張 萍, 劉紅梅, 陳 愉, 趙思宏, 李玉榮, 宋爭昌, 趙 立

(1 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院, 遼寧 沈陽 110004; 2 沈陽市第四人民醫(yī)院, 遼寧 沈陽 110031; 3 朝陽市第四人民醫(yī)院, 遼寧 朝陽 122000; 4 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 山東 泰山 271000)

·論著·

內(nèi)科重癥監(jiān)護病房銅綠假單胞菌醫(yī)院感染同源性及臨床特點

張 萍1, 2, 劉紅梅3, 陳 愉1, 趙思宏1, 李玉榮2, 宋爭昌4, 趙 立1

(1 中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院, 遼寧 沈陽 110004; 2 沈陽市第四人民醫(yī)院, 遼寧 沈陽 110031; 3 朝陽市第四人民醫(yī)院, 遼寧 朝陽 122000; 4 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 山東 泰山 271000)

目的 研究內(nèi)科重癥監(jiān)護病房(MICU)銅綠假單胞菌(PA)醫(yī)院感染的同源性及臨床特點，以指導(dǎo)臨床預(yù)防PA傳播，提高治療效果。方法 對某院2014年1—12月MICU發(fā)生醫(yī)院感染的25例患者分離的55株P(guān)A進行脈沖場凝膠電泳(PFGE)同源性分析及聚類分析，對其臨床特點、耐藥性及其傳播特點進行分析。結(jié)果 共調(diào)查25例患者，平均年齡為(69.62±2.13)歲，平均住院時間(49.34±3.18)d；在分離出PA之前，84.00%的患者應(yīng)用廣譜抗菌藥物>2 周，76.00%的患者入住過MICU，52.00%的患者使用呼吸機輔助通氣。55株P(guān)A主要以A、F、H、K、N、V、W型為主要的流行菌株；感染A型、F型、H型及K型菌株的患者在各自住院時間上均存在交叉；有4例患者不同時期分離菌株的PFGE圖譜分析顯示不同菌型；PA對頭孢他啶(72.73%)、哌拉西林/他唑巴坦(70.91%)、亞胺培南(70.91%)耐藥率高，對阿米卡星耐藥率最低(25.45%)。結(jié)論 醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)加強抗菌藥物管理，加強醫(yī)院感染控制措施，防止多重耐藥和泛耐藥細菌在醫(yī)院內(nèi)的播散。

重癥監(jiān)護病房； 銅綠假單胞菌； 脈沖場凝膠電泳； 同源性； 傳播特點； 臨床分析

[Chin J Infect Control，2017，16(7)：600-605]

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)屬于非發(fā)酵菌類假單胞菌屬。廣泛分布于自然界及人和動物體表、腸道中，是一種常見的條件致病菌，尤其在醫(yī)院環(huán)境中PA檢出率很高。由于PA具有易定植、易變異、易耐藥等特征，防治多重耐藥銅綠假單胞菌(MDR-PA)感染已成為醫(yī)院感染監(jiān)測的重點。根據(jù)美國醫(yī)院流行病學(xué)協(xié)會[1]推薦的常見病原菌分型鑒定方法，PA推薦分型是使用脈沖場凝膠電泳(PFGE)，此技術(shù)具有很高的特異性和分辨力，能夠較好的反映流行病學(xué)相關(guān)性，是公認的醫(yī)院感染調(diào)查最好的分型方法。本研究對某院2014年1—12月內(nèi)科重癥監(jiān)護病房(MICU)發(fā)生醫(yī)院感染的25例患者分離出的55株P(guān)A進行PFGE同源性分析及聚類分析，對其臨床特點、耐藥性及傳播特點進行分析，以指導(dǎo)臨床預(yù)防PA的傳播，提高治療效果。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取2014年1—12月某院MICU發(fā)生醫(yī)院感染的25例患者，共分離55株P(guān)A，其中52株來自痰，3株來自導(dǎo)管引流液。收集并分析25例MICU患者的臨床資料。醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)衛(wèi)生部2001年頒發(fā)的《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)》[2]。

1.2 試劑和儀器 蛋白酶K(日本TaKaRa 公司)，SpeI限制性內(nèi)切酶(美國Promega 公司)，λMarker、低熔點瓊脂糖、CHEF-Mapper XA 型脈沖電泳儀、GIS-700D 數(shù)碼圖像掃描分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)，低溫高速臺式離心機(美國科峻公司)。

1.3 PFGE檢測 將細菌接種于LB肉湯振蕩培養(yǎng)過夜，12 000 r/min 離心1 min；CSB緩沖液1 mL洗滌后，8 000 r/min離心5 min，棄去上清；應(yīng)用EC緩沖液調(diào)整菌液濁度，用2%的低熔點瓊脂糖迅速混勻加入模具，用蛋白酶K進行裂解；加入限制性內(nèi)切酶SpeI，37 ℃、24 h進行酶切；酶切后小膠塊包埋于1%瓊脂糖凝膠中，使用CHEF Mapper XA系統(tǒng)進行電泳；將凝膠置于EB溶液中染色，應(yīng)用紫外透射儀進行拍照。結(jié)果參照Tenover等[3]方法，如PFGE圖譜一致，說明為相同菌株；1～3條帶不同說明菌株間有相近關(guān)系，只有單基因的改變；4～6條帶不同說明菌株間可能有相近關(guān)系，有2個基因的改變；6條及以上條帶不同，說明有3個或更多基因的變化，視為無相關(guān)性。

1.4 聚類分析 根據(jù)PFGE電泳的基因圖譜將條帶轉(zhuǎn)換為二進制數(shù)據(jù)，其中“1”代表有，“0”代表無。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中，應(yīng)用譜系聚類分析繪制樹狀圖。

1.5 藥敏試驗 采用美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2014年版推薦的紙片擴散(K-B)法測定55株P(guān)A對9種抗菌藥物的耐藥率。敏感性判定根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)進行判讀。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共調(diào)查25例患者，其中男性18例，女性7例；平均年齡為(69.62±2.13)歲，平均住院時間(49.34±3.18)d；既往有高血壓、糖尿病及冠心病等不同基礎(chǔ)疾病的患者19例。

2.2 臨床資料 20例患者有發(fā)熱，體溫為37.4～40.0 ℃。23例患者伴有咳嗽、咳痰，其中1例患者痰中帶血，所有患者肺部聽診均為呼吸音粗或散在干濕啰音。實驗室檢查結(jié)果顯示18例患者白細胞升高，11例患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高，11例患者有低蛋白血癥。所有患者胸部放射線檢查均提示肺部多葉段炎癥?；颊咴诜蛛xPA之前，均使用過廣譜抗菌藥物，在分離PA之后，根據(jù)藥敏結(jié)果選用抗菌藥物治療，同時還給予化痰及調(diào)節(jié)免疫等治療。經(jīng)系統(tǒng)診治，3例患者死亡，年齡均>60歲，既往均有基礎(chǔ)疾病。18例患者病情好轉(zhuǎn)出院，2例患者未待病情穩(wěn)定自行出院，2例患者病情相對平穩(wěn)，仍呼吸機輔助通氣繼續(xù)住院治療。

2.3 危險因素 25例患者中19例(76.00%)患者既往有基礎(chǔ)疾??；17例(68.00%)患者年齡>60歲；既往有手術(shù)史患者12例(48.00%)，其中氣管切開術(shù)后患者6例。在分離出PA之前，21例(84.00%)患者應(yīng)用廣譜抗菌藥物2 周以上；19例(76.00%)患者入住過MICU；13例(52.00%)患者行呼吸機輔助通氣；12例(48.00%)患者使用呼吸機超過1 周；11例(44.00%)患者有低蛋白血癥；7例(28.00%)患者留置導(dǎo)尿管；4例(16.00%)患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。

M：Marker；1、3、5、7為A型菌株；2、4、6為F型菌株；8為H型菌株；9為K型菌株；10為V型菌株

圖1 銅綠假單胞菌PFGE圖譜

Figure 1 PFGE map ofP.aeruginosa

2.4 PFGE電泳結(jié)果 55株P(guān)A染色體經(jīng)酶切后，產(chǎn)生15～23條DNA片段，片段大小約為20～420 kb，見圖1。聚類分析結(jié)果可見，PA為A～W共23型，其中A、F、H、K、N、V、W型為主要的流行菌株；其中A型6株，分2個亞型(48號、51號、52號、54號及55號為同一亞型)，F(xiàn)型5株，H型4株，K型7株，N型3株，V型7株；W型3株，分2個亞型(28號和30號為同一亞型)。見圖2。

2.5 藥敏結(jié)果 55株P(guān)A對頭孢他啶的耐藥率為72.73%、對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南的耐藥率均為70.91%；對阿米卡星的耐藥率最低，為25.45%。對其他常見抗菌藥物的耐藥情況見表1。

圖2 銅綠假單胞菌PFGE的聚類分析

Table 1 Resistance of 55 strains ofP.aeruginosato 9 commonly used antimicrobial agents

抗菌藥物耐藥菌株耐藥率(%)哌拉西林/他唑巴坦3970．91頭孢他啶4072．73頭孢吡肟2341．82亞胺培南3970．91妥布霉素1629．09慶大霉素1527．27阿米卡星1425．45環(huán)丙沙星2749．09左氧氟沙星2545．45

2.6 傳播特點 25例患者分離的55株P(guān)A主要包括A、F、H、K、N、V、W 7種基因型。A型菌株中5例患者在住院時間上存在交叉，其中51號、52號為同一患者分離的菌株，見圖3。F型菌株中3例患者在住院時間上存在交叉，其中4號、6號、9號為同一患者分離的菌株，見圖4。H型菌株中2例患者在住院時間上存在交叉，其中5號、8號、10號為同一患者先后分離的菌株，見圖5。K型菌株中5例患者在住院時間上存在交叉，其中41號與42號、43號與44號為同一患者分離菌株，見圖6。N型菌株、V型菌、W型菌為同一患者分離菌株。

注：從上至下依次為48、51、52、50、54、55號菌株，其中51、52號菌株來源于同一患者

圖3 A型PA分離日期及來源患者住院時間分布圖

Figure 3 Distribution of isolation date of type AP.aeruginosaand hospitalization time of source patients

注：從上至下依次為12、16、4、6、9號菌株，其中4、6、9號菌株來源于同一患者

圖4 F型PA分離日期及來源患者住院時間分布圖

Figure 4 Distribution of isolation date of type FP.aeruginosaand hospitalization time of source patients

注：從上至下依次為8、10、7、5號菌株，其中5、8、10號菌株來源于同一患者

圖5 H型PA分離日期及來源患者住院時間分布圖

Figure 5 Distribution of isolation date of type HP.aeruginosaand hospitalization time of source patients

注：從上至下依次為41、45、42、43、44、40、39號菌株，其中41號與42號、43號與44號分別來源于同一患者

圖6 K型PA分離日期及來源患者住院時間分布圖

Figure 6 Distribution of isolation date of type KP.aeruginosaand hospitalization time of source patients

3 討論

PA是醫(yī)院感染最常見的革蘭陰性條件致病菌之一。2013年我國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測[4]數(shù)據(jù)顯示，PA在臨床分離的不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌中占第2位。全球性細菌耐藥監(jiān)測SENTRY連續(xù)多年監(jiān)測數(shù)據(jù)也顯示，PA是引起醫(yī)院獲得性肺炎和呼吸機相關(guān)肺炎最多見的革蘭陰性桿菌[5]。近年來，隨著各種抗菌藥物在臨床的廣泛使用，出現(xiàn)了多重耐藥PA，甚至全耐藥PA。MDR-PA已經(jīng)成為各地區(qū)臨床治療的棘手問題。

本文研究的25例PA醫(yī)院感染患者，平均年齡為(69.62±2.13)歲，平均住院時間為(49.34±3.18)d，76.00%的患者有基礎(chǔ)疾病。在分離出PA之前，19例患者入住過MICU；84.00%的患者應(yīng)用廣譜抗菌藥物大于2 周 ；13例患者病情危重需行呼吸機治療，其中7例為氣管插管，6例為氣管切開術(shù)后，患者氣道開放，肺損傷加重，更容易感染病原菌。4例患者使用過糖皮質(zhì)激素，44.00%的患者為低蛋白血癥；病情危重患者機體免疫力低下，糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，也降低了機體免疫力，使其極易發(fā)生醫(yī)院感染，以上結(jié)果與Falagas等[6]報道相一致。雖經(jīng)積極治療，仍有3例患者死亡，年齡均大于60歲，既往均有基礎(chǔ)疾病。

本研究的藥敏試驗結(jié)果顯示，PA對頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南呈高耐藥性，耐藥率均達70%以上，高于楊旭輝等[7]的報道，也高于2011年我國CHINET 銅綠假單胞菌耐藥監(jiān)測[8]報道PA的耐藥率。分析其原因考慮一是由于25例患者來自MICU，既往基礎(chǔ)疾病重，需要長期應(yīng)用廣譜抗菌藥物，并且存在留置多種導(dǎo)管、機械通氣、人工吸痰等因素，使感染耐藥菌的機會大大增加[9-11]；二是可能與醫(yī)院近年來廣泛使用該類藥物有關(guān)，所以近期應(yīng)該限制性使用該類藥物，待其敏感性恢復(fù)。2010年我國CHINET銅綠假單胞菌耐藥監(jiān)測報道不同臨床科室分離的PA耐藥率不同，ICU病房分離PA耐藥率高于其他科室[12]。PA臨床感染逐漸增多，其對碳青霉烯類抗生素耐藥率亦有逐年上升的趨勢[13]。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)PA對一些抗菌藥物較敏感，如喹諾酮類(環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)、β-內(nèi)酰胺類(頭孢吡肟)、氨基糖苷類(阿米卡星、慶大霉素和妥布霉素)，其中阿米卡星耐藥率最低。多個全球性耐藥監(jiān)測，如SENTRY、SMART及SERNIR等數(shù)據(jù)也顯示，PA對阿米卡星耐藥率最低，原因可能是該類藥物對多數(shù)氨基糖苷類鈍化酶穩(wěn)定，并且在臨床中的用量較其他類藥物少[5，14-15]。臨床應(yīng)依照藥敏試驗結(jié)果，選用抗菌活性強的藥物，對嚴重感染者需聯(lián)合用藥，防止或減慢耐藥菌株的產(chǎn)生[16]。輪換使用抗菌藥物可以分散抗菌藥物選擇性壓力，選擇耐藥率低的抗菌藥物進行輪換，亦有助于恢復(fù)細菌的耐藥性[17]。

本文PFGE圖譜及聚類分析樹圖顯示，55株P(guān)A以A、F、H、K、N、V、W基因型為主要流行株，說明MICU中存在PA的克隆傳播。由傳播特點可見，A型、F型、H型及K型菌株在各自住院時間上均存在交叉，表明出現(xiàn)了同一醫(yī)療單元即同病房的同型菌株的克隆傳播，通過醫(yī)療器械及治療處置時造成交叉感染的可能性大。另外，有4例患者不同時期分離菌株的PFGE圖譜分析顯示不同菌型， 43號、44號、47號、48號為同一患者感染菌株檢出K型、P型及A型，藥敏試驗結(jié)果提示對左氧氟沙星由敏感轉(zhuǎn)為耐藥；23號、26號、28號、30號、38號為同一患者感染菌株檢出C型和W型，藥敏試驗結(jié)果提示對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星由敏感轉(zhuǎn)為耐藥；14號、16號為同一患者感染菌株檢出I型和F型，為全耐藥菌型；51號、52號、53號為同一患者感染菌株檢出A型和E型，藥敏試驗結(jié)果提示對頭孢吡肟及阿米卡星由敏感轉(zhuǎn)為耐藥，這與王繼東等[18]報道患者PA醫(yī)院感染存在多克隆感染或反復(fù)不同株感染相類似。由于廣譜抗菌藥物在臨床上廣泛使用，容易導(dǎo)致出現(xiàn)MDR-PA，甚至泛耐藥銅綠假單胞菌(PDR-PA)。PDR-PA大多分離來自ICU，且多為克隆傳播[11]，易引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

本文通過PFGE方法分析PA菌株之間的親緣關(guān)系，監(jiān)測是否有克隆播散，可追蹤暴發(fā)流行來源及傳播途徑，有效控制醫(yī)院感染。因此，醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)加強細菌耐藥監(jiān)測，關(guān)注我國細菌耐藥性的發(fā)展趨勢，加強抗菌藥物管理，加強醫(yī)院感染控制措施，防止多重耐藥和泛耐藥細菌在醫(yī)院內(nèi)的播散。

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(本文編輯：劉思娣)

Homology and clinical characteristics of healthcare-associated infection withPseudomonasaeruginosain medical intensive care unit

ZHANGPing1,2,LIUHong-mei3,CHENYu1,ZHAOSi-hong1,LIYu-rong2,SONGZheng-chang4,ZHAOLi1
(1ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China； 2TheFourthPeople’sHospitalofShenyang,Shenyang110031,China； 3TheFourthPeople’sHospitalofChaoyang,Chaoyang122000,China； 4AffiliatedHospitalofTaishanMedicalUniversity，Taishan271000,China)

Objective To study the homology and clinical characteristics of healthcare-associated infection(HAI) due toPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa) in medical intensive care unit (MICU), so as to guide the clinical prevention ofP.aeruginosatransmission and improve therapeutic effect. Methods 55P.aeruginosastrains isolated from 25 patients with HAI in the MICU of a hospital in January-December 2014 were performed pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) homology analysis and clustering analysis, clinical characteristics, antimicrobial resistance, and transmission characteristics were analyzed.Results A total of 25 patients were investigated, with an average age of (69.62±2.13) years, mean hospital stay (49.34±3.18) days; prior to the isolation ofP.aeruginosa, 84.00% of patients were treated with broad-spectrum antimicrobial agents for >2 weeks, 76.00% of patients had been admitted to MICU, and 52.00% had a ventilator-assisted ventilation. 55 strains ofP.aeruginosawere mainly A, F, H, K, N, V, and W, which were the main epidemic strains; patients infected with A, F, H and K strains all had cross in their hospital stay； PFGE profiles of isolates from 4 patients during different periods showed different strain patterns; resistance rates ofP.aeruginosato ceftazidime (72.73%), piperacillin/tazobactam (70.91%), and imipenem(70.91%) were all high, resistance rate to amikacin was the lowest(25.45%). Conclusion Management of antimicrobial agents should be strengthened in medical institutions, HAI control measures should be strengthened, so as to prevent the transmission of multidrug-resistant and extensively drug-resistant bacteria in hospitals.

intensive care unit;Pseudomonasaeruginosa； pulsed-field gel electrophoresis； homology; spread characteristic； clinical analysis

2016-07-24

張萍(1987-)，女(漢族)，遼寧省鐵嶺市人，醫(yī)師，主要從事老年患者肺部感染性疾病的防治研究。

陳愉 E-mail:chenyusy@hotmail.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.07.003

R378.99+1

A

1671-9638(2017)07-0600-06