梁云霄，孫建安，高昕，毛相朝

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

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米曲霉低鹽固態(tài)發(fā)酵蝦味醬油的工藝優(yōu)化

梁云霄，孫建安*，高昕，毛相朝

(中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003)

為充分利用水產(chǎn)品資源，豐富食用醬油種類，本研究采用價格低廉、營養(yǎng)物質(zhì)豐富、來源廣泛的脫脂南極磷蝦粉和傳統(tǒng)的脫脂豆粕、麩皮為原料發(fā)酵生產(chǎn)蝦味醬油。采用單因素分析方法探討蝦粉用量、潤水量以及制曲時間對成曲質(zhì)量的影響；同時，比較分析優(yōu)化條件下制得的蝦味醬油和普通醬油的品質(zhì)。結果表明，脫脂南極磷蝦粉用量添加量30%，潤水量100%，制曲時間48 h時，成曲質(zhì)量達到最優(yōu)。感官評定和風味物質(zhì)分析表明，使用南極磷蝦發(fā)酵的醬油品質(zhì)優(yōu)于普通醬油。有機酸(檸檬酸和蘋果酸)含量明顯高于普通醬油；氨基酸總量也高于普通醬油，且含有人體所必需的8種必需氨基酸(占總量的44.6%)。上述結果說明，在脫脂豆粕、麩皮原料中添加適量南極磷蝦粉，發(fā)酵生產(chǎn)蝦味醬油，能夠顯著改善產(chǎn)品品質(zhì)。本研究有助于推動南極磷蝦的高值化利用，同時可為功能性調(diào)味品的生產(chǎn)提供技術支持。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標準, 2017,7(4):21-28]

醬油；米曲霉；南極磷蝦；固態(tài)發(fā)酵；高值化應用；制曲；工藝優(yōu)化

南極磷蝦(Euphausiasuperba)不但資源巨大，而且營養(yǎng)價值高，磷蝦肉的粗蛋白質(zhì)含量為16.31%[1]，與大黃魚、帶魚相當。磷蝦體內(nèi)還含有大量的維生素A、D和B，以及相當豐富的礦物質(zhì)，尤其是鎂、鈣、磷，它們的含量均滿足美國農(nóng)業(yè)部推薦的人類各個年齡階段每日膳食營養(yǎng)素供給量[2]。南極磷蝦是目前人類所發(fā)現(xiàn)的生物中蛋白質(zhì)含量最高的一種水產(chǎn)品，對它的進一步開發(fā)利用，將會對人類的食物供應做出巨大的貢獻[3]。南極磷蝦中的抗氧化性肽有較強的清除自由基能力，其內(nèi)的蛋白酶也具有加速傷口愈合的作用[4]。目前提取南極磷蝦中不飽和脂肪酸的工藝也比較成熟，已用于南極磷蝦蝦油保健品的生產(chǎn)[5]。但是南極磷蝦粉的應用還十分有限，當前主要用于制作飼料，這不僅造成了巨大的資源浪費，而且還易于在制作過程中引發(fā)環(huán)境污染。

中國醬油產(chǎn)量居世界首位，但主要是以普通醬油為主，一般以豆粕、麩皮等原料發(fā)酵而成，口味和營養(yǎng)比較局限。而以魚、蝦、扇貝類等的下腳料發(fā)酵生產(chǎn)出的海鮮醬油，因其富含多種營養(yǎng)成分和大量有益人體健康的活性物質(zhì)，以及其具有濃郁的海鮮風味，深受消費者喜愛，并且在國際市場的需求也呈現(xiàn)快速增長的趨勢[6]。因此，傳統(tǒng)原料輔以南極磷蝦生產(chǎn)功能性醬油，不僅可以實現(xiàn)南極磷蝦的高值化利用，還能夠為功能性調(diào)味品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

米曲霉(Aspergillusoryzae)由青島燈塔釀造有限公司提供。葡萄糖、氯化鈉、干酪素、甲醛溶液、酚酞、福林酚等試劑均為分析純；脫脂豆粕、麩皮購自青島市農(nóng)貿(mào)市場，脫脂南極磷蝦粉購自日本水產(chǎn)有限公司(Japan Fisheries Co., Ltd)。實驗中所需儀器設備如表1所示。

1.2 低鹽固態(tài)發(fā)酵蝦味醬油的生產(chǎn)工藝

低鹽固態(tài)發(fā)酵蝦味醬油的生產(chǎn)工藝流程主要分四部分：種曲制備、制曲、發(fā)酵、提取(圖1)[7]。

1.3 制曲條件優(yōu)化

1.3.1 脫脂南極磷蝦粉的添加量對制曲的影響

在豆粕和麩皮的比例為4∶1(m/m)，潤水量100%、蒸料時間30 min、制曲時間72 h的條件下，考察了脫脂南極磷蝦粉的用量對制曲的影響。設置的梯度為30%、40%、50%、60%，80%、100%，制曲結束后觀察成曲的感官質(zhì)量，并檢測成曲的蛋白酶活力、氨基態(tài)氮含量、還原糖含量，所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。

表1 實驗所用儀器Tab.1 The main instruments used in this study

1.3.2 潤水量對制曲的影響

在豆粕和麩皮的比例為4∶1(m/m)，脫脂南極磷粉30%、蒸料時間30 min、制曲時間72 h的條件下，考察了潤水量對制曲的影響。設置的梯度為40%、80%、100%、120%、140%，制曲結束后觀察成曲的感官質(zhì)量，并檢測成曲的蛋白酶活力、氨基態(tài)氮含量、還原糖含量，所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。

1.3.3 制曲時間對制曲的影響

在豆粕和麩皮的比例為4∶1(m/m)，脫脂南極磷粉 30%、蒸料時間30 min、潤水量100%的條件下，考察了制曲時間對制曲的影響。設置的梯度為24、41、48、60、74 和89 h，制曲結束后觀察成曲的感官質(zhì)量，并檢測成曲的蛋白酶活力、氨基態(tài)氮含量、還原糖含量，所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。

1.4 成曲蛋白酶活力測定

根據(jù)須鳳高[8]制定的方法進行蛋白酶活力測定，并進行適當改進。準確稱取成曲1 g，用pH 7.2磷酸緩沖溶液定容至50 mL，置入40 ℃水浴浸取0.5 h，用紗布過濾。再用pH 7.2磷酸緩沖液稀釋一定的倍數(shù)。所得液體保存在4 ℃冰箱中待測。在試管內(nèi)加入樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預熱2 min，再加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1 mL(對照先加2 mL三氯乙酸將酶滅活后，再加1 mL酪蛋白)，精確保溫10 min，再各加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，以終止反應，繼續(xù)水浴保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心。取濾液1 mL，加0.4 mol/L碳酸鈉5 mL和已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min，于660 nm測定吸光值。分別取1 mL 0、20、40、60、80、100 μg/mL酪氨酸制作標準曲線。酶活力定義為：在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

圖1 低鹽固態(tài)發(fā)酵蝦味醬油的生產(chǎn)工藝流程Fig.1 The flow diagram of the Antarctic krill sauce by adopting low-salt solid-state fermentation technology

1.5 氨基態(tài)氮含量的測定

醬油的氨基態(tài)氮含量采用甲醛滴定法，按照相應的國家標準[9]進行測定。

1.6 還原糖含量的測定

醬油還原糖含量的測定采用DNS法[10]。取樣品液0.5 mL(以蒸餾水做空白對照)，加入1.5 mL DNS，在沸水浴中煮沸5 min，流水沖冷卻后再分別向各試管中加入蒸餾水4 mL，混勻，540 nm下測定吸光值。使用葡萄糖作為標準品配制一系列梯度濃度的標準溶液，其他同上，繪制吸光度-葡萄糖標準曲線。

1.7 感官評定

以QDA感官評定法進行發(fā)酵液的品質(zhì)評定[11-12]。邀請6名青島燈塔釀造公司的專業(yè)感官評價人士進行評定。設立詳細的QDA線性標尺，標尺為兩端用詞匯固定的線段(10 cm)，最左端代表“0”，中間代表“5”，最右端代表“10”，設置3個參考點(對于較難定標尺的描述語，以具體某一相同特征的市售產(chǎn)品為參考，評價小組討論并設定參考點)。取20 mL樣品倒入50 mL玻璃杯中，使用隨機數(shù)字給樣品編號，每位評價員直接在線性標尺上標記，最后用刻度尺量出起點至標記處的線段長度即為打分值，取平均值作為最終分數(shù)[13]。

1.8 游離氨基酸含量的測定

根據(jù)張峻松等[14]的方法測定游離氨基酸的含量。其中，色譜柱為陽離子分離柱 Cation Separation Column LCA K07/Li Peek柱 4.6×150 mm。流動相：A為檸檬酸鋰(pH 2.9)，B為檸檬酸鋰(pH 4.2)，C為檸檬酸鋰(pH 8.0)，D為異丙醇-超純水(30∶70，V/V)，洗脫程序詳見表2。流速：洗脫泵0.45 mL/min，衍生泵0.25 mL/min；檢測器為集成雙波長光度計570 nm+440 nm；溫度為38～74 ℃梯度升溫(表3)；反應器溫度為130 ℃；進樣量為50 μL。

表2 氨基酸分析洗脫程序Tab.2 The elution program of amino acid analysis

注：A為檸檬酸鋰(pH 2.9)；B為檸檬酸鋰(pH 4.2)；C為檸檬酸鋰(pH 8.0)；D為異丙醇-超純水(30∶70，V/V)。

表3 梯度程序設定Tab.3 The temperature gradient of column

1.9 有機酸含量的測定

有機酸含量的分析測定采用高效液液相色譜法[15-16]。主要對樣品中的8種有機酸(焦谷氨酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸)進行測定。應用高效液相色譜儀(Waters 2998)進行測定，色譜柱為Bio-Rad HPX-87H；檢測波長為205 nm；柱溫為30 ℃；流動相為5 mmol/mL稀硫酸；流速為0.5 mL/min；進樣量為10 μL。

1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(SD)的形式。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)進行數(shù)據(jù)的分析處理，利用Duncan檢驗分析各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 脫脂南極磷蝦粉用量對制曲的影響

由表4可知，脫脂蝦粉用量30%時，蛋白質(zhì)活力與氨基態(tài)氮含量最高。蛋白質(zhì)活力與氨基態(tài)氮含量隨著脫脂蝦粉用量的增加呈下降趨勢，且蛋白酶活力與氨基態(tài)氮含量呈現(xiàn)同步性下降。推測原因是主料之一脫脂豆粕所含的蛋白質(zhì)是米曲霉生長繁殖所必須的，脫脂蝦粉的蛋白質(zhì)不能很好地被米曲霉充分利用，隨著脫脂蝦粉用量的增加，脫脂豆粕用量的減少，米曲霉生長緩慢，蛋白酶活力也隨之下降，氨基態(tài)氮含量也呈現(xiàn)相同的下降。脫脂蝦粉用量在50%～60%時，還原糖含量較高，超過60%時有所下降，但到100%又達到最大。這可能是由于米曲霉在曲中總的蛋白酶活不高，但淀粉酶活性可能最強，由此能較好地將原料中的淀粉分解為還原糖。

表4 脫脂蝦粉添加量對成曲各質(zhì)量指標的影響Tab.4 The effect of the amount of shrimp meal on items of quality indexes in finished koji n=3

注：同列數(shù)據(jù)后標注相同小寫字母者表示差異不顯著(P> 0.05)。下同。

2.2 潤水量對制曲的影響

表5結果顯示，隨著潤水量的增加，孢子生長逐漸活躍，蛋白酶活力也逐漸增大，達到100%時，孢子生長情況進入最佳態(tài)，且曲味濃郁，蛋白酶活力達到最大，氨基態(tài)氮與還原糖含量也達到最大值。雖然潤水量80%與100%時，氨基態(tài)氮含量與還原糖含量均無顯著性差異，但孢子生長狀態(tài)尚不完全成熟，曲味也未達到濃郁的曲香程度。其后，隨著潤水量的增加，出現(xiàn)了轉折，蛋白酶活力急劇降低，同時雜菌增多，不僅消耗了原料中大量的淀粉，部分蛋白質(zhì)也被分解成氨，由此降低了成曲的質(zhì)量。所以高潤水量會對米曲霉的生長起到抑制作用，不僅成本增加，還易導致制曲失敗。

2.3 制曲時間對制曲的影響

從表6可以看出，制曲時間24 h時，孢子處于生長初期。隨著制曲時間的延長，蛋白酶活力增長較快，氨基態(tài)氮含量和還原糖含量均在增加，在48 h時均達到最大值，而后蛋白酶活力值開始緩慢下降。這可能是與米曲霉孢子經(jīng)過生長、成熟的階段進入生長后期有關，活力下降也導致了相應氨基態(tài)氮含量和還原糖含量也開始下降。

綜上分析可知，脫脂南極磷蝦粉用量30%、潤水量100%、制曲時間48 h時，蛋白酶活力和氨基態(tài)氮含量達到最優(yōu)水平，且還原糖含量也在較高水平。

表5 潤水量對成曲各質(zhì)量指標的影響Tab.5 The effect of the moisture content on items of quality indexes in finished koji n=3

表6 制曲時間對成曲各質(zhì)量指標的影響Tab.6 The effect of the time of making koji on items of quality indexes in finished koji n=3

2.4 感官評定結果

從外觀、滋味、香氣、口感和后感5個方面對兩種醬油進行感官評定。如圖2所示，南極磷蝦醬油色澤為淺紅褐色，雖然不如普通醬油的顏色深，但南極磷蝦醬油光澤度好，澄清透明不渾濁、不分層，掛杯性良好；南極磷蝦醬油口感良好，鮮味十足，咸甜適中，南極磷蝦特有的蝦香味比較濃，而普通醬油不具備該特點。另外，南極磷蝦醬油的黏稠度較高，且后味十足，余味和余香均持久。

2.5 有機酸含量的測定

8種有機酸標準混合樣品使用高效液相色譜法，經(jīng)外標定量法計算得各樣品中有機酸的含量。南極磷蝦醬油和普通醬油中都含有檸檬酸、蘋果酸、丁二酸、乙酸和焦谷氨酸(表7)。而南極磷蝦醬油中總酸含量比普通醬油高出1.6倍。其中蘋果酸有較強的呈味作用，其酸味柔和別致，爽口[17]。兩種醬油樣品中含有蘋果酸，但在南極磷蝦醬油中，蘋果酸的含量明顯提高。檸檬酸具有酸味強，味道柔和爽快，入口即達到最高酸感及酸味持久時間短等特點，與蘋果酸共同作用于食品，可以使產(chǎn)品味道渾厚[18]。南極磷蝦醬油中檸檬酸含量比普通醬油高12倍之多。由感官評價結果可知，原料中添加南極磷蝦的醬油整體風味較好。

圖2 南極磷蝦醬油定量描述分析法感官評定結果Fig.2 Quantitative descriptive analysis(QDA)of Antarctic krill sauce

表7 普通醬油和蝦醬油中的有機酸組成及含量

Tab.7 The component and contents of organic acid in common and shrimp sauces mg·(100 mL)-1

2.6 游離氨基酸分析

為進一步了解其營養(yǎng)結構，又對其氨基酸組成成分及含量進行了初步測定，結果如表8所示。在原料中添加南極磷蝦的醬油氨基酸總量略高于普通醬油，含有人體所必需的8種必需氨基酸，且必需氨基酸的總量是總氨基酸的44.6%。

FAO/WHO聯(lián)合專家委員會推薦的良好蛋白模式為必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比例要高于0.6，從表8可以計算出，南極磷蝦海鮮醬油中必需氨基酸和非必需氨基酸的比例為0.8，氨基酸組成符合FAO/WHO推薦的理想蛋白模式。且Glu、Thr等鮮甜味氨基酸含量明顯高于普通醬油，而Tyr、Leu、His等苦味氨基酸明顯低于普通醬油，這大大提高了醬油的鮮味。

表8 普通醬油和蝦醬油中的游離氨基酸含量Tab.8 Free amino acid composition of common and shrimp sauces mg·(100 mL)-1

注：Met，甲硫氨酸；Lys，賴氨酸；Val，纈氨酸；Ile，異亮氨酸；Phe，苯丙氨酸；Leu，亮氨酸；Trp，色氨酸；Thr，蘇氨酸；Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，絲氨酸；Ala，丙氨酸；Gly，甘氨酸；Tyr，酪氨酸；Arg，精氨酸；Pro，脯氨酸；His，組氨酸；Cys，半胱氨酸。

3 結論

脫脂南極磷蝦粉用量為30%，潤水量100%，制曲時間48 h時，成曲質(zhì)量達到最優(yōu)水平，米曲霉黃綠色菌絲密布，曲香濃厚；測得的蛋白酶活力和氨基態(tài)氮含量最高，還原糖含量也達到最優(yōu)水平。此外，本研究還比較了添加南極磷蝦粉發(fā)酵的醬油和普通醬油的品質(zhì)。結果表明：在感官評價方面，南極磷蝦醬油不僅具有獨特的蝦香味，而且鮮味十足、黏稠度高、余味余香持久；有機酸和氨基酸組成分分析也證實了這一點，主要表現(xiàn)在南極磷蝦發(fā)酵醬油的檸檬酸與蘋果酸含量均明顯高于普通醬油；氨基酸總量高于普通醬油，尤其是必須氨基酸含量。南極磷蝦粉發(fā)酵醬油不僅充分利用了南極磷蝦粉，也為功能性調(diào)味品的開發(fā)提供參考。

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Technical optimization of shrimp soy sauce through low salt solidstate fermentation byAspergillusoryzae

LIANG Yunxiao, SUN Jianan*, GAO Xin, MAO Xiangzhao

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

To fully utilize aquatic products resource and enrich varieties of edible soy sauce, this study mainly describes the production process of shrimp sauce which uses the defatted Antarctic krill powder, the traditional defatted soybean meal and the wheat bean as raw materials. The single-factor analysis was used to discuss the effects of the amount of shrimp meal, moisture content and the time of making koji on the quality of the pastiche. The flavor and physicochemical indexes of shrimp sauce were also analyzed compared to common sauce, which lay the foundation for the next fermentation process optimization. The results showed that the quality index of finished koji reached to the optimal when the amount of defatted Antarctic krill powder was 30%, the moisture content was 100%, and the time of making koji was 48 h. The sensory evaluation showed the defatted Antarctic krill powder, which was one of the raw materials, could adjust the flavor of soy sauce well. The contents of citric acid and malic acid in Antarctic krill sauce were obviously higher than that in common sauce; and the total content of amino acids was also at a higher level in the Antarctic krill sauce, which contained 8 essential amino acids (44.6% of the total). These results demonstrated that the defatted Antarctic krill that added to the defatted soybean meal and wheat bean as raw materials could significantly improve the flavor in the fermentation production of soy sauce. The research should contribute to the high-value utilization of the Antarctic krill and provide technical support for the functional condiments production. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(4):21-28]

soy sauce;Aspergillusoryzae; antarctic krill; solid state fermentation; high-value untilization; koji-making; optimization

SUN Jianan, sunjianan@ouc.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.04.004

2017-04-06；接收日期：2017-05-15

山東省重點研發(fā)計劃項目(2016YYSP016)

梁云霄(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為海洋生化工程，liangyunxiao1990@163.com 通信作者：孫建安，副教授，研究方向為食品生物技術與海洋生化工程，sunjianan@ouc.edu.cn

S98

A

2095-1833(2017)04-0021-08