丁型肝炎病毒復制包裝載體的構建*

李穎，張五星，周偉，王學軍

（1.河北北方學院 研究生部，河北 張家口 075061；2.中國人民解放軍第309醫(yī)院 腎臟內科，北京 100091；3.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850）

丁型肝炎病毒復制包裝載體的構建*

李穎1，張五星2，周偉2，王學軍3

（1.河北北方學院 研究生部，河北 張家口 075061；2.中國人民解放軍第309醫(yī)院 腎臟內科，北京 100091；3.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850）

目的 構建一種可以實現(xiàn)丁型肝炎病毒（HDV）復制包裝的HDV轉座子載體。方法 采用分子克隆方法構建含HDV復制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表達框的轉座子（PB）載體PB126I3，將構建好的載體轉染HuH-7細胞，轉染48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達，轉染48 h后收集細胞上清用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測HBsAg的表達，質粒轉染細胞8.5 d后提取病毒用逆轉錄熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測HDV核糖核酸（RNA）的含量；同時細胞上清病毒濃縮后感染HBV受體鈉離子/?；悄懰峁厕D運蛋白（Na+/NTCP）穩(wěn)定轉染的HepG2.N9細胞系并于感染后第7天用免疫熒光檢測細胞內HDVδ抗原的表達。結果 HDV復制包裝載體PB126I3瞬時轉染HuH-7后細胞上清可檢測到HBsAg的表達和較高滴度的HDV顆粒，并且該病毒顆粒感染HepG2.N9細胞7 d后細胞內可檢測到HDVδ抗原。結論 HDV復制包裝轉座子載體構建成功，為未來HDV的大規(guī)模復制包裝以及嘗試建立HDV穩(wěn)定轉染細胞系提供前期基礎。

丁型肝炎病毒；載體構建；復制；包裝；瞬時轉染

丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）是一種缺陷核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，其包裝分泌和傳播需要乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的幫助，與單獨HBV感染相比，HBV與HDV共同感染后會導致肝硬化的速度加快，并使暴發(fā)性肝炎和肝細胞癌的發(fā)生率提高[1-3]。我國是乙型病毒性肝炎患病大國，與HBV比較，目前缺乏對HDV的全面了解，加強對HDV的深入研究很有必要。

目前HDV的獲取方式只有2種：一種是從丁型肝炎患者的血清中直接提取HDV，但是我國丁型肝炎的患者比較少見，若想依賴從血清中直接提取HDV的這種途徑不是很理想；另外一種是基于質粒瞬時轉染HuH-7肝癌細胞系的HDV包裝方法[4]。本研究嘗試建立含有HDV復制子和我國HBV流行株C基因型表面抗原表達框的HDV表達載體，實現(xiàn)體外大規(guī)模包裝，為進一步研究HDV感染復制特性提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

JC126載體（T JOHN 教授饋贈），pHBV1.31（C基因型）（由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所構建并保存[5]），PB513B-1載體（購自美國System Biosciences公司），HuH-7細胞（購自上海中國科學院細胞庫），HepG2細胞（購自美國ATCC公司），HepG2.N9細胞（軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所生物技術實驗室構建并保存[6]），含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（購自澳大利亞 Bovogen公司），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、質粒提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司），限制性內切酶DNaseI（購自美國NEB公司），DNA快速連接試劑盒（D6022）、TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0、Prime ScriptTMRT Master Mix（perfect real time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH plus）及DNA marker DL15000（均購自日本TaKaRa公司），體外轉染試劑Gen JetTMVerⅡ（美國SignaGen公司產品），DMEM、MEM、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰酶及雙抗（青霉素 -鏈霉素）等（購自北京中科邁晨科技有限公司），Williams E培養(yǎng)基、驢抗兔Alexa FluorTM594標記二抗及Slow Fade Gold Antifade Mountant with DAPI（購自美國InvitrogenTM公司），兔抗人丁型肝炎病毒δ抗原多克隆抗體由北京澤溪源有限公司制備，引物合成和質粒測序由中美泰和生物技術（北京）有限公司提供服務。

1.2 方法

1.2.1 含HDV復制子的PB轉座子載體的構建按常規(guī)分子生物學方法操作：以含1.1倍HDV復制子的JC126載體為模板，用引物JC126，正向引物：5-'CACCAATTGATCCTCTAGAGTCGACCCCA-3'，反向引物：5-'GTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC AAG-3'。擴增HDV復制子片段，然后經MfeⅠ-HF和BamHⅠ-HF雙酶切后插入線性化的PB513B-1載體（經EcoRⅠ-HF和BamHⅠ-HF雙酶切）得到PB126載體；PB126載體依次用NotI-HF和BamHⅠ-HF酶切，然后與含HBV表面抗原表達框的片段（pHBV1.31經BglⅡ和NotⅠ-HF雙酶切后回收的約2 800 bp大小片段）相連接得到目標載體PB126I3。質粒經酶切和測序鑒定正確后用于下一步實驗。

1.2.2 質粒轉染HuH-7細胞 從液氮罐中取出HuH-7細胞，37℃快速解凍，離心后用含10%FBS的DMEM進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳CO2的孵箱。2 d后觀察細胞貼壁且融合程度達到80%，此時細胞生長狀態(tài)良好，處于對數生長期，將其消化并接種于24孔板或10 cm皿內繼續(xù)培養(yǎng)，細胞貼壁且融合程度達到70%～80%后，用Gen JetTMVerⅡ體外轉染試劑進行質粒轉染。

1.2.3 觀察增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP） 的 表 達 質 粒 轉 染HuH-7細胞48 h后，用普通熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達確定質粒轉染是否成功并粗略估計質粒轉染效率。

1.2.4 ELISA檢測細胞上清乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface，HBsAg）的表達 質粒轉染細胞48h后收集細胞上清用HBsAg檢測試劑盒進行ELISA檢測。細胞上清稀釋5倍取75μl加入檢測HBsAg的96孔板中，并取試劑盒中的陽性對照和陰性對照各75μl作為對照組，用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育60 min；取出反應板，向每孔中加入50μl試劑盒中的HBsAg酶結合物，手工輕輕震蕩10 s；用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；取出反應板，撕去封片紙，洗滌反應板5次，在干凈的吸水紙上拍干；洗滌結束后，立即向每個孔中加入50μl的顯色劑A和50μl的顯色劑B，混勻；手工輕輕震蕩10 s；用封片紙覆蓋后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；向每個孔中加入50μl的終止液，震蕩5 s混勻后；用酶標儀讀數，波長450 nm，若需扣除顯色劑空白，則先用顯色劑空白對照孔校零，然后讀取各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定HDV滴度 質粒轉染細胞第8.5天收集細胞上清并用0.45μm濾器過濾去除細胞碎片后，用DNaseⅠ在37℃消化1 h，然后用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取上清液中的HDV RNA，通過Prime Script?RT Master Mix試劑盒將RNA逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（complemen tary deoxyribonucleic acid，cDNA），然后通過 qRTPCR測定HDV滴度，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ檢測HDV RNA的拷貝數（HDV正向引物：5'-GGACC CCTTCAGCGAACA-3'；HDV 反向引物：5'-CCTAGC ATCTCCTCCTATCGCTAT-3'）。

1.2.6 HDV病毒濃縮 質粒轉染細胞第8.5天后收集細胞上清液，用0.45μm濾器過濾收集的病毒液以去除細胞碎片，按體積比4∶1比例加入25%聚乙二醇 8 000（polyethylene glycol，PEG)，混勻后放于4℃冰箱沉淀過夜，隨后4℃條件下12 000 r/min離心40 min，棄上清液，再離心5 min并徹底吸棄上清液，加入一定體積DMEM或Williams E培養(yǎng)基溶解沉淀，分裝并置于80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 HDV病毒感染性檢測 將生長狀態(tài)良好的HepG2和HepG2.N9細胞消化后置共聚焦用培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，24 h后培養(yǎng)基更換為含有2%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），18μg/ml氫化可的松，40 ng/ml地塞米松，10 ng/ml EGF，5μg/ml轉鐵蛋白，3μg/ml胰島素，2 mmol L-谷氨酰胺，5 ng/ml亞硒酸鈉，100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Williams E完全培養(yǎng)基并培養(yǎng)48 h，然后用含4%PEG 8000和500拷貝/細胞的HDV病毒Williams E完全培養(yǎng)基在37℃感染16 h。感染后每48 h更換1次Williams E完全培養(yǎng)基。感染后第7天用免疫熒光檢測HDVδ抗原的表達。

1.2.8 免疫熒光方法檢測HDVδ抗原 HDV感染細胞第7天后用PBS清洗細胞3遍，加入500μl 4%多聚甲醛固定15min；PBS清洗3遍，加入500μl 0.5%TritonX-100溶液進行常溫透膜處理15 min；PBS清洗3遍，加入（2%BSA+5%山羊血清+PBS）混合溶液室溫孵育30 min進行封閉；PBS清洗3遍，加入一抗孵育，4℃冰箱過夜；37℃復溫10 min，PBS清洗3遍，加入二抗孵育，常溫避光1 h；PBS清洗5遍，加入DAPI復染3～5 min；PBS清洗3遍，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 6作圖軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 含HDV復制子的PB轉座子質粒成功構建

原載體SBI513B-1、重組載體PB126和PB126I3經BamHⅠ-HF單酶切后跑膠，大小與預期一致。經進一步的測序驗證，PB126I3載體構建成功。該載體采用轉座子載體，啟動子為CMV，啟動子下游為HDV復制子表達框和乙肝表面蛋白表達框；另外該載體還含有eGFP和嘌呤霉素基因，方便轉染效率的觀察和后續(xù)穩(wěn)定轉染細胞的篩選。見圖1～3。

2.2 HDV轉座子質粒轉染48 h后細胞內可見綠色熒光蛋白的表達

質粒轉染HuH-7細胞48 h后熒光顯微鏡下觀察到細胞有綠色熒光的表達且亮度較好，轉染效率在50%左右，質粒轉染成功（見圖4）。

2.3 細胞上清HBsAg定性檢測結果

質粒轉染HuH-7細胞48 h后，轉染PB126I3質粒的細胞上清即可檢測到較高水平HBsAg的表達，為HDV的包裝分泌以及感染傳播提供必要的HBV表面蛋白（見圖5）。

2.4 細胞上清可檢測到較高滴度的HDV RNA

圖1 重組載體酶切鑒定

根據文獻數據質粒轉染HuH-7細胞8.5 d后取細胞上清經DNaseⅠ消化后提取病毒檢測HDV RNA的含量，HuH-7細胞轉染PB126I3載體后細胞上清可檢測到較高滴度的HDV RNA，而轉染PB126載體的HuH-7細胞上清HDV RNA非常低，說明HuH-7轉染PB126I3組HDV被包裝分泌出來，但該HDV顆粒是否具有感染性尚需要進一步驗證（見圖6）。

圖2 PB126I3載體測序代表性圖譜

圖3 PB126I3的載體示意圖

圖4 熒光顯微鏡定性觀察綠色熒光蛋白的表達

圖5 細胞上清HBsAg的表達 （稀釋×5）

圖6 細胞上清HDV RNA含量

2.5 瞬時轉染所包裝分泌的HDV病毒體外具有感染性

通過免疫熒光檢測HDV感染HepG2和HepG2.N9細胞7 d后細胞內HDVδ抗原的表達，HDV可特異性地感染表達HBV受體NTCP的HepG2.N9細胞，證明細胞上清濃縮液中含有感染性HDV病毒顆粒（見圖7）。

圖7 HDV病毒感染細胞后HDVδ抗原的表達

3 討論

HDV為HBV的衛(wèi)星病毒，其感染肝細胞、在肝細胞中包裝、釋放出肝細胞及再感染其他肝細胞均需要HBsAg的幫助，所以HDV的包裝分泌只能在有HBsAg表達的細胞內才能進行，體外包裝亦需要HDV和編碼HBsAg包膜蛋白的質粒共同轉染肝細胞[7-10]。自20世紀90年代初以來，已經開發(fā)不同的基于cDNA或無cDNA的轉染系統(tǒng)用于HDV復制的體外研究，尤其是由M Y KUO等人[11]構建的HDV全基因組三聚體pSVLD3重組質粒被廣泛應用于各種HDV的實驗中。

本實驗在國內外研究基礎上成功構建HDV復制包裝轉座子載體，其含有1.1倍HDV基因組和HBV中國流行株C基因型的HBsAg表達框，該載體經體外轉染HuH-7肝癌細胞成功實現(xiàn)HDV體外的復制包裝，結果顯示轉染細胞后細胞上清含有較高滴度的HDV病毒顆粒。

近年科學家發(fā)現(xiàn)，鈉離子-?；悄懰峁厕D運蛋白（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，Na+/NTCP）是HBV和HDV的重要受體，將NTCP導入HepG2、HuH7等人類肝癌細胞系可實現(xiàn)HBV/HDV的感染復制，極大地改善實驗的可重復性[12-13]，本實驗室前期成功構建NTCP的穩(wěn)定轉染細胞系HepG2.N9[6]。本研究應用該細胞系成功證明利用本文所構建載體包裝分泌的HDV顆粒體外可以有效感染HepG2.N9細胞，證實所包裝HDV的體外感染性。該載體的成功構建為進一步研究HDV感染、復制等特性提供前期技術基礎。

不過應該考慮到利用瞬時轉染技術生產HDV的方法工作量大，實驗批次之間的可重復性不夠理想。另外以往研究發(fā)現(xiàn)，HDV復制對細胞有毒性[14]，到目前為止尚沒有一種支持HDV穩(wěn)定復制包裝的細胞系，簡單有效地實現(xiàn)HDV的大規(guī)模穩(wěn)定生產還是尚未解決的難題。最近，廈門大學發(fā)表基于腺病毒的HDV病毒包裝新方法，解決了一定的問題[15]，較早的研究亦發(fā)現(xiàn)，HDV可在特定細胞內實現(xiàn)穩(wěn)定表達[16]。雖然該前期研究結果比較矛盾，但推測通過體外篩選不同的細胞系有可能實現(xiàn)HDV穩(wěn)定轉染細胞系的建立，用于HDV的大規(guī)模生產和抗HDV病毒潛在藥物評價，而本文所構建的HDV復制包裝轉座子載體為未來HDV穩(wěn)定轉染細胞系建立提供前期基礎和有力保障。

[1]SHEN L,GU Y,SUN L,et al.Development of a hepatitis delta virus antibody assay for study of the prevalence of HDV among individuals infected with hepatitis B virus in China[J].Journal of Medical Virology,2012,84(3):445-449.

[2]CUNHA C,TAVANEZ J P,GUDIMA S.Hepatitis delta virus:A fascinating and neglected pathogen[J].World Journal of Virology,2015,4(4):313-322.

[3]SUREAU C,NEGRO F.The hepatitis delta virus:Replication and pathogenesis[J].Journal of Hepatology,2016,64(1):S102-116.

[4]ABOUJAOUDé G,SUREAU C.Entry of hepatitis delta virus requires the conserved cysteine residues of the hepatitis B virus envelope protein antigenic loop and is blocked by inhibitors of thiol-disulfide exchange[J].J Virol,2007,81(23):13057-13066.

[5]WANG X J,ZHANG X J,HU W,et al.A simple and efficient strategy for the de novo construction of greater-than-genome-length hepatitis B virus replicons[J].J VirolMethods,2014,207(10):158-162.

[6]WANG X J,HU W,ZHANG T Y,et al.Irbesartan,an FDA approved drug for hypertension and diabetic nephropathy,is a potent inhibitor for hepatitis B virus entry by disturbing Na(+)-dependent taurocholate cotransporting polypeptide activity[J].Antiviral Research,2015(120):140-146.

[7]ALFAIATE D,DéNY P,DURANTEL D.Hepatitis delta virus:from biological and medical aspects to current and investigational therapeutic options[J].Antiviral Research,2015(122):112-129.

[8]SHARMEEN L,KUO M Y,DINTERGOTTLIEB G,et al.Antigenomic RNA of human hepatitis delta virus can undergo selfcleavage[J].Journal of Virology,1988,62(8):2674-2679.

[9]ALVARADOMORA M V,LOCARNINI S,RIZZETTO M,et al.An update on HDV:virology,pathogenesis and treatment[J].Antivir Ther,2013,18(3 Pt B):541-548.

[10]TAYLOR J M.Hepatitis D virus peplication[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine,2015,5(11):a021568.

[11]KUO M Y,CHAO M,TAYLOR J.Initiation of replication of the human hepatitis delta virus genome from cloned DNA:role of delta antigen[J].Journal of Virology,1989,63(5):1945-1950.

[12]NI Y,LEMPP F A,MEHRLE S,et al.Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes[J].Gastroenterology,2014,146(4):1070-1083.

[13]YAN H,ZHONG G,XU G,et al.Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus[J].Elife,2012,1:e00049.

[14]WANG D,PEARLBERG J,LIU Y T,et al.Deleterious effects of hepatitis delta virus replication on host cell proliferation[J].Journal of Virology,2001,75(8):3600-3604.

[15]ZHAO J H,ZHANG Y L,ZHANG T Y,et al.A novel toolbox for the in vitro assay of hepatitis D virus infection[J].Scientific Reports,2017,7:40199.

[16]CHEN P J,KUO M Y,CHEN M L,et al.Continuous expression and replication of the hepatitis delta virus genome in HepG2 hepatoblastoma cells transfected with cloned viral DNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(14):5253-5257.

Construction of hepatitis D virus replication vector*

Ying Li1,Wu-Xing Zhang2,Wei Zhou2,Xue-Jun Wang3
(1.Graduate Faculty,Hebei Northern College,Zhangjiakou,Hebei 075061,China;2.Department of Nephrology,the 309th Hospital of PLA,Beijing,100091,China;3.Institute of Radiation Medicine,Military Academy of Medical Sciences,Beijing,100850,China)

ObjectiveTo construct a transposon vector for hepatitis D virus(HDV)replication and packaging.MethodsThe piggyBac(PB)transposon vector PB126I3 containing HDV replicon and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)expression cassette was constructed by using standard molecular cloning methods.HuH-7 cells were transfected with the vector PB126I3.The expression of green fluorescent protein(GFP)was observed by fluorescence microscopy,and the HBsAg expression level in cell medium was detected by ELISA 48 hours after transfection.HDV RNA in cell supernatants was extracted and detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)8.5 days after transfection.Meanwhile,HDV particles in cell medium were concentrated and infected the HepG2.N9 cells which were stably transfected with HBV receptor NTCP.The cellular expression of HDV δ antigen was detected by immunofluorescence 7 days after infection.ResultsHuH-7 cells were successfully transfected by the vector PB126I3,and secreted a large number of HBsAg and HDV particles in cell medium.HDV δ antigen was detected obviously in HepG2.N9 cells 7 days after HDV infection.ConclusionsHDV replicon vector PB126I3 were successfully constructed for HDV replication and packaging,which will promote the large-scale of HDV production and HDV transgenic hepatocyte cell line establishment in the future.

hepatitis D virus;vector construction;replication;packaging;transient transfection

R516.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.006

1005-8982（2017）11-0031-05

2017-03-03

國家863青年科學家項目（No：2015AA020946）；北京市科技新星項目（No：Z171100001117119）

王學軍，E-mail：xjwang@bmi.ac.cn