金顯文， 陳靜靜

(淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 淮北 235000)

雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的急性聯(lián)合毒性效應(yīng)

金顯文， 陳靜靜

(淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 淮北 235000)

采用靜水生物測(cè)試法研究了雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦單一因子的急性毒性效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用毒性單位法研究了雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦聯(lián)合毒性效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，雙酚A和苯酚的濃度與日本沼蝦幼蝦的死亡率之間呈顯著正相關(guān)，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，延長(zhǎng)半數(shù)致死濃度逐漸降低，且存在較顯著的劑量—效應(yīng)和時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系。分別作用24 h和48 h，雙酚A對(duì)日本沼蝦幼蝦的LC50分別為25.68和12.03 mg/L，苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的LC50分別為33.63和27.59 mg/L。雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的安全濃度分別為0.80和5.57 mg/L。雙酚A與苯酚聯(lián)合作用24 h和48 h對(duì)日本沼蝦幼蝦的LC50分別為0.97 TU和0.51 TU，TUi均小于1，兩者的聯(lián)合毒性效應(yīng)都表現(xiàn)為協(xié)同作用。

雙酚A；苯酚；日本沼蝦；聯(lián)合毒性

雙酚A(BPA)普遍存在于水環(huán)境中，化學(xué)式為C15H16O2，是合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等的原材料，被廣泛應(yīng)用在食品包裝和容器內(nèi)壁涂裝中。雙酚A在生產(chǎn)和日常使用過(guò)程中可通過(guò)多種途徑污染水環(huán)境，并通過(guò)食物鏈作用在生物之間進(jìn)行傳遞和富集。雙酚A屬于內(nèi)分泌干擾物，微量濃度的雙酚A便可對(duì)機(jī)體的生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能產(chǎn)生各種毒性效應(yīng)[1-5]，影響基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)[6-7]，因此雙酚A已經(jīng)被外國(guó)列入優(yōu)先污染物的黑名單[8]。苯酚(Phenol)屬于酚類(lèi)化合物，化學(xué)式為C6H5OH，它在防腐劑、殺蟲(chóng)劑和化工合成以及日常使用過(guò)程中可通過(guò)多種途徑流入水體，危害水生生物的繁殖和生存[9]。當(dāng)苯酚流入天然水域后可感染水生生物，人們?cè)谑秤敏~(yú)、蝦等水生生物后會(huì)通過(guò)食物鏈作用將苯酚積累在人體中[10]，當(dāng)其濃度超過(guò)生物體自身能夠調(diào)節(jié)的范圍時(shí)，將會(huì)引起機(jī)體各方面的變化，對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育造成危害[11-13]。日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)又名河蝦，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬，肉鮮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖蝦類(lèi)[14]。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于雙酚A與苯酚對(duì)水生動(dòng)物的毒性研究，但多集中于單一毒性實(shí)驗(yàn)以及雙酚A與其他酚類(lèi)化合物的聯(lián)合毒性作用方面[9-19]，而有關(guān)雙酚A與苯酚聯(lián)合毒性效應(yīng)則未見(jiàn)報(bào)道。本研究以日本沼蝦幼蝦為受試生物，在單一毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究，以期探討酚類(lèi)化合物對(duì)水生生物的聯(lián)合毒性作用規(guī)律，為自然水域污染防治和人類(lèi)健康及生態(tài)系統(tǒng)安全的科學(xué)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 受試生物

日本沼蝦幼蝦于2015年3月上旬購(gòu)于淮北市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)缸內(nèi)馴養(yǎng)1周，使其適應(yīng)環(huán)境條件。試驗(yàn)時(shí)挑選體長(zhǎng) 3.1～3.4 cm、體重0.85～0.95 g，健康活潑的個(gè)體。

1.2 測(cè)試液的配置

雙酚A(BPA)為白色針狀晶體，分子量為228.29，化學(xué)純；苯酚為白色晶體，分子量94.11，分析純，兩者均購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。雙酚A難溶于水，以0.01‰的丙酮作為助溶劑，用暴曬過(guò)的自來(lái)水配制100 mg/L的母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成所需要的濃度，暴曬的自來(lái)水pH約為7.8～8.6。

1.3 單一毒性實(shí)驗(yàn)

在正式進(jìn)行單一毒性實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定日本沼蝦幼蝦分別對(duì)雙酚A和苯酚2種受試物的最小全致死質(zhì)量濃度和最大耐受質(zhì)量濃度。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)設(shè)置7個(gè)濃度梯度，雙酚A的濃度梯度分別為：8、12、16、20、24、28和32 mg/L； 苯酚的濃度梯度分別為10、15、20、25、30、35和40 mg/L，各個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行組，每個(gè)平行組放12尾日本沼蝦幼蝦，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，連續(xù)觀察幼蝦的活動(dòng)、中毒癥狀；每24 h統(tǒng)計(jì)1次日本沼蝦幼蝦的死亡率，并及時(shí)撈出死亡幼蝦，在解剖鏡下對(duì)比觀察其鰓和肝臟變化。將受試幼蝦沉入水底、玻璃棒觸動(dòng)無(wú)反應(yīng)、心臟停止跳動(dòng)作為其死亡標(biāo)志。

1.4 聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)及其評(píng)價(jià)

毒性單位這一概念最早由 Sprague等提出，其公式為：TUi=Ci/IC50i。式中，Ci為物質(zhì)i的質(zhì)量濃度；IC50i為物質(zhì)i的半致死或半抑制質(zhì)量濃度[20]。在單一毒性的基礎(chǔ)上，按公式1TU=0.5×24 hLC50(phenol)+0.5×24 hLC50(BPA)，按照0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2和4TU來(lái)設(shè)定7個(gè)質(zhì)量濃度組進(jìn)行雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置3個(gè)平行組和1個(gè)空白對(duì)照組，若混合后的LC50<1TU，則兩者聯(lián)合毒性的作用方式為協(xié)同作用，若LC50>1TU則為拮抗作用，而當(dāng)LC50=1TU時(shí)則為簡(jiǎn)單的相加作用[21]。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)結(jié)果用一元線性回歸方程法求得LC50值，SPSS18.0對(duì)死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算95%置信區(qū)間。

1.6 安全性評(píng)價(jià)

關(guān)于酚類(lèi)化合物的危害水平及水環(huán)境中的定量限研究，采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5085.3—2007中規(guī)定[22]；安全濃度根據(jù)Reed Muench法計(jì)算[23-24]：SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2。

2 結(jié)果

2.1 中毒反應(yīng)

日本沼蝦幼蝦在2種受試物中的中毒癥狀比較相似，由于幼蝦對(duì)兩種試劑的敏感性不同，其反應(yīng)時(shí)間稍有差異，開(kāi)始時(shí)表現(xiàn)狂躁不安，在水中沿?zé)趤y撞，后逐漸行動(dòng)受抑。隨著染毒時(shí)間的增加，活動(dòng)微弱，最后沉入杯底直至死亡。解剖鏡下對(duì)死亡個(gè)體進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，中毒幼蝦的鰓和肝臟顏色變深。

2.2 雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的單一急性毒性效應(yīng)

數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)表1，日本沼蝦幼蝦在2種環(huán)境污染物中的死亡率與質(zhì)量濃度之間存在極其顯著的相關(guān)性(全部P<0.01)；對(duì)同一種受試物來(lái)說(shuō)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，日本沼蝦幼蝦的LC50數(shù)值逐漸降低：當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間為24 h和48 h時(shí)，雙酚A的LC50(95%置信區(qū)間)數(shù)值分別為25.68 mg/L(17.140～38.132)和12.03 mg/L(-1.344～56.738)；苯酚的24 h和48 hLC50(95%置信區(qū)間)分別為33.63 mg/L(27.628～41.116)和27.59 mg/L(23.847～31.917)；雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的安全濃度分別為0.80 mg/L和5.57 mg/L。雙酚A和苯酚都屬于高毒物質(zhì)，對(duì)日本沼蝦幼蝦的毒性具有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。對(duì)照組中日本沼蝦幼蝦在實(shí)驗(yàn)期間未見(jiàn)死亡。

2.3 雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性

在雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，混合污染物的LC50值均逐漸下降；當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間為24 h和48 h時(shí)，LC50(95%置信區(qū)間)分別0.97 UT(0.091～3.469)和0.51 UT(-0.274～3.106)，均小于1 UT，所以雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦24 h和48 h的聯(lián)合毒性作用均表現(xiàn)為協(xié)同作用，且隨著濃度的升高和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，混合污染物的LC50值在逐漸減小，即代表雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的協(xié)同作用逐漸增強(qiáng)。聯(lián)合作用的安全濃度為0.042 UT(表2)。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束對(duì)照組中幼蝦的死亡率為6.4%。

表1 雙酚A與苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的單一急性毒性效應(yīng)

回歸方程中x為藥物質(zhì)量濃度；y為日本沼蝦幼蝦死亡率。下同

表2 雙酚A與苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性效應(yīng)

3 討論

3.1 雙酚A、苯酚單一毒性作用

雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦單一毒性作用均表現(xiàn)為隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率逐漸升高。對(duì)照組中未見(jiàn)死亡個(gè)體，符合毒性測(cè)試的有效性標(biāo)準(zhǔn)[25]。從LC50和SC可看出，雙酚A對(duì)日本沼蝦幼蝦的毒性明顯大于苯酚。

雙酚A是環(huán)境雌激素的一種，對(duì)肝臟、腎臟和脾肺等器官都具有嚴(yán)重的毒害作用，其進(jìn)入生物體內(nèi)后不僅能夠致癌而且能夠與體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，之后通過(guò)多種生化機(jī)制產(chǎn)生擬雌激素或抗雌激素的作用，從而干擾生物內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致各種病變，對(duì)生物的生殖、胚胎發(fā)育等機(jī)體的各方面產(chǎn)生毒害作用[8, 17-18, 26]。研究表明，雙酚A對(duì)日本沼蝦幼蝦與隆線溞和微型裸腹溞相比，24 h半致死濃度相當(dāng)[6]，但比隆線溞和微型裸腹溞24 h和48 h半數(shù)致死濃度都略高一些，而萼花臂尾輪蟲(chóng)對(duì)雙酚A表現(xiàn)得更為敏感[1]，這說(shuō)明種間敏感性存在差異，日本沼蝦外被甲殼，比浮游甲殼動(dòng)物的體積大、甲殼厚，所以耐受性大[27]。Staples等通過(guò)研究雙酚A對(duì)淡水和海水中的微生物和魚(yú)類(lèi)的毒理學(xué)影響，認(rèn)為急性毒性試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為24 h時(shí)BPA的EC50值為1000～32×104μg/L[28]，張穎等認(rèn)為酚類(lèi)化合物對(duì)大型溞的48 h半數(shù)致死濃度范圍是0.24～27.5 mg/L[29]，本研究中雙酚A對(duì)日本沼蝦幼蝦的單一毒性效應(yīng)結(jié)果也屬于這個(gè)范圍之內(nèi)。

苯酚是原型質(zhì)毒物，對(duì)各種生物有機(jī)體都有毒害效應(yīng)，可通過(guò)皮膚和黏膜直接進(jìn)入血液循環(huán)，使細(xì)胞被破壞，損害肝、腎功能，出現(xiàn)急性腎功能衰竭，可死于呼吸衰竭，一旦進(jìn)入環(huán)境也會(huì)對(duì)生態(tài)造成危害[30]。這是因?yàn)閷⒈椒优c水進(jìn)行1∶500～1∶1000配置時(shí)，此時(shí)的水溶液能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)沉淀，進(jìn)而殺死細(xì)菌。苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的安全濃度與鋸齒米蝦的急性致毒研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)[11]，但明顯高于苯酚對(duì)脊尾白蝦的安全濃度(0.0057 mg/L)[7]，24 h、48 hLC50低于中華鱘稚魚(yú)的97和83 mg/L[19]。這可能與受試生物的種間差異及棲息的環(huán)境的pH、溫度、光照及營(yíng)養(yǎng)元素等環(huán)境因素不同有關(guān)[20]。

3.2 雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的聯(lián)合毒性

自然條件狀況下，在被污染的水體中通常能夠同時(shí)檢測(cè)到多種酚類(lèi)化合物，因此僅以單一污染物的毒性實(shí)驗(yàn)所得出的數(shù)據(jù)來(lái)判定多種污染物共存時(shí)對(duì)水質(zhì)所造成的毒害是不可取的。所以我們?cè)趯?duì)天然水域的污染狀況進(jìn)行評(píng)判時(shí)不僅要測(cè)定單一污染物毒性實(shí)驗(yàn)的LC50值，而且還要測(cè)定多種污染物聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)的LC50值，這樣做對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)混合污染物的毒害作用具有更重要的參考價(jià)值[31]。本研究中，在雙酚A和苯酚的共同作用下，24 h和48 h的TUi值均小于1，說(shuō)明二者的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為相互協(xié)同，即雙酚A和苯酚共存時(shí)對(duì)日本沼蝦幼蝦產(chǎn)生的綜合毒性大于單一化合物的毒性作用；且TUi值隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變小，說(shuō)明雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的協(xié)同作用逐漸增強(qiáng)。對(duì)照組中至實(shí)驗(yàn)結(jié)束幼蝦的死亡率為6.4%，小于10%，符合毒性測(cè)試的有效性標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)結(jié)果有效[25]。

一般采用毒性單位法、相加指數(shù)法和混合指數(shù)法來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)合毒性的作用類(lèi)型，文獻(xiàn)表明：運(yùn)用相加指數(shù)法研究BPA與對(duì)硝基酚的聯(lián)合毒性結(jié)果為拮抗作用，因?yàn)閮烧咄ㄟ^(guò)競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)理論而使聯(lián)合毒性作用降低[32]；毒性單位法研究雙酚 A 和壬基酚對(duì)青島大扁藻的復(fù)合效應(yīng)為相加[33]；在2-氯苯酚與取代苯酚、苯胺類(lèi)化合物對(duì)鯽魚(yú)的聯(lián)合研究中兩種不同方法聯(lián)合作用類(lèi)型相同[34]，所以方法不同評(píng)價(jià)結(jié)果可能會(huì)有差異。即使同種生物對(duì)同種藥物的敏感性也會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、測(cè)定方法及受試動(dòng)物機(jī)能狀況等因素而有所差異[35]。本研究中雙酚A與苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦24 h、48 h的聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用，這只是基于毒性單位法的評(píng)價(jià)結(jié)果。目前關(guān)于聯(lián)合機(jī)制的研究大致可分為生物轉(zhuǎn)化、受體作用、物質(zhì)間化學(xué)反應(yīng)、功能疊加或拮抗等幾個(gè)方面[36]。雙酚A和苯酚對(duì)日本沼蝦幼蝦的作用機(jī)制可以通過(guò)邱東茹等在環(huán)境刺激素對(duì)動(dòng)物和人體的影響及其作用機(jī)制研究中得到啟示，雖然單一的酚類(lèi)化合物活性很低，但2種或2種以上的污染物共同作用于動(dòng)物或人體時(shí)其活性可能會(huì)大大提高，產(chǎn)生協(xié)同激活的作用[31]，協(xié)同作用還可能是由于兩者進(jìn)入機(jī)體后，其中一種物質(zhì)影響了日本沼蝦機(jī)體對(duì)另一物質(zhì)的吸收、排泄或其他生物轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而增大了對(duì)機(jī)體的毒性[37]。雙酚A和苯酚協(xié)同作用的詳細(xì)機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Joint toxicity of bisphenol A and phenol to the juvenile prawn ofMacrobrachiumnipponense

JIN Xian-wen, CHEN Jing-jing

(School of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

A static bioassay test was used to study the cute toxicity of BPA(Bisphenol A) and phenol to the juvenile prawn ofMacrobrachiumnipponens, and based on which, toxic unit (TU) method was used to study the joint toxicity of BPA and phenol toMacrobrachiumnipponense. The results showed that there were significant relationships between the death rate of the juvenile prawn and the concentrations of BPA and phenol. TheLC50decreased gradually with the increasing of the exposure time, and there were significant dose-effect and and time-effect. The 24 hLC50and 48 hLC50of the juvenile prawn to BPA were 25.68, 12.03 mg/L, respectively, and 33.63, 27.59 mg/L to phenol, respectively. The safe concentrations of the juvenile prawn to BPA and phenol were 0.80 and 5.57 mg/L, respectively. TheLC50of 24 h and 48 h joint toxicity of BPA and phenol to the juvenile prawn were 0.97 and 0.51 TU, respectively. The TUi was less than 1, which meant that the joint action type is synergistic.

bisphenol A; phenol;Macrobrachiumnipponense; joint toxicity

2016-06-23；

2016-07-01

淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(700851)

金顯文，副教授，從事水生生態(tài)學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail: xianwenjin118@163.com

X171.5;Q958.116

A

2095-1736(2017)04-0038-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.038