張素青, 陳永平, 李春青, 高麗娜,李連慶, 時文博, 李兆千, 張丹娜

(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)， 天津 300221 )

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定池塘沉積物中氯霉素殘留

張素青, 陳永平*, 李春青, 高麗娜,李連慶, 時文博, 李兆千, 張丹娜

(農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)， 天津 300221 )

[目的]建立一種使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀快速準確檢測池塘沉積物中痕量氯霉素殘留的方法，為水產(chǎn)品中氯霉素污染來源的排查提供技術(shù)支持。[方法]底泥經(jīng)潤濕后，經(jīng)乙酸乙酯水飽和溶液提取，Sep-PaK C18固相萃取柱凈化，Shim-Pack XR-ODS色譜柱分離，采用甲醇和水為流動相，并用梯度洗脫對待測物進行分離，以氘代氯霉素(氯霉素-D5)為內(nèi)標，采用負離子掃描，多反應監(jiān)測模式(MRM)，定性離子對m/z為321→152.0，256.8，定量離子對m/z為 321→152.0。[結(jié)果]氯霉素類藥物在0.5～10.0 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，本方法的檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg。3個加標水平(0.5、1.0和5.0 μg/kg) 的平均回收率為90.1%～96.6%，相對標準偏差為2.4%～7.0%。[結(jié)論]實驗結(jié)果符合氯霉素藥物殘留檢測的相關(guān)法規(guī)要求，適用于淡水池塘沉積物中氯霉素殘留的定性定量檢測。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準，2017,7(4):14-20]

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；池塘沉積物；氯霉素；殘留量

氯霉素(chloramphenicol)是一種廣譜抗生素，對需氧、厭氧菌以及衣原體、支原體、立克次體等均有效。由于價格便宜且效果顯著，曾被用于畜禽及水產(chǎn)動物的疾病治療和預防。但是，氯霉素存在嚴重的毒副作用，能抑制人體骨髓造血功能，容易造成再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏癥和灰嬰綜合征等[1]。為保障動物源食品安全，許多國家和地區(qū)都對其做出了嚴格規(guī)定，嚴禁氯霉素在食用動物上使用。歐盟規(guī)定動物源食品中氯霉素殘留的最低執(zhí)法限量(MRPL)為0.3 μg/kg[2]，中國農(nóng)業(yè)部235號公告中將氯霉素列為禁用藥物[3]。盡管中國已經(jīng)對此藥物的使用做出了明確的禁用規(guī)定，但在實際生產(chǎn)中仍有少數(shù)養(yǎng)殖者在養(yǎng)殖過程中違規(guī)使用氯霉素[4]。氯霉素化學性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境水體中難以降解，屬于持久性污染物[5]，在水產(chǎn)品中的殘留可通過食物鏈進入人體。若在池塘中長期大量使用氯霉素，會有相當部分的氯霉素直接散失到水環(huán)境中，積累于沉積物，從而造成水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染[6-7]。而且，當受污染的淡水池塘進行再次養(yǎng)殖生產(chǎn)時，底泥中的氯霉素會不斷向水體進行緩慢釋放，成為其二次污染的主要來源。因此評估養(yǎng)殖池塘沉積物中的氯霉素藥物殘留狀況，建立相應的檢測方法，對于水產(chǎn)品中氯霉素污染來源的排查具有積極的意義。

氯霉素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、氣相色譜法(GC)[9-10]、液相色譜法(HPLC)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC- MS)[12-13]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS /MS)[14-16]。上述檢測方法都有各自的優(yōu)勢和不足，酶聯(lián)免疫法雖然便捷快速，但容易出現(xiàn)假陽性；HPLC法雖然操作簡便，但僅靠保留時間定性，如果基線出峰有些偏離，容易出現(xiàn)定性不準確，不能滿足殘留檢測要求；GC和GC-MS方法則需對樣品進行衍生化處理，過程很復雜。LC-MS/MS法具有快速、靈敏度高、專一性好、不受噪聲干擾等特點，尤其是通過多反應監(jiān)測模式(MRM)能進一步提高檢測的靈敏度和選擇性，大大降低了檢出限，并減少假陽性的出現(xiàn)。

目前，對于魚塘沉積物中氯霉素的含量分析進行研究的不多[17-18]。養(yǎng)殖池塘沉積物成份復雜，雜質(zhì)多，對分析干擾大，對樣品的凈化要求較高。本研究將超聲提取、液-液萃取(LPE)、液-固萃取(SPE)技術(shù)結(jié)合起來對樣品進行前處理，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立養(yǎng)殖池塘沉積物痕量氯霉素的分析方法。同時運用該方法調(diào)查了天津部分地區(qū)養(yǎng)殖池塘沉積物樣品中氯霉素的殘留現(xiàn)狀，以期從養(yǎng)殖源頭監(jiān)控其污染情況 ，為排查污染來源及評價生態(tài)環(huán)境對健康養(yǎng)殖的影響提供有力的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

色譜柱為Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×2.0 mm，5 μm)；4000 Q Trap液質(zhì)-質(zhì)聯(lián)用儀(AB生物公司)；電子天平BT125D (德國賽多利斯)；SIR4 漩渦混合器(IKA公司)；超聲波清洗器無錫雷士Z-500；Sigma 3k15冷凍離心機。

氯霉素標準品含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司)；氯霉素-D5內(nèi)標物含量≥98%(Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙酸乙酯、正己烷為色譜純(德國默克公司)； 氨水為分析純(國藥公司)；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作液的配制

準確稱取適量標準品氯霉素，用甲醇溶解定容，配成100 μg/mL標準儲備液；準確稱取適量標準品氯霉素-D5，用甲醇溶解定容，配成100 μg/mL標準儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

移取適量100 μg/mL氯霉素標準儲備液，用甲醇進行稀釋，分別配制成0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 和10.0 ng/mL的一系列標準工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

1)樣品制備：從池塘取來的沉積物預先除去雜質(zhì)，在陰涼處自然風干。

2)提?。悍Q取樣品5.00 g置50 mL離心管中，加入2 mL水潤濕，加入500 μL質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL的氯霉素內(nèi)標溶液、5 mL乙腈及5 mL 4%氯化鈉溶液，漩渦振蕩2 min，超聲萃取20 min后，靜置10 min，15 000 r/min離心10 min，移取上清液至另一50 mL 離心管中；重復提取1次，合并2次提取液。

3)液-液萃取凈化：在提取液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5 mL，漩渦振蕩2 min，5 000 r /min離心10 min，上層液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，重復提取1次，將上述所得提取液用氮氣吹干，用乙腈-水(5∶95，V/V)溶液3 mL 溶解，得到備用液。

4)液-固萃取凈化：將固相萃取柱依次用10 mL甲醇、10 mL水預洗，然后取上述備用液過柱，用 5 mL水洗柱，用5 mL甲醇水(50∶50，V/V)溶液洗脫，以1 mL /min的速度將樣品洗脫入轉(zhuǎn)15 mL 離心管中。在洗脫液中加入水飽和乙酸乙酯溶液5 mL，渦旋振蕩2 min，5 000 r /min，離心5 min，取上層液，重復提取1次，合并提取液氮氣吹干。用1 mL 甲醇水(50∶50，V/V)溶液溶解殘留物，旋渦后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用儀上機測定。

1.2.3 液相色譜條件

采用Shim-Pack XR-ODS色譜柱，柱溫40 ℃，流動相A為水，B為甲醇，流速為0.30 mL/min，進樣量5μL，采用梯度洗脫，見表1。

表1 流動相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution of mobile phase

注：流動相A為水，流動相B為甲醇。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；多反應監(jiān)測(MRM)負離子模式；電噴霧電壓為-4 500 V；氣簾氣為20 Psi；輔助氣為50 Psi；去簇電壓為-80 V，碰撞電壓為-10 V，離子源溫度為500 ℃?；衔锏亩喾磻O(jiān)測離子對及質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)如表2所示。

1.2.5 標準曲線的繪制

在0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和10.0 ng/mL梯度標準品溶液中分別加入5.0 ng氯霉素-D5內(nèi)標，自動進樣分析，以目標物質(zhì)與對應內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，目標物質(zhì)濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 檢出限與定量限確定

取空白沉積物添加氯霉素標準工作液和內(nèi)標溶液按1.2.2方法進行樣品前處理，按1.2.3液相色譜條件和1.2.4質(zhì)譜條件進樣分析，每個濃度做6個重復。

1.2.7 方法回收率與精密度測定

取池塘空白沉積物樣品進行3個水平的添加，氯霉素的添加水平分別為0.5、1.0和5.0 μg/kg，每個水平做6個平行樣品，計算回收率和精密度。

表2 化合物的多反應監(jiān)測離子對及質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)Tab.2 Multi reaction monitoring ion pair and parameters of mass spectra

注：其中*為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的建立

氯霉素中羥基官能團可帶負電荷，選用(ESI-)離子化模式可以提供比正離子方式(ESI+)更多的碎片信息，且靈敏度大幅提高。本方法氯霉素及氯霉素-D5的母離子分別為m/z321.1和326.1。以多反應監(jiān)測(MRM)模式對目標物進行定性定量分析，選擇豐度最強、無干擾的監(jiān)測離子對321.1/152.0、326.1/157.1分別用于氯霉素及氯霉素-D5的目標物定量，其他離子對則分別用于輔助定性。如圖1所示，將0.5 mg/L的氯霉素標準溶液及氯霉素-D5內(nèi)標液利用流動注射泵以10 μL/min速度連續(xù)進樣，在負離子模式下進行母離子全掃描。

圖1 氯霉素及氘代氯霉素(氯霉素-D5)特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.1 Characteristic ion mass chromatogram of chloramphenicol and D5-chloramphenicol

圖2 氯霉素特征離子質(zhì)譜圖Fig.2 Characteristic ion mass spectrometry of chloramphenicol

2.2 方法的線性、檢出限和定量限

在上述儀器條件下測定，以氯霉素及其內(nèi)標物的物質(zhì)濃度為橫坐標，以其對應的峰面積之比為縱坐標繪制標準曲線，得到線性方程，方法檢出限及定量限見表3。

試樣中氯霉素色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間相比，變化范圍在±2.5%。本方法的線性范圍在0.5～10 ng/mL，按3倍信噪比計算得該方法檢出限為0.1 μg/kg，以10倍信噪比計算得該方法的定量限為0.3 μg/kg。

2.3 方法的回收率和精密度

氯霉素3個加標水平(0.5 、1.0和5.0 μg/kg)的平均回收率為90.1%～96.6%，相對標準偏差為2.4%～7.0%(表4)。

表3 池塘沉積物中氯霉素殘留檢測的線性范圍、標準曲線、檢出限和定量限Tab.3 Linear range, linear equation limit of detection and quantification of chloramphenicol in sediment

表4 底泥中氯霉素加標回收率和精密度Tab.4 Recoveries and relative standard deviation of the detection method for chloramphenicol in sediment

2.4 實際樣品的測定

在天津市某區(qū)養(yǎng)殖基地隨機采集10份沉積物樣本，使用本方法進行提取后測定，發(fā)現(xiàn)1份養(yǎng)殖池塘中沉積物樣本的氯霉素含量為1.0 μg/kg，其他樣本均未檢出。池塘沉積物空白樣品氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖如圖3所示，池塘沉積物陽性樣品氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖(1.0 μg/kg)如圖4所示。

3 結(jié)論

本研究建立了使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定養(yǎng)殖池塘沉積物中氯霉素殘留的方法。該方法檢出限為0.1 μg/kg，定量限為0.3 μg/kg，在 0.5～10.0 ng/mL范圍線性關(guān)系良好，回收率范圍為90.1%～96.6% ，相對標準偏差小于7%。本方法滿足養(yǎng)殖池塘沉積物中氯霉素殘留的檢測要求，為檢測養(yǎng)殖池塘沉積物中氯霉素提供技術(shù)支持。

圖3 池塘沉積物空白樣品氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.3 Chloramphenicol characteristic ion mass chromatogram of blank sample in pond sediment

圖4 池塘沉積物陽性樣品氯霉素特征離子質(zhì)量色譜圖(1 μg·kg-1)Fig.4 Chloramphenicol characteristic ion mass chromatogram of positive samples in pond sediment

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《中國漁業(yè)質(zhì)量與標準》征訂啟事

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Determination of chloramphenicol residue in pond sediment by UPLC-MS/MS

ZHANG Suqing, CHEN Yongping*, LI Chunqing, GAO Lina, LI Lianqing,Shi Wenbo， LI Zhaoqian, ZHANG Danna

(Quality of Fishery Environment and Aquatic Products Supervision and Testing (Tianjin), Ministry of Agriculture,Tianjin 300221 China)

[Objectives] This study is aim to establish a rapid and accurate method for trace analysis of chloramphenicol residue in pond sediment. It will provide methodological guidance for investigating chloramphenicol pollution in aquatic products. [Methods] The mud samples were soaked and extracted using water saturated ethyl acetate solution by liquid-liquid extraction method. After extraction, the samples were purified by Sep-Pak C18and separated by Shim-Pack XR-ODS columns with a mobile phase of methanol and water using gradient elution. Chloramphenicol-D5 was used as internal reference standard and multiple reaction monitoring combined with negative-ion scans was performed. Characteristic transition reaction fragmentsm/z: 321→152.0, 256.8 andm/z: 321→152.0 were tested for the qualitative ion pair and quantitative ion pair of chloramphenicol, respectively. [Results] The dosage of chloramphenicol residues (0.5～10.0 ng/mL) fit well on the calibration curve of CPS intensity. The correlation coefficient was above 0.99．The limit of detection and quantification for chloramphenicol were 0.1 μg/kg and 0.3 μg/kg, respectively. The average recoveries of chloramphenicol at the levels of 0.5, 1.0, and 5.0 μg/kg were ranged from 90.1% to 96.6%．The relative standard deviation was 2.4% ～ 7.0%. [Conclusions] The test results confirmed totally to the requirements of related regulation and this method is suitable for the qualitative and quantitative detection of chloramphenicol residues in pond sediment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):14-20]

UPLC-MS/MS; pond sediment; chloramphenicol; residue

CHEN Yongping,jiamu008@163.com

2017-01-09；接收日期：2017-03-05

天津市科技支撐計劃重點項目(14ZCZDNC00012)

張素青(1966-)，女，學士，正高級工程師，研究方向為漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量安全，s.q.zhang1@163．com 通信作者：陳永平，高級工程師，研究方向為水產(chǎn)品藥物代謝動力學與質(zhì)量安全，jiamu008@163.com

S91

A

2095-1833(2017)04-0014-07