用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的集成微柱陣列的微流控芯片設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

劉軍山+張洋洋+王忠+鄧嘉翌+葉軒+薛日野+葛丹+徐征

摘 要 設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的集成微柱陣列的微流控芯片。芯片由一片聚二甲基硅氧烷（PDMS）溝道片和一片玻璃蓋片組成， 在PDMS溝道片上集成了一個(gè)由兩排微柱陣列圍成的細(xì)胞培養(yǎng)室和兩條用于輸送培養(yǎng)基的側(cè)溝道。微柱間距直接影響了芯片的使用性能， 是整個(gè)芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵?；跀?shù)值模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證， 本研究對微柱間距進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。優(yōu)化后的微流控芯片可以很好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)模擬材料混合液的穩(wěn)定注入、培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)向培養(yǎng)室內(nèi)的快速擴(kuò)散和細(xì)胞代謝物的及時(shí)排出。在芯片上進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)， 證明了芯片上構(gòu)建的細(xì)胞體外微環(huán)境的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞 微流控芯片； 細(xì)胞； 三維培養(yǎng)； 微柱； 聚二甲基硅氧烷

1 引 言

微流控芯片具有試劑消耗量少、易于精確控制液體流動(dòng)和模擬構(gòu)建細(xì)胞體外微環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)， 在細(xì)胞分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1～3]。近年來， 基于微流控芯片的細(xì)胞分析研究主要包括：單細(xì)胞操控與分析[4]、細(xì)胞與細(xì)胞[5]及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用[6]、干細(xì)胞誘導(dǎo)與分化[7]、藥物篩選[8]和器官芯片[9]等， 而細(xì)胞培養(yǎng)是開展上述研究的基礎(chǔ)。

微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)有二維和三維兩種方式。二維培養(yǎng)操作簡單， 但最近研究表明， 細(xì)胞在二維培養(yǎng)環(huán)境中無法真實(shí)體現(xiàn)其在體內(nèi)的生物學(xué)特性和功能[10]。在微流控芯片上進(jìn)行細(xì)胞三維培養(yǎng)的主要方法是將細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)模擬材料（例如膠原蛋白）混合， 然后將混合液注入到細(xì)胞培養(yǎng)室中， 為細(xì)胞搭建一個(gè)三維培養(yǎng)空間， 通過微溝道與培養(yǎng)室連接， 為細(xì)胞持續(xù)提供培養(yǎng)基[5，11]。

芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)室多數(shù)采用一種四周封閉、只有一個(gè)入口和一個(gè)出口的圓池形結(jié)構(gòu)[12]。這種結(jié)構(gòu)雖然制作簡單， 但能夠?qū)崿F(xiàn)的功能有限， 而且在輸送培養(yǎng)基時(shí)會產(chǎn)生較大剪切力， 對細(xì)胞造成傷害[13]。Toh等[14]提出了一種由兩排微柱陣列圍成的培養(yǎng)室結(jié)構(gòu)， 這種結(jié)構(gòu)既可實(shí)現(xiàn)多種復(fù)雜功能， 又避免了培養(yǎng)基直接從細(xì)胞表面流過， 可大幅減小細(xì)胞所受的剪切力， 此種培養(yǎng)室得到了越來越多應(yīng)用[15]。然而， 有關(guān)此類型芯片的優(yōu)化設(shè)計(jì)卻鮮見報(bào)道。微柱間距直接影響芯片使用性能， 間距過大， 在注入細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)模擬材料混合液時(shí)， 混合液會克服流動(dòng)阻力流出培養(yǎng)室， 使得芯片無法正常工作； 間距過小， 既會增加芯片制作難度， 又會降低培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝物的擴(kuò)散速度， 影響細(xì)胞正常生長[16，17]。

本研究基于數(shù)值模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證， 對微流控芯片上的微柱間距進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)， 并在優(yōu)化后的芯片上進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)， 檢測了構(gòu)建的細(xì)胞體外微環(huán)境穩(wěn)定性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 微流控芯片設(shè)計(jì)

微流控芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示， 由一片聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）溝道片（40 mm×20 mm×3 mm）和一片玻璃蓋片（50 mm×24 mm×0.15 mm）組成。在溝道片上， 集成了一個(gè)由兩排微柱陣列圍成的細(xì)胞培養(yǎng)室、兩條用于輸送培養(yǎng)基的側(cè)溝道和6個(gè)儲液池。微柱陣列長20 mm， 兩排微柱之間距離為1 mm， 微柱直徑為100 μm、高150 μm。側(cè)溝道寬1 mm、深150 μm， 儲液池直徑為3 mm。

本研究組曾利用鼠尾I型膠原構(gòu)建了神經(jīng)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)微環(huán)境[18]， 因此本研究所用細(xì)胞外基質(zhì)模擬材料均為鼠尾I型膠原。芯片操作流程如下：首先利用移液器將細(xì)胞與膠原混合液從細(xì)胞入口注入培養(yǎng)室， 接著將芯片放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中使膠原溶液聚合形成水凝膠， 然后采用微量注射泵將培養(yǎng)基從兩個(gè)培養(yǎng)基入口注入側(cè)溝道， 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)通過擴(kuò)散方式經(jīng)過微柱陣列進(jìn)入培養(yǎng)室， 同時(shí)細(xì)胞代謝物也通過擴(kuò)散方式排出培養(yǎng)室。

2.2 微流控芯片數(shù)值模擬

基于計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)， 對不同微柱間距情況下膠原溶液的注入過程和培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散過程進(jìn)行了數(shù)值模擬。

首先， 基于COMSOL Multiphysics的兩相流水平集模型， 模擬膠原溶液注入過程。由于側(cè)溝道和培養(yǎng)室沿著芯片水平中心線對稱分布， 而且微柱等間距排列， 因此為減少仿真工作量， 建立了一個(gè)簡化的軸對稱二維幾何模型（圖2A）。

影響細(xì)胞與膠原混合液注入過程的主要參數(shù)包括：混合液粘度和表面張力系數(shù)、注入壓力、微溝道表面接觸角、微柱間距等。膠原溶液濃度為1 mg/mL， 利用流變儀測得的粘度為0.032 Pa·s， 利用接觸角測量儀測得的表面張力系數(shù)為44 mN/m?；旌弦鹤⑷雺毫υO(shè)定為1 kPa， 由于微溝道出口與外界大氣相通， 因此出口壓力設(shè)定為0。為了提高芯片鍵合強(qiáng)度和微溝道表面親水性， 在芯片鍵合前， 利用等離子體對PDMS溝道片表面進(jìn)行改性處理。測得膠原溶液在改性后的PDMS表面上接觸角為30°， 因此設(shè)定微溝道表面接觸角為30°。微柱間距共設(shè)計(jì)了4種， 分別為30、50、80和100 μm。

其次， 基于ANSYS Fluent的組分輸運(yùn)模型， 模擬營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散過程。同樣， 建立一個(gè)簡化的軸對稱三維幾何模型（圖2B）。影響營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散過程的主要參數(shù)包括：營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和擴(kuò)散系數(shù)、培養(yǎng)基流速、培養(yǎng)室內(nèi)水凝膠的孔隙率和滲透率、微柱間距等。葡萄糖是培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物質(zhì)， 在進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)， 葡萄糖濃度為50.83 mmol/L， 遠(yuǎn)高于其它營養(yǎng)物質(zhì)的濃度， 因此選用50.83 mmol/L葡萄糖溶液作為模擬培養(yǎng)基。在37℃（細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的溫度）時(shí)， 葡萄糖在培養(yǎng)基中擴(kuò)散系數(shù)為9.6×1010 m2/s [19]。微量注射泵的流量設(shè)定為1 μL/min， 換成培養(yǎng)基的流速為5.56×105 m/s。 利用排液法， 測得水凝膠孔隙率為0.99， 滲透率設(shè)定為2×109 cm2[20]。設(shè)計(jì)了3種微柱間距， 分別為5、50和100 μm。

2.3 微流控芯片制作

PDMS具有良好的生物兼容性、透光性和透氣性， 被廣泛用于制作各種細(xì)胞分析微流控芯片[7，9]。采用澆注成型的方法制作PDMS溝道片 [16]， 然后利用等離子體清洗機(jī)對PDMS溝道片和玻璃表面進(jìn)行氧等離子體處理，然后對準(zhǔn)鍵合在一起。

2.4 儀器與試劑

K1050X等離子體清洗機(jī)（英國Quorum公司）； STM6工具顯微鏡（日本Olympus公司）； IX71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）； PHD 22/2000微量注射泵（美國Harvard公司）； Sunrise酶標(biāo)儀（奧地利Tecan公司）； DSA100接觸角測量儀（德國Krüss公司）； AR2000ex流變儀（美國TA公司）。

鼠尾I型膠原（生友生物技術(shù)有限公司）； 熒光素鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）； 葡萄糖和乳酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究）； 碘化丙啶（Propidium iodide， PI， Sigma公司）； 鈣黃綠素AM（CalceinAM， Sigma公司）； PDMS（Dow Corning公司）。

3 結(jié)果與討論

3.1 數(shù)值模擬

在不同微柱間距情況下， 膠原溶液的流動(dòng)過程如圖3所示。膠原溶液的注入過程是壓力、毛細(xì)力和表面張力共同作用的結(jié)果[21]。在培養(yǎng)室內(nèi)， 壓力和毛細(xì)力起主要作用， 膠原溶液流動(dòng)迅速， 僅用1 ms便充滿了培養(yǎng)室。然而， 在微柱之間， 膠原溶液受到粘性力和表面張力的阻滯作用， 流速明顯衰減。當(dāng)微柱間距為30和50 μm時(shí)， 即使經(jīng)過1000 ms膠原溶液仍停留在微柱之間， 沒能進(jìn)入側(cè)溝道。隨著微柱間距增大， 這種阻滯作用逐漸減弱， 膠原溶液有突破微柱束縛進(jìn)入側(cè)溝道的趨勢。當(dāng)微柱間距為80 μm時(shí)， 經(jīng)過1000 ms膠原空氣界面已明顯越過圓柱中心線。當(dāng)間距繼續(xù)增大到100 μm時(shí)， 膠原溶液克服了阻滯作用， 在200 ms時(shí)膠原空氣界面進(jìn)入側(cè)溝道， 在1000 ms時(shí)溶液充滿側(cè)溝道。

圖4顯示了微柱間距為50 μm時(shí)， 葡萄糖濃度在芯片內(nèi)隨時(shí)間的變化情況。葡萄糖溶液在側(cè)溝道中流動(dòng)迅速， 僅用18 s便到達(dá)了側(cè)溝道出口。同時(shí)， 葡萄糖會經(jīng)過微柱陣列向培養(yǎng)室內(nèi)擴(kuò)散， 在220 s時(shí)擴(kuò)散過程達(dá)到平衡， 濃度在芯片內(nèi)達(dá)到了均勻分布。當(dāng)微柱間距為5和100 μm時(shí)， 葡萄糖濃度達(dá)到均勻分布所用的時(shí)間分別為237和200 s， 二者相差約40 s。因此， 微柱間距會影響營養(yǎng)物質(zhì)向培養(yǎng)室內(nèi)的擴(kuò)散速度。

結(jié)合上述兩方面數(shù)值模擬結(jié)果， 在綜合考慮芯片加工難度和使用性能的情況下， 最終選擇50 μm作為微柱間距的最優(yōu)值。之后如無特殊說明， 芯片上微柱間距均為50 μm。

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在優(yōu)化后的微流控芯片上對膠原溶液注入過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4）將5 mg/mL膠原溶液稀釋到1 mg/mL， 用0.1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)為中性。然后將20 μL膠原溶液從細(xì)胞入口注入培養(yǎng)室。膠原溶液5 s便充滿了培養(yǎng)室， 但一直到30 min后仍未突破微柱束縛進(jìn)入側(cè)溝道， 在微柱之間形成了一個(gè)穩(wěn)定的膠原空氣界面（圖5）。

對營養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。熒光素鈉擴(kuò)散系數(shù)為4.3×1010 m2/s[22]， 與數(shù)值模擬時(shí)用到的葡萄糖擴(kuò)散系數(shù)相近， 為了在顯微鏡下清楚觀測到擴(kuò)散過程， 采用20 μmol/L熒光素鈉溶液代替葡萄糖溶液。利用微量注射泵將熒光素鈉溶液從培養(yǎng)基入口注入側(cè)溝道， 流速為0.5 μL/min， 每隔500 ms拍攝一次照片。熒光素鈉的流動(dòng)與擴(kuò)散過程與葡萄糖溶液的數(shù)值模擬結(jié)果類似， 僅用5 s便充滿了側(cè)溝道， 同時(shí)經(jīng)過微柱陣列向培養(yǎng)室內(nèi)不斷擴(kuò)散， 在160 s時(shí)擴(kuò)散過程達(dá)到平衡（圖6）。

上述結(jié)果表明， 利用數(shù)值模擬優(yōu)化出的微柱間距不僅可以很好地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)模擬材料混合液的穩(wěn)定注入， 有效攔截了混合液向側(cè)溝道中的泄漏， 而且保證了營養(yǎng)物質(zhì)可以快速擴(kuò)散到培養(yǎng)室內(nèi)， 滿足了芯片性能要求。

3.3 芯片上的微環(huán)境穩(wěn)定性測試

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中， 體外微環(huán)境的穩(wěn)定性至關(guān)重要， 除了要保持營養(yǎng)物質(zhì)含量的穩(wěn)定， 細(xì)胞代謝產(chǎn)物也應(yīng)及時(shí)排出。例如乳酸是葡萄糖主要代謝副產(chǎn)物， 乳酸的積累會改變微環(huán)境pH值， 對細(xì)胞有毒害作用， 因此希望能夠維持在較低濃度[17]。

神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新、多向分化等能力， 已成為神經(jīng)組織工程等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[23]。本研究通過神經(jīng)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)， 測試優(yōu)化設(shè)計(jì)的微流控芯片所構(gòu)建的微環(huán)境穩(wěn)定性。

原代神經(jīng)干細(xì)胞取自孕齡為14 天的昆明種小鼠胎腦的海馬組織， 待培養(yǎng)至第三代時(shí)與膠原溶液混合， 形成細(xì)胞密度為1×106 cells/mL的混合液[18]。共制作了3片微流控芯片， 用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。同時(shí)， 為了對比分析， 在96孔板的3個(gè)孔中靜態(tài)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞， 每個(gè)孔中加入50 μL細(xì)胞與膠原混合液， 待膠原聚合后加入100 μL培養(yǎng)基， 每24 h更換50 μL培養(yǎng)基。

每隔12 h從芯片廢液池和96孔板中取出10 μL培養(yǎng)基， 對其中的葡萄糖和乳酸濃度進(jìn)行檢測（圖7）。如圖7A所示， 葡萄糖初始濃度為50.83 mmol/L， 由于細(xì)胞消耗， 芯片上的葡萄糖濃度會略有下降， 但如3.2節(jié)所述， 葡萄糖可以快速擴(kuò)散到培養(yǎng)室內(nèi)， 所以濃度仍然可以保持很高， 一直穩(wěn)定在48～50 mmol/L。相反， 由于96孔板是靜態(tài)培養(yǎng)， 在每個(gè)換液周期內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)得不到補(bǔ)充， 因此葡萄糖濃度持續(xù)下降， 最低降至41 mmol/L。從圖7B可見， 由于芯片上的細(xì)胞代謝物可以通過擴(kuò)散方式快速排出培養(yǎng)室， 因此培養(yǎng)基中的乳酸濃度很低， 在0.6～0.8 mmol/L之間。而在96孔板中， 由于乳酸在每個(gè)換液周期內(nèi)持續(xù)積累， 所以濃度一直很高， 即使在換液后也無法有效降低， 始終保持在2.4 mmol/L以上， 最高達(dá)到4.3 mmol/L。

從葡萄糖和乳酸濃度的長期檢測結(jié)果可知， 與96孔板中靜態(tài)培養(yǎng)相比， 由本研究優(yōu)化設(shè)計(jì)的微流控芯片構(gòu)建的微環(huán)境具有更好的穩(wěn)定性， 可用于細(xì)胞長期培養(yǎng)。

培養(yǎng)到第8天， 對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行在線死活熒光染色（圖8）。與96孔板相比， 芯片上的干細(xì)胞突起更為明顯， 突觸間相互連接， 向三維空間縱深。根據(jù)隨機(jī)選取的10張不同區(qū)域下的照片， 對死活細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)， 芯片上和96孔板中的細(xì)胞存活率分別約為90%和82%。

4 結(jié) 論

利用數(shù)值模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法， 對集成微柱陣列的微流控芯片進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。利用優(yōu)化后的微流控芯片， 進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)。對葡萄糖和乳酸濃度進(jìn)行了長期連續(xù)檢測， 結(jié)果表明， 由本研究優(yōu)化設(shè)計(jì)的微流控芯片所構(gòu)建的細(xì)胞體外微環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性， 適合于細(xì)胞長期三維培養(yǎng)， 未來可以用于各種細(xì)胞分析研究。

References

1 ZHUANG QiChen， NING RuiZhi， MA Yuan， LIN JinMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（4）： 522-532

莊琪琛， 寧芮之， 麻 遠(yuǎn)， 林金明. 分析化學(xué)， 2016， 44（4）： 522-532

2 Halldorsson S， Lucumi E， GomezSjoberg R， Fleming R M. Biosens. Bioelectron.， 2015， 63： 218-231

3 Mazutis L， Gilbert J， Ung W L， Weitz D A， Griffiths A D， Heyman J A. Nat. Protoc.， 2013， 8（5）： 870-891

4 HUO DanQun， FANG Kejing， HOU ChangJun， YANG Mei， FA HuanBao， HUANG ChengHong， Luo XiaoGang. Chem. J. Chinese Universities，2013， 34（6）： 1327-1332

霍丹群， 方可敬， 侯長軍， 楊 眉， 法煥寶， 黃承洪， 羅小剛. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2013 ，34（6）：13271332

5 WANG WeiXin， LIU WeiPing， WU Bin， LIANG GuangTie， LIU DaYu. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 637-642

王偉鑫， 劉未平， 吳 斌， 梁廣鐵， 劉大漁. 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 637-642

6 Han S， Yang K， Shin Y， Lee J S， Kamm R D， Chung S， Cho S W. Lab Chip， 2012， 12（13）： 2305-2308

7 Yang K， Park H J， Han S， Lee J， Ko E， Kim J， Lee J S， Yu J H， Song K Y， Cheong E， Cho S R， Chung S， Cho S W. Biomaterials， 2015， 63： 177-188

8 Weltin A， Slotwinski K， Kieninger J， Moser I， Jobst G， Wego M， Ehret R， Urban G A. Lab Chip， 2014， 14（1）： 138-146

9 Huh D， Matthews B D， Mammoto A， MontoyaZavala M， Hsin H Y， Ingber D E. Science， 2010， 328（5986）： 1662-1668

10 Pal R， Mamidi M K， Das A K， Bhonde R. J. Biosci. Bioeng.， 2013， 115（2）： 200-206

11 ZHANG Qiong， ZHOU XiaoMian， YAN Wei， LIANG GuangTie， ZHANG QiChao， LIU DaYu. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（7）： 996-1001

張 瓊， 周小棉， 嚴(yán) 偉， 梁廣鐵， 張其超， 劉大漁. 分析化學(xué)， 2012， 40（7）： 996-1001

12 Lei K F， Wu M H， Hsu C W， Chen Y D. Biosens. Bioelectron.， 2014， 51： 16-21

13 Leclerc E， David B， Griscom L， Lepioufle B， Fujii T， Layrolle P， Legallaisa C. Biomaterials， 2006， 27（4）： 586-595

14 Toh Y C， Zhang C， Zhang J， Khong Y M， Chang S， Samper V D， van Noort D， Hutmacher D W， Yu H. Lab Chip， 2007， 7（3）： 302-309

15 Yang K， Park H J， Han S， Lee J， Ko E， Kim J， Cho S R. Biomaterials， 2015， 63： 177-188

16 LIU JunShan， XIAO QingLong， GE Dan， ZHANG YangYang， ZHANG WenZhu， XU Zheng， LIU Chong， WANG LiDing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（7）： 977-982

劉軍山， 肖慶龍， 葛 丹， 張洋洋， 張文珠， 徐 征， 劉 沖， 王立鼎. 分析化學(xué)， 2015， 43（7）： 977-982

17 Ges I A， Baudenbacher F. Biosens. Bioelectron.， 2010， 26（2）： 828-833

18 Ge D， Song K D， Guan S， Qi Y L， Guan B， Li W F， Liu J S， Ma X H， Liu T Q， Cui Z F. Appl. Biochem. Biotechnol.， 2013， 170（2）： 406-419

19 Suhaimi H， Wang S， Thornton T， Das D B. Chem. Eng. Sci.， 2015， 126： 244-256

20 Knapp D M， Barocas V H， Moon A G， Yoo K， Petzold L R， Tranquillo R T. J. Rheol.， 1997， 41（5）： 971-993

21 Huang C P， Lu J， Seon H， Lee A P， Flanagan L A， Kim H Y， Putnam A J， Jeon N L. Lab Chip， 2009， 9（12）： 1740-1748

22 Roy A， Banerjee P， Dutta R， Kundu S， Sarkar N. Langmuir， 2016， 32（42）： 10946-10956

23 Karimi M， Bahrami S， Mirshekari H， Basri S M M， Nik A B， Aref A R， Akbari M， Hamblin M R. Lab Chip， 2016， 16（14）： 2551-2571