細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5在肝癌細(xì)胞株中的異常表達(dá)及其臨床意義

鄭高云，張 巖，李進(jìn)軍

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5在肝癌細(xì)胞株中的異常表達(dá)及其臨床意義

鄭高云，張 巖，李進(jìn)軍

目的：分析細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5（MEK5）在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法：使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白印跡法等方法，分別檢測(cè)肝癌細(xì)胞株（HepG2、Huh7）和正常肝細(xì)胞株（LO2）中的MEK5表達(dá)水平；shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞致MEK5基因沉默后，檢測(cè)其對(duì)MEK5蛋白表達(dá)和細(xì)胞增值率的影響。通過t檢驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果：與MEK5在正常肝細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)（0.8765±0.0031）相比，MEK5在肝癌細(xì)胞株中過度表達(dá)（HepG2：1.7206±0.0031；HuH7：1.1676±0.0053，P＜0.01）；與MEK5在非特異性shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)（HepG2：1.5508±0.0029；HuH7：1.2167± 0.0033）相比，MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)（HepG2：0.5339±0.0031；HuH7：0.4639±0.0013）受到顯著抑制（P＜0.01）。結(jié)論：MEK5在肝癌細(xì)胞中過度表達(dá)；抑制MEK5的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)也受到抑制。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5;肝癌細(xì)胞株;蛋白表達(dá);基因沉默

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）是惡性程度較高的腫瘤之一，在所有癌癥發(fā)病率中排名第5位，在全球癌癥死亡率中排名第3位[1]。HCC在美國(guó)和其他發(fā)達(dá)國(guó)家相對(duì)少見[2]，大多數(shù)發(fā)生在乙型肝炎或丙型肝炎感染比較常見的發(fā)展中國(guó)家，尤其是在中國(guó)。隨著中國(guó)人口增長(zhǎng)及老齡化社會(huì)的逐漸顯現(xiàn)，2015年新診斷的HCC病例仍然處于上升的勢(shì)頭[3]。目前，手術(shù)切除和肝移植仍是早期HCC最佳治療方法。但由于HCC細(xì)胞的高侵襲性、肝外轉(zhuǎn)移和化療抵抗，晚期HCC的預(yù)后較差[4]。為此，尋找新的腫瘤標(biāo)記物和發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點(diǎn)是HCC研究重點(diǎn)所在。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)系統(tǒng)，可將細(xì)胞外的刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞核內(nèi)。MAPK家族種類較多，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶激酶5（MEK5）是其家族成員之一，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，普遍地表達(dá)于真核生物的多種細(xì)胞和組織中[5]。越來越多的文獻(xiàn)顯示，MAPK通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞凋亡從而在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用[6-7]。MEK5位于人染色體15q23，編碼444個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是MAPK中MEK5-ERK5信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶[8-9]。MEK5是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）唯一的上游激酶。MEK5對(duì)ERK5有高度特異性，它不會(huì)引起MAPK家族的其他成員激活[10]。被MEK5激活的ERK5從胞質(zhì)移位到細(xì)胞核內(nèi)，才可以將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到核內(nèi)。ERK5在胞質(zhì)內(nèi)被MEKK-MEK5磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能[11]。許多文獻(xiàn)表明，多種人類癌癥中存在MEK5-ERK5的過度表達(dá)或激活，如前列腺癌[12]，乳腺癌[13]，惡性間皮瘤[14]、白血病[15]和結(jié)腸癌[16-17]。同時(shí)，MEK5的過度表達(dá)已被證明與細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移相關(guān)[18]，是癌癥患者預(yù)后的觀察指標(biāo)。

有研究證明，MEK5-ERK5通路與HCC多重耐藥有關(guān)[19]。然而，MEK5于HCC發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。因此，在本研究中，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白印跡（Western blot）等方法分析了MEK5在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 兩種HCC細(xì)胞株（HepG2和Huh7）和正常肝細(xì)胞株（LO2）均是從美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC，Mannasas，VA，USA）獲得。所有細(xì)胞培養(yǎng)基均為DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，Waltham,MA,USA）并添加10%胎牛血清(FBS,賽默飛世爾科技公司,Waltham,MA,USA)，培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃。

1.2 shRNA轉(zhuǎn)染使MEK5表達(dá)沉默 MEK5特異性shRNA和非特異性shRNA是根據(jù)文獻(xiàn)中的研究方案而設(shè)計(jì)并合成[18]。shRNA序列如下：MEK5sh1，5'-CCGTTCATCGTGCAGTTCAAT-3'；MEK5sh2，5'-GAGAACCAGGTGCTGGTAATT-3'。將shRNA克隆到慢病毒載體pLVX–IRES-Puro（賽業(yè)生物科學(xué)公司，蘇州）中。然后將HCC細(xì)胞株HepG2和Huh7細(xì)胞接種于密度為5×105cells/well的六孔板，過夜培養(yǎng)直到達(dá)到70%～80%匯合度以獲得最大的轉(zhuǎn)染效率，采用脂質(zhì)體2000（Invitrogen公司）將克隆有shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞6 d并以嘌呤霉素篩選（1μg/mL，Sigma Aldrich公司，Louis,MO,USA）。細(xì)胞分為三組：實(shí)驗(yàn)組：用MEK5特異性shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；陰性對(duì)照組：用非特異性shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞；空白對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖分析 轉(zhuǎn)染48 h后，采用經(jīng)典的MTT法測(cè)定實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組的細(xì)胞增殖率。將細(xì)胞株接種到密度為5000 cells/well的96孔板中并添加20 μL濃度為5 mg/mL的3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT，Sigma-Aldrich公司)于37℃培養(yǎng)4h。用150 μL二甲基亞砜添加到每個(gè)孔中以溶解沉淀，并用酶標(biāo)儀（多功能酶標(biāo)儀分光熒光計(jì)，BioTek Synergy HT，Winooski,VT，USA）測(cè)定在490 nm處的吸光度值，從而分別在12 h、24 h、48 h和72 h時(shí)得到此三組細(xì)胞增值率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式統(tǒng)計(jì)。

1.4RNA分離和cDNA合成 RNA均是從HCC細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中提取，采用Promega SV Total RNA 分離純化試劑盒(Madison,Wisconsin, USA），并且根據(jù)制造商的說明而提取。即：樣品和RNA裂解緩沖液混合，再加入RNA稀釋緩沖液。離心之后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管，添加95%乙醇。將溶液轉(zhuǎn)移到RNA提取自旋柱，所有RNA均用RNA洗滌溶液洗脫，并存儲(chǔ)在-80℃。使用Nano-Drop 3000超微量分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技公司）對(duì)RNA進(jìn)行量化分析，根據(jù)廠家的說明利用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega公司）反轉(zhuǎn)錄出cDNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 用以檢測(cè)HCC細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中MEK5 mRNA的表達(dá)量。RT-qPCR使用ABI 7300型熱循環(huán)熒光定量PCR儀（ABI，賽默飛世爾科技公司）和SYBR Green qPCR supermix UDG with ROX kit試劑盒（Invitrogen公司）進(jìn)行分析。RT-qPCR的優(yōu)化條件為：95℃進(jìn)行10 min，然后40轉(zhuǎn)95℃進(jìn)行15 s，60℃進(jìn)行1 min。PCR引物：MEK5，正向，5'-CTTTAATGCCTCTCCAGCTTCT-3'；反向，5'-CCATCATTGAACTGCACGAT-3'；GAPDH，正向，5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'；反向，5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3'。使用閾值循環(huán)（△△CT）方法[20]計(jì)算MEK5的相對(duì)表達(dá)水平，標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)源性GAPDH的表達(dá)。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行，并計(jì)算平均值。

1.6 Western bolt分析 本研究對(duì)HCC細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株進(jìn)行了Western blot分析。使用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（上海生工生物科技有限公司，中國(guó)）從細(xì)胞株中提取總蛋白。通過Pierce BCA蛋白測(cè)定試劑盒（賽默飛世爾科技公司）測(cè)定蛋白濃度。使用Bio-Rad Mini-Protein III系統(tǒng)（100 V，2 h，Hercules，CA，USA）在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離等量的蛋白質(zhì)。于200 mA，在轉(zhuǎn)移緩沖液中的PVDF膜上(GE保健生命科學(xué)，馬爾堡，美國(guó))轉(zhuǎn)膜50 min。在室溫下用5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）封閉膜1 h。將膜與針對(duì)MEK5的單克隆抗體（1∶1000，610957，BD轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室，San Diego，CA，USA）和β-肌動(dòng)蛋白（1∶1000，SC47778，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，Dallas，TX，USA）共同溫育。應(yīng)用1∶500稀釋度的辣根過氧化物酶標(biāo)記過的第二抗體（SC516087，圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）溫育，并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ECL，GE保健生命科學(xué)）檢測(cè)。所有上述程序根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。MEK5的蛋白質(zhì)表達(dá)水平相對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS v.17.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用t檢驗(yàn)來分析各組之間的MEK5表達(dá)情況及細(xì)胞增值率的影響。P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 HCC細(xì)胞株中MEK5基因異常表達(dá) 通過RT-qPCR和Western blot法測(cè)量HCC細(xì)胞株HepG2和HuH7和正常肝細(xì)胞株LO2中的MEK5表達(dá)狀態(tài)。如圖1、圖2和表1所示，與正常肝細(xì)胞株相比時(shí)，MEK5在HCC細(xì)胞株中過度表達(dá)。

2.2 shRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞株后使MEK5基因沉默可抑制細(xì)胞增殖 根據(jù)MEK5表達(dá)水平分析結(jié)果，選擇具有相對(duì)高水平MEK5表達(dá)的HCC細(xì)胞株HepG2和HuH7，以評(píng)估抑制MEK5后對(duì)細(xì)胞增殖的影響。將MEK5特異性shRNA和非特異shRNA轉(zhuǎn)染到HepG2和HuH7細(xì)胞株中。進(jìn)行RT-qPCR分析以檢查shRNA的轉(zhuǎn)染效率。根據(jù)圖3、圖4和表2所示結(jié)果，說明 MEK5特異性 shRNA轉(zhuǎn)染后，HepG2和HuH7細(xì)胞株中MEK5表達(dá)下調(diào)。

圖1 RT-qPCR分析MEK5在HCC細(xì)胞株HepG2和HuH7中的表達(dá)

圖2 蛋白免疫印跡分析MEK5在HCC細(xì)胞株HepG2和HuH7中的表達(dá)

表1 MEK5在HCC細(xì)胞株HepG2、HuH7及正常肝細(xì)胞株LO2中的mRNA和蛋白表達(dá)

圖3 蛋白免疫印跡分析MEK5在用非特異性shRNA和MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株中的表達(dá)

圖4 蛋白免疫印跡分析MEK5在用非特異性shRNA和MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HuH7細(xì)胞株中的表達(dá)

表2 MEK5在MEK5特異性shRNA和非特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HepG2、HuH7細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)(平均吸光度A值)

為了研究MEK5表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用MTT法測(cè)定shRNA轉(zhuǎn)染與非shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株的增殖率。結(jié)果表明，與非特異性shRNA轉(zhuǎn)染的那些細(xì)胞株相比，MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HepG2和HuH7細(xì)胞株的增殖率，在MEK5表達(dá)沉默后受到顯著抑制（P＜0.05，圖5和圖6）。這些結(jié)果證明：MEK5表達(dá)受抑制后，HCC細(xì)胞株的細(xì)胞增殖率明顯下降。

圖5 MTT分析用非特異性shRNA和MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株中的細(xì)胞增殖率

圖6 MTT分析用非特異性shRNA和MEK5特異性shRNA轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株中的細(xì)胞增殖率

3 討論

HCC是一種常見的惡性腫瘤，每年在全世界造成多達(dá)1百萬例死亡[2]。雖然HCC患者的生存率由于手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步而有所改善，但患者的長(zhǎng)期存活率仍然很差[2]。這一方面是由于肝癌患者的肝硬化背景；另一方面是由于對(duì)肝癌潛在的分子治療靶點(diǎn)尚未轉(zhuǎn)化為有效的治療方法，只有索拉非尼是目前被批準(zhǔn)用于治療晚期肝癌的藥物。所以我們迫切需要找到新的分子靶點(diǎn)。

既往研究表明，MEK5-ERK5途徑在人發(fā)育期間調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程[21]。MEK5-ERK5信號(hào)通路在許多人類癌癥中上調(diào)，如前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、惡性間皮瘤[14]、白血病[15]和結(jié)腸直腸癌[16-17]。在乳腺癌細(xì)胞中，研究人員發(fā)現(xiàn)激活的癌基因STAT3可以結(jié)合MEK5的啟動(dòng)子區(qū)域，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄[18]。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，MEK5的過表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)[22]。然而，沒有找到關(guān)于MEK5在HCC中的表達(dá)的研究報(bào)道。因此，為了探討MEK5在HCC發(fā)生和進(jìn)展中的作用，本研究檢測(cè)了MEK5在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)狀態(tài)，并分析了其臨床意義。

結(jié)果表明，在HCC細(xì)胞株中MEK5表達(dá)水平異常升高；而MEK5表達(dá)受抑制后，HCC細(xì)胞株的細(xì)胞增殖率明顯下降。這從正反兩反面得出以下結(jié)論：MEK5與HCC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。MEK5-ERK5通路的抑制減少了HCC細(xì)胞的增殖,可能的機(jī)理是：通過降低蛋白激酶B（AKT）的磷酸化，促使抑癌基因p27和p15的表達(dá)增加，原癌基因CCND1的表達(dá)降低，從而抑制MEK5-ERK5通路，使處于G0/G1期的細(xì)胞比例增加，最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖[23]。這可能是HCC治療新的分子靶點(diǎn)。

另外，我們也可以推斷：監(jiān)測(cè)HCC患者M(jìn)EK5的表達(dá)水平，可以幫助判斷疾病預(yù)后。這也是我們下一步的研究方向。

總之，本研究證實(shí)了MEK5在HCC細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)；MEK5在HCC細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào)可以抑制細(xì)胞增殖。

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（收稿：2017-03-26 修回：2017-07-20）

（責(zé)任編輯 張淑坤 屈振亮）

Expression of Mitogen/extracellular Signal-Regulated Kinase Kinase-5 in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines and its Clinical Significance

ZHENG Gao-yun,ZHANG Yan,LI Jin-jun
The Second people's Hospital of Tianjin,Tianjin（300110）,China

Objective To analyze the expression of Mitogen/extracellular signal-regulated kinase kinase-5 (MEK5)in hepatocellular carcinoma(HCC)cell lines and investigate its clinical significance. Methods The expression of MEK5 in two HCC cell lines(HepG2 and HuH7)and one normal liver cell line(LO2)was ana?lyzed.The protein expression of MEK5 in HepG2 and HuH7 cell lines with MEK5-specific shRNA transfection，non-targeting shRNA transfection and the blank control cells were analyzed. Results The MEK5 expression was up-regulated in HCC cell lines(HepG2:1.7206±0.0031;HuH7:1.1676±0.0053)compared to normal liver cell lines(0.8765±0.0031,P＜0.01).The protein expression of MEK5 in HepG2 and HuH7 cell lines were in?creased with MEK5-specific shRNA transfection(HepG2:0.5339±0.0031;HuH7:0.4639±0.0013),compared to those with non-targeting shRNA transfection(HepG2:1.5508±0.0029;HuH7:1.2167±0.0033,P＜ 0.01). Conclusion The MEK5 expression level in HCC cell lines was significantly higher compared to that in the nor?mal liver cell lines.The down-regulation of MEK5 could inhibit the cell proliferation of HCC.

MEK5;hepatocellular carcinoma cell line;protein expression;gene silencing

Q555+.7；R735.7

：A

：1007-6948(2017)04-0389-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.04.014

天津市第二人民醫(yī)院外科（天津 300110）

鄭高云，E-mail:office-zheng@163.com