陳盼飛 左力輝 王桂英 王進(jìn)茂 任亞超 楊敏生

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071001； 2.廊坊市農(nóng)林科學(xué)院 廊坊 065000)

鹽脅迫下轉(zhuǎn)復(fù)合多基因歐美楊107楊幼苗生長(zhǎng)及生理響應(yīng)*

陳盼飛1左力輝1王桂英2王進(jìn)茂1任亞超1楊敏生1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 保定 071001； 2.廊坊市農(nóng)林科學(xué)院 廊坊 065000)

【目的】 通過(guò)觀測(cè)轉(zhuǎn)復(fù)合多基因歐美楊107楊(轉(zhuǎn)基因107楊)幼苗在不同濃度鹽脅迫下生長(zhǎng)性狀，質(zhì)膜透性、光合作用等各項(xiàng)指標(biāo)，以及外源基因表達(dá)產(chǎn)物積累量的變化，綜合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)復(fù)合多基因楊樹(shù)在鹽脅迫下的適應(yīng)能力。【方法】 以轉(zhuǎn)化成功且已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因107楊為試驗(yàn)材料，未轉(zhuǎn)基因107楊為對(duì)照(CK)，進(jìn)行組培擴(kuò)繁，在幼苗株高10 cm時(shí)定植在花盆中，置于人工氣候室中培養(yǎng)。分別用0、3、6 g·L-1的NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，脅迫25天后觀測(cè)2個(gè)株系幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)、生理參數(shù)變化，以及甜菜堿與Bt毒蛋白的積累量?！窘Y(jié)果】 2個(gè)株系的生長(zhǎng)指標(biāo)觀測(cè)結(jié)果表明： 在低鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因107楊幼苗株高增長(zhǎng)量顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，轉(zhuǎn)基因株系幼苗地徑增長(zhǎng)量與對(duì)照差異不顯著； 高鹽濃度處理下，2個(gè)株系幼苗株高與地徑均受到鹽脅迫的顯著影響。2個(gè)株系的生理參數(shù)觀測(cè)結(jié)果表明： 在低鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因107楊幼苗質(zhì)膜透性顯著低于對(duì)照107楊，葉綠素含量有一定程度的增加，凈光合速率與蒸騰速率顯著高于對(duì)照，光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光合效率Y(Ⅱ)小幅度降低但顯著高于對(duì)照，光系統(tǒng)Ⅱ能夠保持較高的電子傳遞速率；Fv/Fm增幅較高，具有較大光合作用潛力。在高鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因株系幼苗葉綠素含量降幅較小，而質(zhì)膜透性、凈光合速率均顯著降低，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)均呈現(xiàn)較大幅度下降，光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞速率受到較大影響，光合能力下降，變化趨勢(shì)與對(duì)照相同，2個(gè)株系幼苗均受到較大程度的鹽害。轉(zhuǎn)基因株系中外源基因表達(dá)產(chǎn)物積累量的ELISA研究結(jié)果表明，隨鹽濃度的增加，Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜堿含量都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)； 在高鹽濃度脅迫下外源基因產(chǎn)物積累量均顯著增加?！窘Y(jié)論】 轉(zhuǎn)基因107楊在低濃度鹽脅迫下表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，耐鹽性優(yōu)于對(duì)照107楊。在高濃度鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照107楊均受到較大影響，轉(zhuǎn)基因株系并未顯示其優(yōu)勢(shì)。鹽脅迫可以誘導(dǎo)外源Bt基因、BADH基因表達(dá)加強(qiáng)，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因107楊表現(xiàn)出良好的耐鹽和抗蟲(chóng)潛力。

轉(zhuǎn)復(fù)合多基因； 歐美楊107楊； 耐鹽性；BADH基因；Bt基因

楊樹(shù)(Populus)是世界中緯度地區(qū)廣泛栽培的主要樹(shù)種之一。楊樹(shù)在我國(guó)北方地區(qū)生態(tài)建設(shè)和林業(yè)生產(chǎn)中占有不可替代的地位，我國(guó)楊樹(shù)種植面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)世界所有其他國(guó)家楊樹(shù)人工林面積之和(盧孟柱等， 2006)。然而隨著楊樹(shù)栽培面積的不斷擴(kuò)大，蟲(chóng)害現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，給生態(tài)環(huán)境和林業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)前所未有的毀滅性災(zāi)難； 另一方面，隨著土壤鹽漬化問(wèn)題的日益加劇，可利用土地資源逐年減少，嚴(yán)重影響農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展。

目前，基因工程技術(shù)在楊樹(shù)抗蟲(chóng)、耐鹽和耐旱等抗性遺傳改良方面取得了很多研究成果，在不同程度上提高了楊樹(shù)的抗蟲(chóng)、耐鹽以及耐旱能力(Klockoetal.， 2014； Duetal.， 2012； Hanetal.， 2013)。綜合來(lái)看，依靠單基因轉(zhuǎn)化對(duì)楊樹(shù)進(jìn)行遺傳改良獲得的效果有限，多基因?qū)牖蚓酆嫌N可以作為培育楊樹(shù)新品種的一條可選途徑。前人在基因的修飾和改造、多基因表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因植物的篩選和培育等方面進(jìn)行了大量研究。王建革等(2006)通過(guò)基因槍法將雙價(jià)抗蛀干害蟲(chóng)基因(BtCry3A+OC-I)、透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)、枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、報(bào)告基因nptⅡ以及調(diào)節(jié)基因JERF36等外源基因?qū)氲綆?kù)安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’)基因組，共獲得25株抗性植株，經(jīng)過(guò)southern雜交和PCR檢測(cè)，外源基因成功整合到庫(kù)安托楊基因組中，其中7株含有上述全部5個(gè)外源基因。ELISA試驗(yàn)表明，BtCry3A基因在7株庫(kù)安托楊中已得到表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因植株在濱海鹽堿地中生長(zhǎng)良好。朱永興等(2015)以‘寧楊1號(hào)’(P.tomentosacv.Niyang-1)為轉(zhuǎn)化受體材料，建立楊樹(shù)多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，并對(duì)三價(jià)質(zhì)粒MT(SOS1-SOS2-SOS3)進(jìn)行了共轉(zhuǎn)化并建立了最佳的‘寧楊1號(hào)’多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得14株P(guān)CR陽(yáng)性株系。

本研究利用轉(zhuǎn)復(fù)合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)歐美楊107楊(Populus×euramericanacv. ‘74/76’)為試驗(yàn)材料，以未轉(zhuǎn)基因歐美楊107楊為對(duì)照，在人工氣候室控制環(huán)境下，通過(guò)澆施不同濃度的NaCl水溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，觀測(cè)2個(gè)楊樹(shù)株系幼苗的株高、節(jié)間距等生長(zhǎng)指標(biāo)，電導(dǎo)率、光合相關(guān)參數(shù)等生理變化，以及轉(zhuǎn)基因株系外源Bt基因、BADH基因表達(dá)產(chǎn)物積累量的變化。通過(guò)綜合分析比較，探究轉(zhuǎn)多基因107楊在鹽脅迫下的生長(zhǎng)和生理響應(yīng)，為多元復(fù)合基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因新品種培育提供借鑒和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為歐美楊107楊與轉(zhuǎn)復(fù)合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)歐美楊107楊(轉(zhuǎn)基因107楊)高抗株系1號(hào)，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。轉(zhuǎn)基因107楊是將3個(gè)目的基因構(gòu)建在同一轉(zhuǎn)化載體上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將外源基因整合到歐美楊107楊基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因組培苗，經(jīng)分子檢測(cè)、Bt毒蛋白檢測(cè)及初步抗性試驗(yàn)，證明外源基因已整合到107楊基因組中，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，初步證明轉(zhuǎn)基因株系具有抗蟲(chóng)性和耐鹽能力(王奧璇， 2015)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)2個(gè)107楊株系進(jìn)行組培擴(kuò)繁，組培苗生根后，移入內(nèi)徑5 cm、高8 cm的盆中，每個(gè)株系栽植50株。栽培用土壤為園土∶基質(zhì)土=1∶3。盆栽苗置于人工氣候室中培養(yǎng)，條件為日溫26～28 ℃，夜溫18 ℃； 光周期： 14 h·d-1(光強(qiáng)10 000 Lx)。培養(yǎng)40天后，幼苗株高約10 cm時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的幼苗，定植在內(nèi)徑18 cm、高20 cm的盆中，每盆2株，分別為對(duì)照107楊與轉(zhuǎn)基因107楊，共27盆。

定植2天后，分別用NaCl濃度為0、3、6 g·L-1的鹽溶液進(jìn)行脅迫處理。每個(gè)處理設(shè)置9盆幼苗，3次重復(fù)。每隔4天澆1次鹽溶液，每次150 mL。鹽脅迫25天后，每株選取頂端第1片完全展開(kāi)的成熟葉片，進(jìn)行光合色素含量、光合作用指標(biāo)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 在鹽處理前和第25天時(shí)，分別用不銹鋼刻度尺、千分尺測(cè)量鹽脅迫前后的株高、地徑。每個(gè)處理9次重復(fù)。

1.3.2 質(zhì)膜透性的測(cè)定 在鹽處理第25天時(shí)，分別取2個(gè)楊樹(shù)株系幼苗相同部位葉片，用去離子水沖洗2遍，用濾紙吸干葉面浮水后用打孔器打孔取樣，在電子天平稱量后放入50 mL三角瓶中，按200 mL·g-1加入去離子水，抽真空20 min，靜置2 h，用DDS-11A型電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)值，然后將樣品在97 ℃中水浴30 min，靜置2 h，測(cè)定電導(dǎo)值，以相對(duì)電導(dǎo)率表示細(xì)胞原生質(zhì)膜透性的大小。每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.3.3 光合色素的測(cè)定 葉綠素 a、葉綠素 b含量的測(cè)定按照李合生(2000)方法，用上海精工722 s分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，含量以 mg·g-1FW 表示。每個(gè)處理6次重復(fù)。

1.3.4 光合作用指標(biāo)的測(cè)定 上午9： 00—10： 00在人工氣候室條件下采用Li-6400XT便攜式光合儀(美國(guó)拉格公司生產(chǎn))進(jìn)行光合速率有關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，其中包括： 凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)以及氣孔限制值(Ls)。每個(gè)處理6次重復(fù)。

1.3.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 測(cè)定前用暗處理夾片對(duì)楊樹(shù)幼苗的葉片進(jìn)行20 min的暗處理。然后采用Porket PEA高速連續(xù)擊發(fā)式熒光儀(英國(guó)Bioscientific有限公司生產(chǎn))測(cè)定幼苗光化學(xué)活性、光能吸收和轉(zhuǎn)化效率。葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定和光合作用指標(biāo)的測(cè)定同時(shí)進(jìn)行。每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.3.6 轉(zhuǎn)基因株系葉片外源Bt毒蛋白含量的測(cè)定 采用美國(guó)Agdia公司Bt-Cry1Ab/1Ac及Bt-Cry3A ELISA試劑盒進(jìn)行Bt毒蛋白含量的測(cè)定。稱取0.1 g左右(記錄實(shí)際質(zhì)量)新鮮葉片，在液氮中研磨至粉末狀，加入1 mL 1× PBST提取緩沖液，研磨呈勻漿狀，10 000 r·min-1離心10 min取上清液用于Bt毒蛋白含量的檢測(cè)。具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每個(gè)處理6次重復(fù)。

1.3.7 葉片甜菜堿含量的測(cè)定 采用北京冬歌生物科技有限公司植物甜菜堿(Betaine)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒進(jìn)行甜菜堿的測(cè)定。稱取0.1 g左右(記錄實(shí)際質(zhì)量)新鮮葉片，液氮中研磨至粉末，加入0.9 mL PBS(濃度為0.01 mol·L-1，pH為7.4)提取緩沖液，勻漿充分，2 000～3 000 r·min-1離心20 min取上清液用于甜菜堿含量的檢測(cè)，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS v 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下生長(zhǎng)指標(biāo)變化

稀土元素具有重要的指示性作用，可以判斷地層和礦體成因及物質(zhì)來(lái)源[10，12]。據(jù)徐紅偉(2009)等研究，礦區(qū)蝕變巖稀土配分曲線與花崗巖接近一致，反映出二者在成因上存在密切關(guān)系。

由表1可知，轉(zhuǎn)基因107楊在3 g·L-1低濃度鹽處理下株高增長(zhǎng)量小幅升高，但未達(dá)到顯著水平，且顯著高于相同濃度鹽處理下的對(duì)照107楊。在6 g·L-1高濃度鹽處理下，轉(zhuǎn)基因107楊株高增長(zhǎng)量顯著降低，且與相同濃度鹽處理下的對(duì)照無(wú)顯著差異。對(duì)照107楊株系在不同NaCl濃度處理下，株高增長(zhǎng)量均受到明顯抑制。在不同濃度鹽處理下，2個(gè)株系幼苗地徑均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在3 g·L-1低鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因107楊地徑增長(zhǎng)量比對(duì)照107楊高，但2個(gè)株系間差異不顯著。在6 g·L-1高鹽濃度處理下，2個(gè)株系地徑增長(zhǎng)量均顯著降低且株系之間無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)在低濃度鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因107楊具有良好的適應(yīng)能力，而在高濃度鹽脅迫下，2個(gè)株系幼苗均受到較大的鹽害影響。

表1 鹽脅迫下2個(gè)株系幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)變化①

①小寫(xiě)字母表示同一株系不同濃度NaCl處理?xiàng)l件下差異，大寫(xiě)字母表示相同濃度NaCl處理?xiàng)l件下不同株系間差異，顯著性水平為0.05，下同。Lower case letters represent significant differences of same poplar lines at different treatment;capital letters represent significant difference of different poplar lines at same treatment. significant difference test level is at 0.05,the same below.

2.2 鹽脅迫處理對(duì)葉片質(zhì)膜的傷害

大量研究報(bào)道，在鹽分脅迫下植物細(xì)胞質(zhì)膜首先受到傷害，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)離子大量外滲，外界鹽離子大量進(jìn)入，破壞細(xì)胞內(nèi)離子平衡，致使細(xì)胞代謝失調(diào)，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。而植物則可以通過(guò)吸收并積累從外界環(huán)境進(jìn)入的K+、Cl-等無(wú)機(jī)離子，或自身合成小分子有機(jī)類調(diào)節(jié)劑，如氨基酸類、糖類、多元醇和生物堿等調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，抵御鹽脅迫對(duì)質(zhì)膜的傷害，從而提高脅迫環(huán)境下的適應(yīng)能力。圖1結(jié)果顯示，在3 g·L-1鹽濃度處理下，107楊相對(duì)電導(dǎo)率顯著增加41.23%，轉(zhuǎn)基因株系呈現(xiàn)小幅度降低，降低5.11%，顯著低于相同濃度處理107楊。在6 g·L-1鹽濃度處理下，2個(gè)株系相對(duì)電導(dǎo)率均顯著增大，且轉(zhuǎn)基因株系增幅高于107楊。在低鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率略微降低表明細(xì)胞可能通過(guò)外源BADH基因的表達(dá)，促使細(xì)胞內(nèi)甜菜堿含量增加，避免了鹽脅迫對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的傷害。而107楊電導(dǎo)率顯著增加，其質(zhì)膜受到傷害。高鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因株系質(zhì)膜透性變化較大，2個(gè)株系質(zhì)膜透性均受到顯著傷害。

圖1 鹽脅迫下質(zhì)膜透性的變化Fig.1 Changes of plasma membrane permeability under salt stress圖中誤差棒為平均值的標(biāo)準(zhǔn)差； 小寫(xiě)字母表示同一株系不同濃度NaCl處理?xiàng)l件下差異，大寫(xiě)字母表示相同濃度NaCl處理?xiàng)l件下不同株系間差異，顯著性水平為0.05，下同。Error in the figure for the standard deviation. Lower case letters represent significant differences of same poplar lines at different treatment;capital letters represent significant difference of different poplar lines at same treatment, significant difference test level is at 0.05, the same below.

2.3 鹽脅迫處理對(duì)光合色素的影響

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素。鹽脅迫會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生一定的破壞性，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，造成葉綠素含量降低從而影響植物的光合能力。研究植物鹽脅迫下的響應(yīng)機(jī)制，葉片光合色素的含量可作為植物耐鹽生理研究的重要指標(biāo)。鹽脅迫下2個(gè)株系葉片葉綠素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。在3 g·L-1鹽濃度處理下，2個(gè)株系葉綠素a、b和葉綠素總量均表現(xiàn)為不同程度增加，相同鹽濃度處理下轉(zhuǎn)基因株系增幅更大。在6 g·L-1鹽濃度處理下，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈現(xiàn)較大幅度降低，轉(zhuǎn)基因株系降幅較對(duì)照小。表明在鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系耐受性較強(qiáng)。高濃度鹽處理對(duì)2個(gè)楊樹(shù)株系幼苗均產(chǎn)生了較大傷害。

2.4 鹽脅迫處理對(duì)光合參數(shù)的影響

不同濃度鹽處理下2個(gè)株系光合參數(shù)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著NaCl濃度增加，107楊葉片凈光合速率Pn呈降低趨勢(shì)(圖2A)，3 g·L-1濃度鹽處理下光合速率下降22.6%，但未達(dá)到顯著水平，6 g·L-1濃度鹽處理下該數(shù)值顯著降低； 轉(zhuǎn)基因株系葉片凈光合速率呈先升高后降低，在3 g·L-1鹽濃度處理下凈光合速率升高18%，顯著高于相同鹽濃度處理107楊。在6 g·L-1鹽濃度處理下降低顯著，與相同鹽濃度處理107楊無(wú)顯著差異。說(shuō)明低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因植株可以通過(guò)提高光合速率來(lái)適應(yīng)鹽脅迫條件。

表2 鹽脅迫下葉片光合色素含量的變化

圖2 鹽脅迫下2個(gè)株系光合有關(guān)參數(shù)的變化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters under salt stress

不同濃度鹽處理下2個(gè)株系氣孔限制值(Ls)與胞間CO2濃度(Ci)變化見(jiàn)圖2B、2C。低鹽濃度下，107楊葉片Ci降低，但未達(dá)到顯著水平，而氣孔限制值Ls大幅度增加，凈光合速率下降，表現(xiàn)為氣孔限制。轉(zhuǎn)基因株系氣孔限制值小幅度降低，胞間CO2濃度降低，但未達(dá)到顯著水平，凈光合速率增加，表明低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因株系可以通過(guò)降低氣孔限制以適當(dāng)提高光合速率，表現(xiàn)出較好的適應(yīng)性。在高鹽濃度下，2個(gè)株系幼苗氣孔限制值顯著增加，Pn下降且Ci升高，這可能是由于高濃度鹽脅迫導(dǎo)致大量鹽離子在細(xì)胞中累積，破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，造成葉綠素含量降低、葉片光合器官損傷，從而導(dǎo)致葉肉細(xì)胞光合活性下降，說(shuō)明此時(shí)非氣孔限制已成為促使光合速率降低的主要因子。

鹽脅迫處理下2個(gè)株系幼苗蒸騰速率Tr(圖2D)變化趨勢(shì)與Pn相同。隨鹽濃度增加，對(duì)照107楊Tr逐漸降低，轉(zhuǎn)基因株系呈先升高后降低。在低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因株系Tr顯著高于107楊，高鹽濃度處理下差異不顯著。植物在鹽脅迫下葉片氣孔限制值增大，導(dǎo)致水分蒸發(fā)和CO2傳輸受阻，從而抑制葉片的蒸騰作用和光合作用，而轉(zhuǎn)基因株系在低鹽濃度下氣孔限制值小幅度降低，氣孔導(dǎo)度增加，Ci升高，其Pn與Tr表現(xiàn)出一定程度的增大且顯著高于107楊。說(shuō)明在低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因株系可以通過(guò)降低氣孔限制以增強(qiáng)光合速率和蒸騰速率，提高轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫處理對(duì)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的影響

最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm反映PSⅡ初始最大光能利用效率。Fv/Fm下降越多，代表PSⅡ受到的損傷程度越大。由圖3A可知，2個(gè)株系幼苗Fv/Fm均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在3 g·L-1鹽濃度脅迫下，轉(zhuǎn)基因107楊Fv/Fm增幅較大，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)具有較大光合作用潛力。6 g·L-1鹽濃度處理下2個(gè)株系Fv/Fm均下降明顯，說(shuō)明該鹽濃度下2個(gè)株系均受到較大影響。

初始熒光Fo(圖3B)和最大熒光Fm(圖3C)分別表示PSII反應(yīng)中心處于完全開(kāi)放和關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量。2個(gè)株系均表現(xiàn)出在低鹽濃度下Fo小幅度降低、高鹽濃度下升高的趨勢(shì)，對(duì)照107楊升幅較大。對(duì)照107楊最大熒光Fm隨鹽濃度增加逐漸降低，轉(zhuǎn)基因株系在低鹽濃度下無(wú)變化，在高鹽濃度下急劇下降。

Y(Ⅱ)反映光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光合效率。PSⅡ反應(yīng)中心在部分關(guān)閉狀態(tài)下，實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率可作為光合電子傳遞速率快慢的評(píng)測(cè)指標(biāo)。從圖3D可知，無(wú)鹽脅迫和低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因株系均保持較高的電子傳遞速率。低鹽濃度下107楊和轉(zhuǎn)基因株系Y(Ⅱ)分別降低7.41%、4.62%，轉(zhuǎn)基因株系顯著高于107楊，高鹽濃度下兩者均降低且無(wú)顯著差異。證明在低鹽濃度下轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)光系統(tǒng)II能夠保持較高的電子傳遞速率，且受鹽害影響較小。高鹽濃度下2個(gè)株系電子傳遞速率均降到較低水平，受傷害程度較大。

圖3 鹽脅迫下2個(gè)株系葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化Fig.3 Changes of chlorophyll fluorescence parameters under salt stress

2.6 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系外源Bt毒蛋白含量的變化

外源Bt基因的導(dǎo)入可以使目標(biāo)植物表達(dá)抗性蛋白從而獲得對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)的抗性，但環(huán)境因素會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)生影響。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系外源Bt毒蛋白含量如表3所示。隨著NaCl濃度增大，Bt毒蛋白含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。 在3 g·L-1鹽濃度處理下，Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分別增加40.15%、50.49%；在6 g·L-1處理濃度下，Cry1Ac、Cry3A毒蛋白含量分別增加158.84%、144.04%。結(jié)果表明，鹽脅迫對(duì)外源Bt基因的表達(dá)起到促進(jìn)作用，隨鹽濃度增加，毒蛋白含量增幅變大。

表3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系Bt毒蛋白含量

2.7 鹽脅迫下葉片甜菜堿含量的積累

甜菜堿是一種天然無(wú)毒的小分子有機(jī)化合物。在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在植物葉片中大量積累以降低滲透勢(shì)，維持細(xì)胞水分平衡，保護(hù)一些關(guān)鍵酶類，維持生物大分子的結(jié)構(gòu)和完整性，維持植物正常的生理功能。不同濃度鹽處理下轉(zhuǎn)基因107楊幼苗葉片甜菜堿含量如圖4所示，隨鹽濃度增加，葉片甜菜堿含量逐漸增大，轉(zhuǎn)基因株系葉片甜菜堿含量顯著高于107楊。在無(wú)鹽處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系葉片甜菜堿含量為107楊的2.97倍，6 g·L-1鹽濃度處理下上升到6.22倍，表明BADH基因的導(dǎo)入導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系葉片甜菜堿含量大幅增加。隨鹽濃度增加，2個(gè)株系葉片的甜菜堿含量在3 g·L-1鹽濃度處理下增幅較大。在6 g·L-1鹽濃度處理下含量最高，2個(gè)株系甜菜堿含量分別為無(wú)鹽處理?xiàng)l件下的1.3倍與2.8倍。結(jié)果證明，低鹽濃度脅迫下，甜菜堿的積累量迅速上升，隨著鹽濃度增加，甜菜堿積累量增幅減緩，鹽脅迫在一定程度上可以誘導(dǎo)外源BADH基因表達(dá)加強(qiáng)。

圖4 鹽脅迫下2個(gè)株系葉片中甜菜堿的含量The content of betaine in leaves of two lines under salt stress

3 討論

本研究中，轉(zhuǎn)復(fù)合多基因(BtCry1Ac+BtCry3A+BADH)107楊中的耐鹽基因?yàn)锽ADH基因。BADH基因是合成甜菜堿醛脫氫酶的基因，而甜菜堿醛脫氫酶則是合成甜菜堿的關(guān)鍵酶。大量研究表明，甜菜堿的積累可以提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。李敏等(2013)研究指出耐鹽柳樹(shù)(Salix)L0911BADH基因的表達(dá)受鹽脅迫條件的誘導(dǎo)，說(shuō)明鹽脅迫與BADH基因存在著緊密關(guān)聯(lián)。王亮(2006)在利用BADH基因轉(zhuǎn)化107楊的研究中，BADH基因的導(dǎo)入使得相同鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電導(dǎo)率降低，轉(zhuǎn)基因植株受到傷害較小。此外，在鹽脅迫條件下部分轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量顯著高于對(duì)照株系，表明轉(zhuǎn)基因株系能夠更好地抵御鹽害影響。本研究中，在低鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電導(dǎo)率小幅度降低且顯著低于對(duì)照，而葉綠素含量均高于對(duì)照，表明導(dǎo)入BADH基因的株系受鹽害影響程度較小，這與前人研究結(jié)果相同。張士功等(1999)研究表明鹽脅迫下一定濃度的甜菜堿可以增加葉綠素含量，提高葉綠體對(duì)光能的吸收利用，從而降低鹽脅迫對(duì)光合作用的影響。另外，甜菜堿的積累還可以保護(hù)多種抗氧化酶的活性，降低活性氧的積累，維持膜的有序性和完整性，保護(hù)類囊體膜上蛋白復(fù)合體的功能，減輕脅迫對(duì)類囊體膜的破壞，維持較高水平的PSII活性及CO2同化速率，提高光合活性(梁超等， 2007)，最終提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。本研究中，轉(zhuǎn)復(fù)合多基因107楊株系在無(wú)鹽脅迫條件下，甜菜堿積累量較低，此時(shí)BADH表達(dá)量較低，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照生長(zhǎng)及生理指標(biāo)無(wú)顯著差異，而鹽脅迫處理可以誘導(dǎo)外源BADH基因加強(qiáng)表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因株系葉片中甜菜堿獲得大量積累。在3 g·L-1低鹽濃度下甜菜堿含量迅速積累，并通過(guò)滲透調(diào)節(jié)維持細(xì)胞膜良好的穩(wěn)定性，可以增加葉綠素含量，且能夠維持較高的PSII活性，增大氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率，提高轉(zhuǎn)基因株系鹽脅迫下的凈光合速率，因此鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系保持了相對(duì)較高的生長(zhǎng)量。BADH基因的導(dǎo)入提高了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫適應(yīng)能力。

許多研究表明： 在高鹽、干旱、低溫等脅迫誘導(dǎo)下，BADH基因表達(dá)量的增加在不同植物之間存在顯著差異(Nakamuraetal., 2001； 劉佳琪等， 2012)。在非脅迫條件下，基因工程使得轉(zhuǎn)基因植株在體內(nèi)積累甜菜堿的含量為0.05～5 μmol·g-1FW(段曉光等， 2004)，耐鹽性強(qiáng)的胡楊(Populuseuphratica)受到鹽脅迫后甜菜堿含量顯著提高，特別是葉中甜菜堿含量達(dá)到1.90 μmol·g-1，提高約243倍(陳少良等， 2001)。本研究中轉(zhuǎn)基因株系在6 g·L-1鹽濃度脅迫下甜菜堿積累量最大，但僅相當(dāng)于0.02 μmol·g-1，約為對(duì)照處理2.8倍，表明該基因的表達(dá)效果不強(qiáng)。在鹽脅迫下對(duì)各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)與生理參數(shù)綜合性分析表明，轉(zhuǎn)基因株系3 g·L-1較低濃度鹽脅迫下，表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，耐鹽能力強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨欢? g·L-1較高鹽濃度脅迫下，雖然甜菜堿與Bt毒蛋白積累量繼續(xù)增加，但轉(zhuǎn)基因株系與107楊的各項(xiàng)生理指標(biāo)對(duì)比并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯差異，受鹽害程度較大。從而進(jìn)一步證明，BADH基因表達(dá)能力較弱，在6 g·L-1較高鹽濃度脅迫下，同時(shí)超出轉(zhuǎn)基因株系幼苗對(duì)鹽害的耐受能力。當(dāng)然，本研究?jī)H為人工氣候室條件下盆栽幼苗試驗(yàn)結(jié)果，轉(zhuǎn)基因株系在田間條件下的耐鹽性表現(xiàn)還需作進(jìn)一步研究。

Ren等(2015)將多基因表達(dá)載體BtCry1Ac+BtCry3A+BADH轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)，每個(gè)外源基因均為CaMV35S啟動(dòng)子，結(jié)果顯示BADH基因表達(dá)水平較低。本研究中轉(zhuǎn)基因株系所用植物表達(dá)載體與之相同，而外源BADH基因表達(dá)效果同樣較差，分析其原因可能是多基因排列順序或者多基因間由于啟動(dòng)子相同而相互作用，導(dǎo)致多個(gè)外源基因不能同時(shí)高效表達(dá)。多基因表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化仍面臨一系列技術(shù)難題(袁飛榮等， 2011； Untergasseretal.， 2012)。在今后研究中，應(yīng)考慮從以下幾方面進(jìn)行改善，以期達(dá)到多個(gè)外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中同時(shí)高效地表達(dá)： 首先，在構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體時(shí)，根據(jù)不同外源基因使用不同特異性啟動(dòng)子，降低序列的重復(fù)性； 其次，構(gòu)建載體時(shí)在外源基因兩側(cè)添加增強(qiáng)序列或者核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR，促使外源基因穩(wěn)定高效地表達(dá)； 第三，可以通過(guò)優(yōu)化起始密碼周邊序列，對(duì)基因編碼區(qū)進(jìn)行修飾改造等方式增強(qiáng)翻譯效率，例如對(duì)基因進(jìn)行修飾，使其更接近植物中GC含量，以提高其表達(dá)量。

有研究提出，鹽脅迫條件可以抑制或誘導(dǎo)多種cDNA克隆子、mRNA和特異蛋白質(zhì)的合成，通過(guò)代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)或阻遏作用，影響相關(guān)基因表達(dá)，以適應(yīng)脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)的特殊代謝反應(yīng)(孫靜等， 2006； 趙鳳云等， 2007)。韓會(huì)景等(2007)將發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質(zhì)粒T-DNA轉(zhuǎn)入雙抗蟲(chóng)基因‘741楊’[Populusalba×(P.davidiana+P.simonii)×P.tomentosa]株系Pb29后，生長(zhǎng)素(IAA)和赤霉素(GA)含量升高，Bt毒蛋白表達(dá)受抑制，提出可能是發(fā)根基因促使激素含量提高，導(dǎo)致代謝發(fā)生變化，促進(jìn)植物發(fā)根，但抑制了某些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而使Bt毒蛋白的表達(dá)也受到抑制。經(jīng)過(guò)鹽脅迫處理后，激素含量呈降低趨勢(shì)，Bt毒蛋白的表達(dá)上升。這可能是由于鹽脅迫使轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)表達(dá)受到抑制，而誘導(dǎo)產(chǎn)生一些特異抗鹽蛋白，從而緩解對(duì)Bt毒蛋白的表達(dá)抑制。本研究中Bt毒蛋白的含量隨鹽處理濃度增加呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其原因可能是正常條件下外源基因表達(dá)受到植物的某種抑制，但隨著鹽處理濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)代謝發(fā)生變化，某類代謝產(chǎn)物的積累或者減少緩解了Bt基因的表達(dá)抑制。

4 結(jié)論

在人工氣候室控制條件下，通過(guò)盆栽澆施不同濃度NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，25天時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)多基因107楊及未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?07楊生長(zhǎng)性狀、生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因107楊幼苗生長(zhǎng)受鹽害影響較??； 在3 g·L-1低鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因株系質(zhì)膜透性顯著低于107楊，葉綠素含量升高幅度較大，蒸騰速率與凈光合速率增加且顯著高于107楊； Y(Ⅱ)小幅度降低但顯著高于對(duì)照，光系統(tǒng)II能夠保持較高的電子傳遞速率；Fv/Fm上升幅度較大，表明轉(zhuǎn)基因株系具有較大光合作用潛力。在6 g·L-1高鹽濃度處理下，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量降低，而質(zhì)膜透性、凈光合速率均顯著降低，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)均呈現(xiàn)較大幅度下降，光系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞受到較大影響，光合能力下降，變化趨勢(shì)與對(duì)照無(wú)顯著差異，2個(gè)株系幼苗均受到較大程度的傷害。轉(zhuǎn)多基因107楊在3 g·L-1低鹽濃度處理下表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，耐鹽性優(yōu)于107楊； 在6 g·L-1高鹽濃度處理下轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照107楊均受到較大影響，轉(zhuǎn)基因株系并未顯示其優(yōu)勢(shì)。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系中外源基因表達(dá)產(chǎn)物積累量的研究結(jié)果表明，隨鹽濃度的增加，Cry1Ac毒蛋白、Cry3A毒蛋白及甜菜堿的含量逐漸增加，在高鹽濃度脅迫下積累量顯著增加，鹽脅迫在一定程度上可以誘導(dǎo)外源Bt基因、BADH基因表達(dá)加強(qiáng)。

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(責(zé)任編輯 王艷娜 郭廣榮)

Growth and Physiological Responses of TransgenicPopulus×euramericanacv. ‘74/76’ with Multiple Genes Under Salt Stress

Chen Panfei1Zuo Lihui1Wang Guiying2Wang Jinmao1Ren Yachao1Yang Minsheng1

(1.CollegeofForestry,AgriculturalUniversityofHebeiBaoding071000; 2.LangfangAcademyofAgriculturalandForestrySciencesLangfang065000)

【Objective】 This paper aimed to comprehensively evaluate the adaptability of transgenicPopulus×euramericanacv. ‘74/76’ with multiple genes (Abbreviation：Transgenic poplar 107) under salt stress through measurements of growth traits, membrane permeability and photosynthesis and other physiological parameters of the transgenic polar 107 under different salt stresses, as well as of the change in the accumulation amount of exogenous gene expression products. 【Method】 The transgenic polar 107 was used as test material, which had been verified successful transformation. The transgenic materials were propagated by tissue culture, and then the obtained seedlings were transplanted in pots when their heights were up to 10 cm. The seedlings were cultured in growth chamber and treated with NaCl solutions which concentrations were 0, 3, and 6 g·L-1, with the nontransgenic poplar 107 served as the control (CK). The growth indexes and physiological parameters, as well as accumulation of betaine and Bt toxin proteins of two lines were measured in 25 days after treatment. 【Result】 The results showed that under low salt concentration treatment, the height of transgenic poplar 107 was significantly higher than that of poplar 107, and the diameter of the transgenic lines was greater than that of poplar 107. Under high salt concentration, the height and the ground diameter of the seedlings of the two lines all were significantly affected by salt stress. Under low salt concentration, membrane permeability of transgenic poplar 107 was significantly lower than that of polar 107, chlorophyll content increased more greatly, and both net photosynthetic rate and transpiration rate increased and were significantly higher than that of polar 107. The actual photosynthetic efficiencyY(Ⅱ) of photosystem Ⅱ decreased slightly, but significantly higher than that of the control, indicating that photosystem Ⅱ was able to maintain higher electron transfer rate.Fv/Fmhad a relatively greater increase, suggesting increased photosynthetic capacity. Under high salt concentration, the chlorophyll content of transgenic lines decreased slightly. However, both the plasmalemma permeability and net photosynthetic rate decreased significantly,Fv/FmandY(Ⅱ) had a sharp decline, electron transfer rate of photosystem Ⅱ was affected greatly and photosynthetic capacity decreased. The all change trends were the same as that of control, and the seedlings of two lines suffered to a great degree salt damage. The accumulation amount of exogenous genes expression in transgenic lines, detected by ELISA, showed that with the salt concentration increasing, the contents of Cry1Ac toxin protein, Cry3A toxin protein and betaine all had an increasing trend. The accumulation of exogenous genes products significantly increased under the stress of high salt concentration. 【Conclusion】 Transgenic polar 107 displayed strong adaptability under low concentration salt stress, and its salt tolerance was stronger than the polar 107. Both transgenic polar 107 with multiple genes and control polar 107 were to a great degree impacted under high concentration salt stress, and transgenic line did not show any advantage. Salt stress induced an expression enhancement of the exogenousBtgene andBADHgene, suggesting that the transgenic poplar 107 would show a good salt tolerance and insect resistance potential under salt stress.

transgenic with multiple genes；Populus×euramericanacv. ‘74/76’； salt tolerance；BADHgene；Btgene

10.11707/j.1001-7488.20170705

2016-04-22；

2017-02-21。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370663)； 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102703)。

S718.43

A

1001-7488(2017)07-0045-09

*楊敏生為通訊作者。