沉默中期因子對肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響

劉晶華，鄒玉，吳鈞，常巍

（1.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650031；3.昆明醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計教研室，云南 昆明 650000）

臨床研究·論著

沉默中期因子對肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響

劉晶華1，鄒玉3，吳鈞2，常巍1

（1.云南省第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，云南 昆明 650031；3.昆明醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)計教研室，云南 昆明 650000）

目的 探討中期因子（MDK）在肝細胞肝癌（HCC）中的表達及對腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。方法 選取2015年1月-2016年10月該院收治的50例肝癌患者組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)染色分析組織中MDK的表達。利用沉默核糖核酸（siRNA）沉默人肝細胞癌HepG2細胞內(nèi)MDK表達，分別采用CCK-8、流式細胞儀及插入式細胞培養(yǎng)皿、穿透小室（Transwell）檢測沉默MDK后HepG2細胞增殖、凋亡及侵襲能力變化。結(jié)果 肝癌組織中MDK蛋白的表達水平較癌旁組織提高（χ2=19.643，P=0.000）；在HepG2細胞中，沉默MDK的表達可抑制HepG2細胞增殖（F=22.204，P=0.037）和侵襲（t=5.611，P=0.008）能力，并提高HepG2細胞的凋亡比例（t=5.702，P=0.006）。結(jié)論 MDK在肝癌中表達升高，沉默肝癌HepG2細胞內(nèi)MDK表達能夠抑制肝癌細胞生長和侵襲。

中期因子；肝細胞癌；增殖；凋亡；侵襲

原發(fā)性肝癌包括肝細胞性肝癌、膽管細胞性肝癌和混合性肝癌等多種病理類型[1]。目前，我國原發(fā)性肝癌的病理類型以肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）為主[2]。以外科手術(shù)為主，配合介入化療及生物靶向治療的綜合治療方案對各臨床分期的肝細胞癌患者均有一定的療效。但總體來看，患者治療后復(fù)發(fā)率較高，導(dǎo)致患者的5年生存率仍然很低[3]。在傳統(tǒng)治療方法漸入瓶頸之時，尋找新的基因治療靶點有可能為肝細胞癌的治療打開一個新的思路。

中期因子（midkine，MDK）是一種分泌型肝素結(jié)合生長因子。MDK由11號染色體p11.2位點上的基因編碼，成熟的MDK分子量較小僅為14 kD[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MDK作為腫瘤微環(huán)境中的重要效應(yīng)因子之一，在胃癌[5]及乳腺癌[6]中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，對腫瘤細胞的增殖和侵襲行為均有一定的促進作用。然而，MDK在肝細胞癌中的臨床意義及生物學(xué)功能尚不完全明確。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色、CCK-8（cell counting kit-8）、流式細胞儀及插入式細胞培養(yǎng)皿、穿透小室（Transwell）侵襲小室模型，檢測MDK在HCC組織中的表達及其對HCC細胞生長和侵襲的影響，以期為研究MDK在肝癌診治中的價值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料

選取2015年1月-2016年10月本院普通外科收集50例肝癌及對應(yīng)癌旁組織（距切緣＞2 cm）保存。其中，男性37例，女性13例；年齡36～67歲，中位年齡51歲。人肝細胞癌細胞系HepG2（購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所細胞保種庫），DMEM（dulbecco's modified eagle medium）（貨號：11965-084）和胎牛血清（貨號：16000044）（均購自美國Gibco公司），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（貨號：E606335）和Annexin V凋亡檢測試劑盒（FITC/PI雙染法，貨號：E606336）（購自上海生工生物工程有限公司），Trizol試劑（貨號：15596026）、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（貨號：L3000015）、MDK特異性沉默核糖核酸（silencing ribonucleic acid，siRNA）（貨號：AM16708）、陰性對照 siRNA（貨號：4404021）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（Super Script One-StepRT-PCR System withPlatinum Taq DNA Polymerase，貨號：10928042）及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 試劑盒 （DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，貨號：F415L）（購自美國英偉杰公司），MDK抗體（貨號：ab52637）及β-actin抗體（貨號：ab8226）（購自美國Abcam公司），電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）試劑盒（貨號：WBK LS0050）（購自美國密理博公司），8.0μm孔徑Transwell小室（貨號：#3458）（購自美國康寧公司），基質(zhì)膠（貨號：354230）（購自美國BD公司），MDK及βactin qRT-PCR引物序列（見附表）。

附表 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋的標(biāo)本組織切片常規(guī)進行脫蠟及水化預(yù)處理：用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人MDK多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標(biāo)本；4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過夜，洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，二氨基聯(lián)苯胺法顯示陽性蛋白。400×視野下每張組織切片下隨機選取10個視野進行閱片。若有＞10%的癌細胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽性，否則判定為陰性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染 HEPG2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代2、3代。按過夜增殖至愈合度達70%之密度接種6孔細胞培養(yǎng)板。達到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液充分洗滌細胞。轉(zhuǎn)染分組：si-MDK組每孔加入100 pmol的MDK siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑；對照組每孔加入100 pmol的陰性對照siRNA及5 μl轉(zhuǎn)染試劑。添加無血清DMEM培養(yǎng)液至終體積2 ml每孔并培養(yǎng)6 h。移除原有培養(yǎng)基更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR 細胞總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）經(jīng)由Trizol試劑提取。按逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR說明書要求進行逆轉(zhuǎn)錄及擴增反應(yīng)。采用2-△△Ct法計算MDK信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的相對表達量。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測 提取轉(zhuǎn)染72 h后的HEPG2細胞總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用BIO-RAD濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的MDK及肌動蛋白（β-actin）抗體，4℃下孵育過夜。用5%脫脂奶粉溶液按1∶5 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗，室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，ECL法觀察蛋白表達。

1.2.5 CCK-8檢測 分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48及72 h后的HepG2細胞，采用完全培養(yǎng)基重懸后在96孔板內(nèi)以每孔5000個/100μl均勻接種。過夜培養(yǎng)后每孔加入10 μl CCK-8溶液避光培養(yǎng)2 h，吸凈上清液，酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處每樣本的光密度（optical density，OD）值。每個樣本獨立重復(fù)實驗3次。

1.2.6 細胞凋亡檢測 結(jié)合緩沖液（binding buffer）（1×）重懸轉(zhuǎn)染72 h后的HEPG2細胞并調(diào)整細胞密度為2×105個/ml，取195 μl細胞懸液加入流式上樣管中，同時加入5 μl Annexin V-FITC避光反應(yīng)15 min，再次原管重懸細胞后加入10 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光孵育 15 min，＜1 h 于流式細胞儀上進行檢測。

1.2.7 細胞侵襲檢測 收集轉(zhuǎn)染72 h后的HepG2細胞，采用無血清DMEM重懸細胞并調(diào)整密度為2×105個/ml，備用。用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋基質(zhì)膠，取適量基質(zhì)膠充分包被小室膜上室面。包被好的小室在37℃風(fēng)干1 h后，上室內(nèi)加入100μl細胞懸液。24孔板內(nèi)每孔加入750μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室妥善放于24孔板中。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后洗凈小室內(nèi)培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定小室膜上細胞，結(jié)晶紫染色小室膜10 min，PBS沖洗多余染液。棉簽仔細擦除上室面細胞，正置顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，組間非連續(xù)變量資料的比較用χ2檢驗，肝癌與癌旁組織的對比則用配對四格表χ2檢驗；組間比較用兩獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDK在肝癌組織及癌旁組織中的表達

對50例肝癌及癌旁組織中進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，MDK主要于細胞漿中（見圖1）。有78.00%（39/50）的肝癌組織中MDK蛋白為陽性，而僅有34.00%（17/50）的癌旁組織中MDK蛋白陽性表達，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.643，P=0.000）。

2.2 沉默MDK表達對HepG2細胞增殖、凋亡及侵襲的影響

通過siRNA轉(zhuǎn)染特異性調(diào)低MDK mRNA（t=11.302，P=0.000）（見圖 2A）及蛋白（t=3.271，P=0.034）（見圖2B）的表達水平。通過CCK-8增殖分析檢測證明，沉默MDK能抑制HepG2細胞增殖（F=22.204，P=0.037）（見圖2C）。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果表明，下調(diào)MDK表達后，HepG2發(fā)生凋亡的細胞比例大幅升高[（23.614±4.331）vs（12.035±1.204），t=5.702，P=0.006]（見圖2D）。采用Transwell檢測沉默MDK表達后HepG2細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)，低表達MDK的HepG2細胞侵襲過基質(zhì)膠的數(shù)目降低，說明沉默MDK抑制HepG2的侵襲[（22.547±4.361）vs（11.135±3.204），t=5.611，P=0.008]（見圖2E）。

圖1 MDK蛋白在肝癌組織中的表達 （100 μm）

圖2 沉默MDK表達對HepG2細胞增殖、凋亡及侵襲的影響

3 討論

MDK高表達主要出現(xiàn)在胚胎發(fā)育過程中，而出生后組織內(nèi)的表達水平十分低[7]。目前在成年機體內(nèi)，僅腎臟和小腸上皮組織表達MDK分子[8]。然而，在包括組織缺血[9]、炎癥[10]及腫瘤等[11]許多病理過程中，MDK常出現(xiàn)表達增加的情況，且高表達的MDK分子常與疾病進展相關(guān)。由于生理上，MDK具有促進生長及分化調(diào)節(jié)因子，因此在人類胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達MDK對胰腺癌細胞增殖及遷移具有明顯的促進作用[12]，而且臨床研究結(jié)果表明MDK是PDAC患者預(yù)后評價指標(biāo)之一。

總之，筆者通過對50例肝癌患者的檢測發(fā)現(xiàn)，MDK在肝癌組織中表達量高于癌旁組織。目前，入組患者正在接受臨床隨訪，隨訪結(jié)束后筆者將進一步根據(jù)患者的生存情況，對MDK表達及患者的臨床病理特征進行多因素回歸分析，以期進一步明確上述因素對肝癌患者預(yù)后的影響。在人工調(diào)低MDK在肝癌細胞中的表達后，惡性程度較高的肝癌HepG2細胞的增殖、侵襲均受抑制而細胞凋亡卻提高。因而，筆者推斷MDK是一種重要的癌蛋白，在促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。但是目前許多分子治療靶點都存在特異性不強、副作用大等缺點。在體內(nèi)，如何靶向下調(diào)肝癌細胞中MDK的表達將成為MDK研究的熱點和挑戰(zhàn)之一。

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Effect of midkine knockdown for malignant biological feature in human hepatocellular carcinoma

Jing-hua Liu1,Yu Zou3,Jun Wu2,Wei Chang1
(1.Department of Gastroenterology,Second People's Hospital of Yunnan Province,Kunming,Yunnan 650001,China;2.Department of Neurosurgery,Kunming First People's Hospital,Kunming,Yunnan 650031,China;3.Department of Statistics,Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650000,China)

ObjectiveTo study the expression and roles of midkine (MDK)in human hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsA total of 50 HCC tissues and tumor adjacent tissues were collected to detect the expression of MDK by immunohistochemical staining.The expression of MDK in HepG2 cells was silenced by siRNA.Cell proliferation,apoptosis and invasion were detected by CCK-8,flow cytometry and Transwell,respectively.ResultsMDK expression was up-regulated in HCC tissues (P＜0.05).Knockdown MDK in HCC cells was significantly down-regulated cell proliferation,invasion and induced apoptosis.ConclusionsMDK is over-expressed in HCC tissues.Knockdown MDK can inhibit growth and invasion on HepG2 cells.

MDK;hepatocellular carcinoma;proliferation;apoptosis;invasion

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.007

1005-8982（2017）11-0036-05

2017-06-17

常魏，E-mail：1397978466@qq.com