陸其聰，鐘宇思，王立博，成曉情

（1.國(guó)家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)成都站，四川成都610081；2.四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都610081）

金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

陸其聰1，2，鐘宇思1，2，王立博2，成曉情1，2

（1.國(guó)家輕工業(yè)食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)成都站，四川成都610081；2.四川省輕工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都610081）

采用Baird-Parker（BP）平板計(jì)數(shù)法、顯色培養(yǎng)法分別對(duì)金黃色葡萄球菌能力驗(yàn)證的兩個(gè)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，考核樣品16-K717、16-Y374的菌落數(shù)分別為173 000、86 CFU/mL。試驗(yàn)結(jié)果由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院檢測(cè)中心給予評(píng)價(jià)，Z值分別為0.68、0.38，都取得了滿意結(jié)果。結(jié)果表明顯色培養(yǎng)法比Baird-Parker更適合于金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。

金黃色葡萄球菌；定量檢測(cè)；能力驗(yàn)證

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄球狀排列，無芽孢，無莢膜。它屬于嗜溫性微生物，能在7℃～48℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在水分活度（0.86）和pH值（4.8）相對(duì)較低，高鹽和糖濃度達(dá)15 %及含有二氧化氮的環(huán)境中仍能生長(zhǎng)。由于金黃色葡萄球菌能在較惡劣的環(huán)境中生長(zhǎng)，使得它們能在其他微生物不能生長(zhǎng)的許多食物中成為優(yōu)勢(shì)種[1-3]。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生致病的腸毒素，健康成年人進(jìn)食約30 g或30 mL含106～107個(gè)細(xì)胞數(shù)所產(chǎn)生100 ng～200 ng毒素的食物即可中毒，其特征是發(fā)病突然，來勢(shì)猛烈，通常在進(jìn)食1 h～4 h出現(xiàn)臨床癥狀，特點(diǎn)是惡心，嘔吐，頭暈頭痛，腹痛腹瀉，重者可引起虛脫和休克。金黃色葡萄球菌毒素引起的食物中毒被認(rèn)為是全球最常發(fā)生的食源性疾病[4]。近年來出現(xiàn)的“超級(jí)細(xì)菌”耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Stphylococcus aureus，MRSA）被發(fā)現(xiàn)存在于禽類體內(nèi)，且感染率極高，由金黃色葡萄球菌引起的感染變得日益嚴(yán)重，并成為難治感染之一[5-7]，因而，準(zhǔn)確地對(duì)食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)就顯得尤為重要。

為了提高檢測(cè)能力和水平參與了中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織和負(fù)責(zé)實(shí)施的食品微生物學(xué)指示菌能力驗(yàn)證[ACAS-PT187（2016）]。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

金黃色葡萄球菌[編號(hào)FSCC223004（ATCC6538）]、表皮葡萄球菌[編號(hào)FSCC 223011（CMCC（B）26069）]：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2瓶檢驗(yàn)樣品凍干粉末（編號(hào)分別為16-K717、16-Y374)：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心。

1.2 試劑與儀器

BP瓊脂基礎(chǔ)、腦心浸出液肉湯（BHI）、凍干血漿、卵黃亞碲酸鉀增菌劑：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；血瓊脂平板：鄭州安圖生物工程股份有限公司；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基：鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司。

YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9070A電熱恒溫干燥箱、AISET YLD-6000隔水式恒溫培養(yǎng)箱：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；BSC-1000ⅡA2生物安全柜：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)

BP平板計(jì)數(shù)法：樣品達(dá)到后立即于2℃～8℃冰箱保存，試驗(yàn)前從冰箱中取出，使其達(dá)到室溫后開啟。瓶?jī)?nèi)加入4 mL無菌生理鹽水，待溶解后，吸出放入無菌瓶?jī)?nèi)，用36 mL無菌生理鹽水多次清洗樣品瓶，將樣品完全溶解在40 mL無菌生理鹽水中。以無菌吸管吸取25 mL樣品于225 mL滅菌生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成體積比1∶10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取體積比1∶10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL無菌生理鹽水試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），換用1支1 mL無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成體積比1∶100的樣品勻液。依此類推，制成原液、10-1、10-2、10-3、10-4樣品液。依據(jù)GB 4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法進(jìn)行檢驗(yàn)。

由于GB 4789.10-2010第二法存在涂布不均勻，耗時(shí)的情況，同時(shí)以接種量每皿為0.2 mL進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)稀釋管做5個(gè)平行平板[8-9]，其它步驟與GB 4789.10-2010第二法相同。

顯色培養(yǎng)法：將41.3 g干粉緩慢倒入500 mL無菌水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，并加熱?00℃，直至瓊脂完全溶解。將培養(yǎng)基水浴冷卻至48℃，分別取1 mL上述濃度的樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度做2個(gè)平行，然后傾注（15±1）mL顯色培養(yǎng)基，混勻使其凝固、倒置，37℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2 菌落計(jì)數(shù)及鑒定

BP平板上典型菌落的計(jì)數(shù)和確認(rèn)按GB 4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法進(jìn)行。

顯色培養(yǎng)基上對(duì)紫紅色、紅色、粉紅色菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。并將部分可疑菌落劃線于血平板，進(jìn)行染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BP平板計(jì)數(shù)法

樣品16-K717在BP平板上菌落呈黑色，部分呈灰色，菌落周圍有渾濁帶，在其外層有透明圈的典型菌落。經(jīng)鑒定，樣品16-K717中金黃色葡萄球菌為173 000 CFU/mL，結(jié)果見表1。

樣品16-Y374在BP上生長(zhǎng)了大量雜菌，分別對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和確認(rèn)。通過對(duì)典型菌落的鑒定，表明典型菌落都是金黃色葡萄球菌，結(jié)果為86 CFU/mL，其它雜菌為干擾菌。

表1 樣品在BP平板上檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of samples on Baird-Parker plate

2.2 顯色培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法

顯色平板上菌落大都為紫紅色、紅色和粉紅色，存在極少量的藍(lán)色菌落，對(duì)紫紅色、紅色和粉紅色進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落通過血平板和血漿凝固酶試驗(yàn)證實(shí)都為金黃色葡萄球菌。

2.3 兩種接種量在BP平板上檢測(cè)結(jié)果

兩種接種量在BP平板上檢測(cè)結(jié)果見表3。

表2 樣品在顯色培養(yǎng)基上檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of samples on chromogenic medium plate

表3 兩種接種量在BP平板上檢測(cè)結(jié)果Table 3 The results of samples on Baird-Parker plate by two methods

如表3所示，接種量0.2 mL的方法，樣品16-K717、16-Y374結(jié)果分別為182 000、99 CFU/mL，檢測(cè)結(jié)果比接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法檢測(cè)結(jié)果偏高。2.4 檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表1、表2結(jié)果表明兩個(gè)樣品采用BP平板法與金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)法的結(jié)果差異不明顯。從表3可以看出，接種量0.2 mL的方法，其檢測(cè)結(jié)果要高于接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法?？紤]到能力驗(yàn)證選擇的方法為GB4789.10-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》第二法，因此上報(bào)結(jié)果為16-K717：173 000 CFU/mL；16-Y374：86 CFU/ mL。統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)結(jié)果見表4。

表4 金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)（BP平板法）統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 The quantitative test results of Staphylococcus aureus on Baird-Parker plate

反饋結(jié)果如表4所示，都取得了滿意結(jié)果。本次能力驗(yàn)證共有80個(gè)實(shí)驗(yàn)室參與，其中結(jié)果可疑的有7個(gè)，不滿意結(jié)果15個(gè)，共計(jì)60個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲得滿意結(jié)果，滿意率75%。

3 討論

傳統(tǒng)的BP法耗時(shí)長(zhǎng)，選擇性不強(qiáng)，且受涂布時(shí)間、涂布均勻度等人員熟練程度因素影響，菌落有時(shí)分布不均勻而難以計(jì)數(shù)，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。這有可能是造成趙薇等用BP法與顯色培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果差別大的原因[10]。在本文中，對(duì)BP平板涂布前做了一定的預(yù)處理，節(jié)約了涂布時(shí)間的同時(shí)使涂布更均勻，最終檢測(cè)結(jié)果與顯色培養(yǎng)法差異不大。

采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)致病菌金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)BP法，將接種量0.3、0.3、0.4 mL的方法與接種量0.2 mL的方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)接種量為0.2 mL的結(jié)果偏高，這與王洪亮[8]等研究結(jié)果一致。當(dāng)接種量較大時(shí)，涂布耗時(shí)，不容易均勻。而接種量小時(shí)，涂布更均勻，避免了菌落重疊現(xiàn)象出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果更理想。因此，涂布的均勻性對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。這與我們對(duì)BP平板涂布前作預(yù)處理后得出的結(jié)論一致。

食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法較多：BP法，顯色培養(yǎng)法，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)等[11]，我國(guó)食品中金黃色葡萄球菌定量檢測(cè)的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的BP法，其它方法尚未大規(guī)模推廣。從表2和表4中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)法Z值更接近中位值，由此認(rèn)為顯色培養(yǎng)法在金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。顯色培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，能對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行有效區(qū)分，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。所以顯色培養(yǎng)法用于定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌更具有優(yōu)勢(shì)。這與許多學(xué)者研究結(jié)果一致[12-14]。在實(shí)際檢測(cè)過程中采取何種方法應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況及檢測(cè)樣品的情況而定。

實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來確定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的活動(dòng)，是為確保實(shí)驗(yàn)室維持較高檢測(cè)水平而對(duì)其能力進(jìn)行的考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗(yàn)證活動(dòng)[15]?？煽陀^的反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平；通過能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)室可以發(fā)現(xiàn)自身與其它實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的差異，幫助實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)問題并尋求解決問題的辦法；同時(shí)也是判定申請(qǐng)認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室的能力和獲準(zhǔn)認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室維持其技術(shù)能力的重要依據(jù)之一[16]。在本次能力驗(yàn)證中，兩個(gè)樣品都獲得滿意結(jié)果，且測(cè)定結(jié)果都與中位值比較接近。結(jié)合表2、表4，我們發(fā)現(xiàn)顯色培養(yǎng)法也能得到可靠的結(jié)果，且顯色培養(yǎng)法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，選擇性強(qiáng)，因而在金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。

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Proficiency Testing Results and Analysis of Quantitative Detection of Staphylococcus aureus

LU Qi-cong1，2，ZHONG Yu-si1，2，WANG Li-bo2，CHENG Xiao-qing1，2
（1.Chengdu Test Center，State Light Industry Food Quality Supervision and Detection Station，Chengdu 610081，Sichuan，China；2.Light Industry Research and Design Institute of Sichuan Province，Chengdu 610081，Sichuan，China）

According to the Baird-Parker plate count method and chromogenic medium，the proficiency testing was conducted for quantitative detection of Staphylococcus aureus.The results of quantitative detection of Staphylococcus aureus in sample 16-K717 was 173 000 CFU/mL and in sample 16-Y374 was 86 CFU/mL.The evaluation of two samples test results were given by the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Inspection Center.Both of them were satisfactory as the Z score were 0.68，0.38 respectively.Compared with Baird-Parker plate count，chromogenic medium is more suitable for quantitative detection of Staphylococcus aureus.In general，this research provided certain support for the quantitative detection of Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus；quantitative detection；proficiency testing

2016-12-09

陸其聰（1987—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事食品微生物檢測(cè)工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.034