艾炷灸抗哮喘小鼠氣道炎癥機(jī)制研究

謝玲玲，李品純，潘鳳霞，朱北勝，李 梅

(崇左市人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科， 廣西 崇左 532200)

【針灸研究】

艾炷灸抗哮喘小鼠氣道炎癥機(jī)制研究

謝玲玲，李品純，潘鳳霞，朱北勝，李 梅

(崇左市人民醫(yī)院中醫(yī)康復(fù)科， 廣西 崇左 532200)

目的：通過(guò)觀察艾炷灸對(duì)哮喘模型小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)水平的影響，探討其抗哮喘氣道炎癥的作用機(jī)制。方法：昆明種小鼠32只按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、哮喘模型組、艾炷灸治療組、硫酸特布他林(Terbutaline Sulfate,TS)陽(yáng)性組，空白組用生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，其余各組采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化激發(fā)哮喘，哮喘模型制作成功后，分別利用生理鹽水霧化、TS霧化液、艾炷灸進(jìn)行治療，2周后測(cè)小鼠血清的MDA、SOD、NO值，觀察對(duì)比各組肺組織形態(tài)。結(jié)果： 與空白組比較，哮喘模型組小鼠血清MDA、NO水平顯著增高；與哮喘模型組比較，TS陽(yáng)性組、艾炷灸治療組的MDA水平顯著降低；與空白組比較，哮喘模型組小鼠血清SOD水平顯著降低；與哮喘模型組比較，TS陽(yáng)性組、艾炷灸治療組的SOD水平顯著增加。結(jié)論: 艾炷灸能明顯抑制哮喘小鼠氣道炎癥，其機(jī)制可能與其降低機(jī)體NO、MDA水平，增強(qiáng)SOD的活力有關(guān)。

哮喘；艾炷灸；氣道炎癥；抗氧化

中醫(yī)認(rèn)為，哮喘是由于寒邪傷肺、肺腎兩虛等導(dǎo)致痰氣交阻、阻塞氣道、肺氣升降不利進(jìn)而出現(xiàn)呼吸困難、氣息喘促[1]。艾灸是利用灸火溫?zé)嵝越o予人體溫?zé)岽碳ぃ瑵B透入經(jīng)絡(luò)腧穴，是治療和防治疾病的一種方法，其溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)、扶陽(yáng)固脫是中醫(yī)學(xué)治療哮喘的常用治療方法。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，艾灸不僅對(duì)改善肺通氣功能有顯著效果，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對(duì)于變態(tài)反應(yīng)性疾病和氣道反應(yīng)性疾病有很重要的作用，并能有效控制哮喘發(fā)作[2]。

本實(shí)驗(yàn)利用小鼠復(fù)制哮喘模型，使用艾炷灸對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行治療，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，并對(duì)比小鼠血清MDA、SOD、NO水平，從而分析艾炷灸抗哮喘模型小鼠氣道炎癥機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選取廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的昆明種小鼠32只,體質(zhì)量16～23 g,雌雄各半。正常飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、哮喘模型組、TS陽(yáng)性組、艾炷灸治療組各8只，雌雄各半。

1.2 主要試劑與儀器

超聲霧化器980型、AS620型冰凍切片機(jī)、MaticB5型雙目生物顯微鏡、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、卵清白蛋白OVA、一氧化氮(NO)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、TS霧化液、精制艾絨。艾炷制備： “熱敏灸條”中艾絨制作成直徑為3 mm、高4 mm、重約13～15 mg的圓錐體艾炷；TS霧化液制備：TS液2.5 mg加入1 ml生理鹽水。

1.3 小鼠哮喘模型復(fù)制

第1、8、15天分別給哮喘模型組、TS陽(yáng)性組、艾炷灸治療組每只小鼠腹腔注射抗原液0.5 mL以致敏，空白組用生理鹽水代替，每日1次。從第16天開始，將哮喘模型組、TS陽(yáng)性組、艾炷灸治療組小鼠分別置于25 cm×15 cm×15 cm密閉玻璃容器內(nèi)，給予1%OVA引喘液恒壓超聲霧化吸入激發(fā)?？瞻捉M以等量生理鹽水進(jìn)行霧化激發(fā)，每日1次，每次霧化吸入20 min共14d。

1.4 治療方法

從第16天起每次霧化前30 min做治療。艾炷灸治療：用固定夾將小鼠固定后參照李辭蓉等著的《小鼠針灸穴位圖譜的研制》標(biāo)準(zhǔn)及擬人比照法進(jìn)行穴位定位。艾炷施灸方法: 先將施灸部位的體毛剪去,再涂以少量蘆薈汁放上艾炷, 采用無(wú)瘢痕直接灸,每穴3壯，每日1次，每壯以小鼠全身掙扎為度。艾炷灸治療組分別于第17、19、21、23、25、27、29天奇數(shù)天艾炷灸中脘、膻中。偶數(shù)天從第16天至第30天艾炷炷灸雙肺腧。TS陽(yáng)性組治療：TS溶液霧化治療，每日1次，每次霧化20 min共14 d?？瞻讓?duì)照組：哮喘模型組第16天開始介入，以生理鹽水代替霧化治療，每日1次，每次霧化20 min共14 d。

1.5 血清SOD、MDA、NO檢測(cè)

第30天(末次霧化激發(fā)24 h后)將各組小鼠眼球取血2 mL,然后以3 000 r/min的速度離心10 min取血清，放置低溫冰箱中備用。SOD、MDA、NO檢測(cè)方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 病理切片

處死小鼠，用磷酸鹽緩沖液經(jīng)支氣管灌注后取下右肺葉，以10%福爾馬林固定24 h后作病理切片，行HE染色作病理觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)觀察

空白組：吸入生理鹽水霧化液后小鼠開始有輕度搔鼻抓面等舉動(dòng)，個(gè)別小鼠有噴嚏現(xiàn)象，但無(wú)咳嗽、氣促等癥狀，3～5 min后逐漸適應(yīng)，上述表現(xiàn)全部消失，活動(dòng)雖減少但呼吸平穩(wěn)，神態(tài)安定，無(wú)任何呼吸道癥狀。激發(fā)過(guò)后小鼠迅速恢復(fù)活動(dòng)且活動(dòng)敏捷，食量正常，體質(zhì)量增加，毛色光澤。哮喘模型組: 小鼠在吸入1%OVA30 s～1 min后即出現(xiàn)明顯煩躁不安，不停搔抓鼻面及全身，噴嚏、咳嗽繼而活動(dòng)減少，拱背蜷臥，呼吸急促、深快，腹部收縮凹陷，鼻部、唇周皮膚發(fā)紺、舌質(zhì)紫黯等。部分小鼠出現(xiàn)呼吸不規(guī)則，反復(fù)激發(fā)后上述癥狀逐漸加重。激發(fā)過(guò)后精神較差，食量減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)速度減慢，毛發(fā)欠光澤。其余各給藥組小鼠在激發(fā)時(shí)也出現(xiàn)搔抓鼻面、噴嚏、咳嗽及呼吸增快、腹部收縮等癥狀，但持續(xù)時(shí)間短，頻率和程度均較輕；TS陽(yáng)性組: 出現(xiàn)食量減少，逐漸消瘦，體質(zhì)量下降，少量脫毛且毛發(fā)欠光潤(rùn)，激發(fā)時(shí)煩躁多動(dòng)，口唇、鼻周見輕度紫紺等癥狀；艾炷灸治療組：小鼠吸入OVA后其表現(xiàn)未見紫紺及煩躁不安等癥狀，激發(fā)過(guò)后精神、活動(dòng)、食量、體質(zhì)量及毛發(fā)無(wú)明顯異常。

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組(見圖1)：小鼠肺組織中肺泡壁薄，肺泡的大小均一，肺泡腔內(nèi)無(wú)任何分泌物滲出，肺泡的間隔無(wú)增寬，肺無(wú)萎陷及血管壁增厚，支氣管黏膜皺壁無(wú)任何破壞，支氣管壁及其周圍無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和分泌物；哮喘模型組：肺泡壁結(jié)構(gòu)被破壞，顯著的炎癥變化，肺泡腔內(nèi)滲出物明顯增多，支氣管收縮，管壁黏膜下水腫，支氣管黏膜上皮局部脫落，基底膜增厚，玻璃樣變性，杯狀細(xì)胞增生，支氣管周圍血管擴(kuò)張、充血，管壁各層明顯的嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)；TS陽(yáng)性組：TS陽(yáng)性組輕度炎癥變化，相較于哮喘模型組其炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，黏液減少，肺泡結(jié)構(gòu)及支氣管黏膜完整，部分仍有輕微破壞。但總體來(lái)說(shuō)，TS陽(yáng)性組病變范圍、程度均較模型組減輕；艾炷灸治療組：支氣管結(jié)構(gòu)基本正常，個(gè)別黏膜細(xì)胞變性及壞死，支氣管腔內(nèi)未見明顯炎性滲出物，管腔周圍有少量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡壁輕度增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血明顯減輕，肺泡壁少量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出物。組織學(xué)改變與TS陽(yáng)性組類似，與哮喘模型組比較炎癥程度明顯減輕。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片(×500)

2.3 各組小鼠血清MDA、SOD、NO水平比較

表1顯示，哮喘模型組與空白組比較，血清MDA、NO水平顯著增高(P<0.05)，血清SOD活性顯著降低(P<0.01)；TS陽(yáng)性組和艾炷灸治療組與哮喘模型組比較，血清MDA、NO水平顯著降低(P<0.01)，血清SOD活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)；TS陽(yáng)性組血清MDA、SOD、NO水平與艾炷灸治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；艾炷灸治療組與空白組血清MDA、SOD、NO水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠血清MDA、SOD、NO水平比較

注：與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01;與哮喘模型組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組哮喘血清SOD水平顯著降低,MDA水平顯著增高，說(shuō)明哮喘小鼠體內(nèi)氧自由基增多，清除氧自由基的SOD減少，生成的脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA增加。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究證實(shí)，在哮喘發(fā)作過(guò)程中給予抗氧化劑可以明顯改善哮喘臨床癥狀，縮短病程[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織SOD活性顯著下降而MDA水平顯著增加，說(shuō)明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了大量氧自由基，與近年來(lái)有關(guān)氧自由基在哮喘中作用的報(bào)道相一致[4]。經(jīng)過(guò)艾炷灸干預(yù)后，艾灸組小鼠血清SOD活性升高，MDA水平降低，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，基本恢復(fù)正?；钚浴Ｕf(shuō)明艾炷灸可以提高哮喘小鼠體內(nèi)SOD活性，增強(qiáng)抗氧化能力，對(duì)體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基有清除作用。

NO對(duì)淋巴細(xì)胞增生有抑制作用，并發(fā)揮其抗炎作用[5]。但如果氣道組織中的iNOS不斷被激活，其合成并釋放出大量的NO刺激呼吸道毛細(xì)血管后靜脈漿細(xì)胞，致使?jié){細(xì)胞的滲出物增多，上皮細(xì)胞大量脫落，功能結(jié)構(gòu)變性，導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡，從而使炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重，氣道反應(yīng)性明顯增高，哮喘癥狀則加速惡化[6]。Ward等[7]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，NO供體可抑制乙酞膽堿、組胺、白三烯D4所致的氣道收縮，NOS抑制劑L- NAME可減弱由于冷空氣、運(yùn)動(dòng)所引起的氣道收縮，但不影響乙酰膽堿釋放，提示NO對(duì)乙酞膽堿收縮氣道平滑肌起著對(duì)抗作用。正常情況下，cNOS來(lái)源的NO可以松弛各個(gè)氣管的氣道平滑肌，對(duì)氣道平滑肌張力的正常生理調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。當(dāng)哮喘時(shí)，源于cNOS生成而來(lái)的NO不足，氣道上的非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)功能發(fā)揮失常，導(dǎo)致iNOS活性增強(qiáng)，局部氣管組織周圍產(chǎn)生大量的NO，一旦氣道組織受損立即誘發(fā)氣道高反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組血清NO水平濃度顯著高于空白組，說(shuō)明哮喘模型組小鼠血清及氣道平滑肌周圍產(chǎn)生大量NO，并誘發(fā)氣道高反應(yīng)，符合哮喘發(fā)病的重要特征。經(jīng)TS及艾炷灸治療后哮喘小鼠血清NO大幅下降，與哮喘模型組比較差異顯著。上述研究表明，艾炷灸與TS一樣具有抑制炎癥、緩解控制哮喘發(fā)作的功效，提示艾炷灸抗氣道炎癥的作用機(jī)制與氣道高反應(yīng)密切相關(guān)。由此可知，艾炷灸可以抗氧化，清除哮喘模型體內(nèi)自由基，使之免受哮喘發(fā)病過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化物的損傷。

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Study on the Curing Mechanism of the Airway Inflammation with Moxa Cone Moxibustion in Murine of Asthma

XIE Ling- ling, LI Ping- chun, PAN Feng- xia, ZHU Bei- sheng, LI Mei

(The Department of rehabilitation medicine, People’s Hospital of Chongzuo,Guangxi,Chongzuo 533200,China)

Objective: To observe the effective of moxa cone moxibustion on serum superoxide dismutase activity, nitric oxide and malondialdehyde in rats with asthma in order to explore its possible effective mechanism during the process of cure the asthma.Methods: Thirty- two rats were randomly divided into control group, asthma model group, moxibustion treatment group, terbutaline sulfate positive group and blank group with saline intraperitoneal injection and aerosol inhalation, the other groups were given intraperitoneal injection of ovalbumin sensitization and inhalation asthma, after the success of modeling respectively. Using saline atomization, atomization, TS moxibustion treatment, measured two weeks after the mice serum MDA, SOD, NO, lung morphology observation;Results: Compared with the control group, asthma model group serum MDA, NO levels increased significantly; Compared with the asthma model group, TS positive group, moxibustion treatment group MDA was significantly lower. Compared with the control group, asthma model group serum SOD levels were significantly reduced;Compared with the asthma model group, TS positive group, Moxibustion treatment group the level of SOD was significantly increased; Conclusions: Moxa cone moxibustion can increase the activity of SOD in serum of mice, decrease NO, MDA level, therefore, possible mechanism of moxa cone moxibustion on asthma and decrease the NO, MDA levels, increased SOD activity.

Asthma; Moxa cone moxibustion; Airway inflammation; Antioxidant

謝玲玲(1987-)，女，廣西崇左人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸防治哮喘的臨床與研究。

R245.81

B

1006- 3250(2017)07- 0992- 03

2017- 01- 11