from artificial infection fish showed similar morphological and biochemical characteristics to those naturally infected fish. Therefore, the isolate was pathogenic bacteria giving rise toIctalunespunctatus. According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of gyrB gene sequence analysis, the isolate wasAeromonassobria. The isolate was susceptible to doxycycline and cefotaxime. Meanwhile, it showed medium sensitivity to florfenicol, azithromycin and levofloxacin. Our results demonstrated that isolate was the pathogen which caused high mortality inIctaluruspunctatus, and the disease may be prevented by administering drugs such as doxycycline in emergency. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):45-50]

Ictalunespunctatus;Aeromonassobria; isolation and identification; antimicrobial susceptibility

AI Xiaohui, aixh@yfi.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.04.007

2017-01-22；接收日期：2017-04-17

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201503108-CC-1；201203085)

楊移斌(1988-)，男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物病害臨床診斷及其防控技術(shù)，yangyb1988@126.com 通信作者： 艾曉輝，研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物藥理及藥物控制技術(shù)，aixh@yfi.ac.cn

S94

A

2095-1833(2017)04-0045-06