王苗苗，韓飛，李慕春

（新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆烏魯木齊830011）

柳花提取物總黃酮含量及抗氧化活性的研究

王苗苗，韓飛，李慕春*

（新疆維吾爾自治區(qū)分析測試研究院，新疆烏魯木齊830011）

采用70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水6種不同極性的溶劑對柳花進(jìn)行提取，對各溶劑提取物的總黃酮含量進(jìn)行測定，同時以總抗氧化能力、DPPH自由基清除率為指標(biāo)，研究所得6種柳花提取物的抗氧化能力。結(jié)果表明，總黃酮含量由大到小依次為乙酸乙酯提取物（108.71%）＞70%乙醇提取物（39.84%）＞正丁醇提取物（34.36%）＞氯仿提取物（23.39%）＞石油醚提取物（20.97%）＞水提取物（6.21%）；總抗氧化能力由強(qiáng)到弱依次為乙酸乙酯提取物（16.9 U/mL）＞正丁醇提取物（15.79 U/mL）＞70%乙醇提取物（14.92 U/mL）＞水提取物（13.94 U/mL）＞氯仿提取物（6.04 U/mL）＞石油醚提取物（4.56 U/mL），DPPH自由基清除率由高到低依次為70%乙醇提取物（93.8%）＞乙酸乙酯提取物（93.22%）=正丁醇提取物（93.22%）＞水提取物（89.75%）＞氯仿提取物（78.07%）＞石油醚提取物（58.3%）。因此，不同柳花提取物均具有抗氧化作用，且抗氧化能力與其提取溶劑和總黃酮含量有關(guān)。

柳花；總黃酮；蘆??；分光光度法；抗氧化活性

柳樹為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）木本植物，種類繁多，不僅是園林綠化的重要植物之一，而且其根、皮、嫩枝及葉的藥用，在民間也有相當(dāng)長的歷史[1-2]。文中所用到的試驗材料柳花是一種名為準(zhǔn)噶爾柳的柳樹上結(jié)的花。準(zhǔn)噶爾柳主要分布在新疆烏蘇市的四棵樹河、古爾圖河和奎屯河流域一帶。它屬于灌木，不吐絮，卻開花，朵朵如菊，干而不謝?！稙跆K縣志》記載：柳花為本境特產(chǎn)，系老柳叢生，結(jié)花，入夏碧綠，花小榻疊，似含苞之菊，可當(dāng)茗，性至涼，能解暑，人稱柳花茶。盡管柳花茶的制作工藝2010年被列入自治區(qū)級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄，但隨著準(zhǔn)噶爾柳樹面積逐年減少，傳統(tǒng)的柳花茶制作技藝正頻臨滅絕。通過本文研究，為柳花茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

植物類黃酮具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化活性等抗氧化能力，是一種天然抗氧化劑，能夠預(yù)防多種由氧化損傷導(dǎo)致的疾病，包括癌癥、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、糖尿病以及神經(jīng)退行性疾病，對體內(nèi)能量代謝也有一定的作用[3-4]。研究資料表明，柳屬植物中普遍含有黃酮類化合物。這類物質(zhì)廣泛分布于蔬菜、水果和藥用植物中，其天然物以游離態(tài)或甙的形式存在于植物體的各個部分。近年來，不斷發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)具有多方面的功能，例如蘆丁、槲皮素等能夠增強(qiáng)心臟收縮，減少心臟搏動數(shù)，杜鵑素具有止咳祛痰作用；黃芩苷具有抗菌消炎作用；漢黃芩素具有抑制腫瘤細(xì)胞作用；水飛薊素具有保肝作用等[5-8]。

機(jī)體氧化反應(yīng)可以產(chǎn)生自由基，在生理情況下自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，其濃度保持著動態(tài)平衡，但是過量的自由基對機(jī)體有損傷效應(yīng)[9-11]。傳統(tǒng)化學(xué)合成抗氧化劑的安全性問題越來越受到人們的重視，在使用上受到限制，很多研究已表明天然提取物有較強(qiáng)的抗氧化能力。Mehmet發(fā)現(xiàn)薄荷提取物的清除DPPH自由基的活性優(yōu)于陽性對照BHT[12]。Masoumeh等在研究艾菊提取物的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)其DPPH自由基清除活性比陽性對照BHT好[13]。葉漢俠等研究表明杭白菊乙醇提取液對DPPH自由基的清除率高達(dá)93.17%[14]，其抗氧化能力是人工合成的TBHQ（叔丁基對苯二酚）的1/10。因此尋求人體容易吸收、能清除體內(nèi)過量自由基的天然抗氧化劑具有非常重要的意義，但是天然抗氧化劑由于提取工藝落后，資源利用率低，我國天然植物的研究主要集中在其溶劑提取部位，對固體殘渣的研究比較少；研究方法不全面，同時藥理研究實驗主要是體外實驗，難以評價其體內(nèi)功效；在有效成分的協(xié)同作用、抗氧化機(jī)理、構(gòu)效關(guān)系等方面的研究也比較欠缺，加強(qiáng)這些方面研究可為天然植物開發(fā)抗氧化劑的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)[15-16]。

本研究測定柳花70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水等6種不同極性溶劑提取物的總黃酮含量，采取清除DPPH·和總抗氧化能力兩種體外模型，綜合評價柳花6種不同極性溶劑提取物的抗氧化能力及其與總黃酮含量的相關(guān)性，這些含不同極性成分的浸出物其抗氧化能力的表現(xiàn)對于綜合開發(fā)柳花資源具有重要的指導(dǎo)意義，另外本研究也可為不同萃取劑對天然植物有效成分的提取效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

無水乙醇（AR）：西安化學(xué)試劑廠；甲醇（AR）、石油醚（AR）、乙酸乙酯（AR）、氯仿（AR）、正丁醇（AR）：天津富宇精細(xì)化工有限公司；三氯化鋁（AR）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（VC）：鄭州市化學(xué)試劑三廠；DPPH：上海安普有限公司；蘆?。?biāo)準(zhǔn)品）：中檢所；總抗氧化能力檢測試劑盒A015：南京建成生物工程研究所；柳花：新疆烏蘇市。

1.1.2 儀器

UV-2700紫外分光光度計：日本島津公司；RT-02A碎樣機(jī)：北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；TE612-L電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XMTD-204 HSS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；H50冷卻水循環(huán)機(jī)：萊博科泰公司；ALPHA 2-4 LD Plus冷凍干燥機(jī)；德國CHRIST；AE163分析天平：梅特勒-托利多；P-12聯(lián)用型平行蒸發(fā)儀：瑞士步琦公司；Milli-Q A10超純水系統(tǒng)：美國密理特公司；751石英比色皿：大連市日普利科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 柳花提取物的制備

準(zhǔn)確稱取10.0 g柳花粉末若干份，置錐形瓶中，以70%的乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水為提取液，在料液比為1∶20（g/mL）條件下提取，分別得到70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收溶劑，真空冷凍干燥后分別得到70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水的柳花提取物，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柳花提取物中總黃酮含量的測定

1.2.2.1 蘆丁對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品7.5 mg，加入適量甲醇溶解，用甲醇定容至25 mL，搖勻備用，配成質(zhì)量濃度為300 μg/mL的蘆丁對照溶液。準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于10 mL具塞試管中，加入1%的三氯化鋁溶液4 mL，以甲醇定容至10 mL，充分混勻后，40℃水浴顯色20 min后，于410 nm波長處測定吸光度。

1.2.2.2 測定柳花提取物的總黃酮含量

準(zhǔn)確吸取濃度為200 μg/mL的70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水的柳花提取物1 mL，加入1%的三氯化鋁溶液4 mL，以甲醇定容至10 mL，充分混勻后，40℃水浴顯色20min后測定吸光度，于410 nm波長處測定吸光度。

1.2.3 柳花提取物中抗氧化性能的測定

1.2.3.1 總抗氧化能力（T-AOC）的測定

按照總抗氧化能力檢測試劑盒A015（南京建成生物工程研究所）要求準(zhǔn)備各工作液。取0.1 mL濃度為200 μg/mL的70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水的柳花提取物及VC溶液置于10 mL比色皿中，加入檢測試劑3.5 mL，混合均勻，在37℃恒溫水浴箱反應(yīng)30 min，再加入其它檢測試劑0.1 mL，充分混勻，放置10min，在516 nm處測定吸光值，用無水乙醇調(diào)零，VC作為陽性對照。每樣品重復(fù)實驗3次，取平均值。按以下公式計算總抗氧化能力。

計算公式：

總抗氧化能力（U/mL）=（測定管OD-對照管OD）×反應(yīng)液（mL）×樣品測試前稀釋倍數(shù)÷0.01÷30÷取樣量（mL）

1.2.3.2 DPPH自由基清除法

準(zhǔn)確稱量7.2 mg DPPH溶解到乙醇溶液中，定容到250 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。0.5 mL濃度為200 μg/mL的70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水的柳花提取物分別加到3.0 mL DPPH乙醇溶液中，避光反應(yīng)30 min后在516 nm處測定吸光值，用無水乙醇調(diào)零。對照組用3.0 mL無水乙醇代替DPPH溶液，空白組為3.0 mL DPPH溶液與0.5 mL無水乙醇混合，VC作為陽性對照，每樣品重復(fù)試驗3次，取平均值。按以下公式計算DPPH自由基清除率。

計算公式：

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

式中：AC為未加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度，即空白組吸光度；Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度，即樣品組吸光度；Aj為提取液在測定波長的吸光度，即對照組吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳花提取物總黃酮含量測定比較

以蘆丁對照品配置成不同梯度濃度，每個濃度重復(fù)測定3次，取吸光值平均值，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得回歸方程（A為吸光度，C為濃度μg/mL）A=0.031 6C-0.026 6，R2=0.996 9；相關(guān)系數(shù)R2表明標(biāo)準(zhǔn)曲線在對照品濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖1 蘆丁測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

圖2 柳花提取物總黃酮含量測定結(jié)果Fig.2 The results of favonoid content in flowers of willow extracts

柳花提取物總黃酮含量測定結(jié)果見圖2。由圖2可知，乙酸乙酯的柳花提取物總黃酮含量最高，而水的柳花提取物總黃酮含量最低，柳花不同溶劑提取物總黃酮含量大小順序為：乙酸乙酯提取物（108.71%）＞70%乙醇提取物（39.84%）＞正丁醇提取物（34.36%）＞氯仿提取物（23.39%）＞石油醚提取物（20.97%）＞水提取物（6.21%）。

2.2 柳花提取物抗氧化性能比較

柳花提取物的總抗氧化能力及DPPH自由基清除率測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，乙酸乙酯的柳花提取物總抗氧化能力最高，而石油醚的柳花提取物總抗氧化能力最低，柳花不同溶劑提取物總抗氧化能力大小順序為：乙酸乙酯提取物（16.9 U/mL）＞正丁醇提取物（15.79 U/mL）＞70%乙醇提取物（14.92 U/mL）＞水提取物（13.94 U/mL）＞氯仿提取物（6.04 U/mL）＞石油醚提取物（4.56 U/mL），而陽性對照VC的總抗氧化能力為58.71 U/mL。

圖3 柳花提取物的總抗氧化能力及DPPH自由基清除率測定結(jié)果Fig.3 The total antioxidant capacity and DPPH radicals scavenging activity of flowers of willow extracts

由圖3可知，70%乙醇提取物的柳花提取物DPPH自由基清除率最高，而石油醚的柳花提取物DPPH自由基清除率最低，柳花不同溶劑提取物DPPH自由基清除率大小順序為：70%乙醇提取物（93.8%）＞乙酸乙酯提取物（93.22%）=正丁醇提取物（93.22%）＞水提取物（89.75%）＞氯仿提取物（78.07%）＞石油醚提取物（58.3%），而陽性對照VC的DPPH自由基清除率為95.63%。

3 結(jié)論與討論

本研究采用70%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水6種不同極性的溶劑對柳花進(jìn)行提取，對各組分的總黃酮含量進(jìn)行測定，同時以總抗氧化能力、DPPH自由基清除率為指標(biāo)，研究了6種柳花粗提物的抗氧化能力。結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物的總黃酮含量、總抗氧化能力均是最高的，而70%乙醇提取物的DPPH自由基清除率是最強(qiáng)的；乙酸乙酯提取物、70%乙醇提取物和正丁醇提取物的總黃酮含量、總抗氧化能力、DPPH自由基清除率都比較高，抗氧化活性較強(qiáng)；而萃取所得的水提取物、氯仿提取物和石油醚提取物的總黃酮含量、總抗氧化能力、DPPH自由基清除率都比較低，這一趨勢也說明，總黃酮的含量與抗氧化能力或有正相關(guān)的關(guān)系。由此可見，不同柳花提取物均具有抗氧化作用，且抗氧化能力與其提取溶劑和總黃酮含量有關(guān)。

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Comparison of Total Flavonoids and the Antioxidant Activity in Flowers of Willow with Different Solvents

WANG Miao-miao，HAN Fei，LI Mu-chun*（Xinjiang Academy of Instrumental Analysis，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

The components of flowers of willow were extracted by 70%ethanol，petroleum ether，chloroform，ethylacetate，n-butyl alcohol and water ether with different polarity respectively.The research made items like the total flavonoid content，the total antioxidant ability，DPPH·clearance rate，as indexes and evaluated the antioxidant ability of six kinds of extracts of flowers of Willow.The results showed that the order sequenced by the total flavonoid content from strong to weak was：ethyl acetate extract（108.71%）＞70%ethanol extract（39.84%）＞n-butyl alcohol extract（34.36%）＞chloroform extract（23.39%）＞petroleum ether extract（20.97%）＞water extract（6.21%）；and the order sequenced by the total antioxidant ability from strong to weak was：ethyl acetate extract（16.9 U/mL）＞n-butyl alcohol extract（15.79 U/mL）＞70%ethanol extract（14.92 U/mL）＞water extract（13.94 U/mL）＞chloroform extract（6.04 U/mL）＞petroleum ether extract（4.56 U/mL），and the order sequenced by the DPPH·clearance rate from strong to weak was：70%ethanol extract（93.8%）＞ethyl acetate extract（93.22%）=n-butyl alcohol extract（93.22%）＞water extract（89.75%）＞chloroform extract（78.07%）＞petroleum ether extract（58.3%）.Therefore，the flowers of willow's extracts in different kinds of solvents all have antioxidant effects，and the antioxidant capacity is related to the extraction solvent and the total flavonoid content.

the flowers of willow；total flavone；rutin；spectrophotometry；antioxidant activity

2016-11-17

王苗苗（1988—），女（漢），中級實驗師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物。

*通信作者：李慕春，男，副研究員，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.005