侯文仲，許遠(yuǎn)鵬，毛振敏，陳子陽(yáng)，曾敏敏，李在雨

［廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）神經(jīng)外科，廣東 清遠(yuǎn)511518］

MicroRNA?29b調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制研究

侯文仲，許遠(yuǎn)鵬，毛振敏，陳子陽(yáng)，曾敏敏，李在雨

［廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）神經(jīng)外科，廣東 清遠(yuǎn)511518］

目的：探討microRNA?29b調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生的機(jī)制.方法：利用realtime?PCR檢測(cè)不同來(lái)源的膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR?29b的表達(dá)，MTT檢測(cè)miR?29b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR?29b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖周期的影響；Western blot檢測(cè) miR?29b對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1和cyclin E表達(dá)的影響.結(jié)果：MiR?29b在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR?29b能夠抑制U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，miR?29b使得膠質(zhì)瘤G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，并且抑制cyclin D1和cyclin E的表達(dá).結(jié)論：MiR?29b能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，是新的膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)抑制因子.

microRNA?29b；膠質(zhì)瘤；增殖；細(xì)胞周期；治療靶點(diǎn)

0 引言

惡性膠質(zhì)瘤（malignant glioma）是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點(diǎn)［1］.手術(shù)、放化療均不易根治，易復(fù)發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國(guó)科學(xué)家為了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段作出了巨大努力，卻始終沒(méi)有取得突破性進(jìn)展，惡性膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學(xué)上未被攻克的一大難題［2－4］.

MicroRNA（miRNA）是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負(fù)性基因調(diào)節(jié)器，能調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程［5］.近年來(lái)很多報(bào)道指出miRNAs調(diào)控膠質(zhì)瘤的多種生物過(guò)程，包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡、干細(xì)胞維持以及應(yīng)激抵抗性等［6］.miRNAs表達(dá)水平的改變能夠調(diào)控很多基因的表達(dá)，既包括原癌基因，也包括腫瘤抑制基因，所以miRNAs既可以作為腫瘤抑制因子，也可以作為原癌基因.研究發(fā)現(xiàn)，miR?29家族是腫瘤中重要的調(diào)控因子，miR?29b在多種腫瘤中低表達(dá)，對(duì)胃癌等腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移起負(fù)調(diào)控的作用，說(shuō)明miR?29與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).目前miR?29b的研究已涉及多種腫瘤，但其與膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究旨在揭示miR?29b對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控及其作用機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑MTT試劑盒為日本Dojindo公司產(chǎn)品.碘化丙啶（propidium iodide，PI）和兔抗人cyclin D1／cyclin E多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Milipore公司.兔抗人β?actin抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司.十二烷基硫酸鈉、30%聚丙烯酰胺、甘氨酸、四甲基乙二胺和過(guò)硫酸銨等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.聚偏二氟乙烯polyvinylidene difluoride，PVDF）膜購(gòu)自上海麗臣生物科技有限公司.TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化）.熒光定量試劑盒（北京閱微基因）.miR?29b的引物（天根生化），U6的引物（天根生化）.miR?29b的莖環(huán)引物：5'?GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG?GTATTCGCACTGGATACGACAA?3'；上 游 引 物：5'?GCGC GCTAGCACCATTTG?3'；下游 引 物：5'?CAGTGCAGGGTCCGAGGT?3'.U6的反轉(zhuǎn)錄引物：5'?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3'； 上 游 引 物： 5'?CTCGCTTCGGCAGCACA?3'；下游引物：5'?CTCGCT?TCGGCAGCACA?3'.

1.2 膠質(zhì)瘤組織來(lái)源與細(xì)胞培養(yǎng)膠質(zhì)瘤組織來(lái)源于廣州醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院2010～2015年膠質(zhì)瘤手術(shù)切除膠質(zhì)瘤標(biāo)本.納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)；手術(shù)患者術(shù)前未行化療或放療.所有標(biāo)本獲取均經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn).人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG和U87MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞系真實(shí)性均經(jīng)過(guò)短串聯(lián)重復(fù)序列驗(yàn)證.所有細(xì)胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美國(guó)），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國(guó)）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中國(guó)）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國(guó)），培養(yǎng)環(huán)境為含5%二氧化碳的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱.

1.3 RNA提取用1 mL TRIzol的裂解50～100 mg臨床組織標(biāo)本；冰上用勻漿器反復(fù)研磨50次左右，待組織標(biāo)本研磨至無(wú)明顯結(jié)塊后轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記好的1.5 mL離心管中；向組織勻漿中加入合適體積的氯仿（TRIzol∶氯仿＝5∶1），混勻后室溫靜置5 min，12000 r／min離心20 min；離心后水相和有機(jī)相發(fā)生明顯分層，小心將上層水相吸出，轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，加入與水相等體積的異丙醇，劇烈震蕩混勻，靜置 10 min；然后，4℃、12000 r／min低溫離心15 min.離心管底可見(jiàn)少量 RNA沉淀；小心移取上清，加1 mL左右的750 mL／L的乙醇，12000 r／min離心15 min；倒掉上清，將離心管倒置酒精完全揮發(fā)，用20 μL DEPC水溶解RNA，震蕩混勻溶解產(chǎn)物；將溶解的RNA進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專ò?∶10），并用分光光度計(jì)進(jìn)行定量.

1.4 轉(zhuǎn)染將細(xì)胞接種于含有 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)傳代培養(yǎng).細(xì)胞采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將脂質(zhì)體和mimic混合后無(wú)血清條件下孵育細(xì)胞，8 h后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng).

1.5 qRT?PCR通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT?PCR）檢測(cè)miR?29b在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達(dá)水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol從凍存的組織樣品和細(xì)胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）.然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA.熒光定量PCR使用iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio?Rad公司）檢測(cè)信號(hào).

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)將1×104個(gè)細(xì)胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中種到96孔板中.處理后，培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.棄掉上清，細(xì)胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測(cè)量490 nm處的OD值（SpectraMax公司，美國(guó)）.

1.7 細(xì)胞周期分析收集各組細(xì)胞約2×106個(gè)，PBS洗滌2次，棄上清液，緩慢向細(xì)胞沉淀中滴加1 mL預(yù)冷的70%冰乙醇，4℃固定過(guò)夜，離心，去上清液，PBS洗滌2次，0.5 mL重懸細(xì)胞，加入RNAase 200 μL，37℃ 水浴30 min，離心去上清，加入5 mg／mL的碘化丙啶1 mL，4℃ 避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè).

1.8 Western blotWestern blot實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)BM Chemiluminescence Western Blotting Kit操作說(shuō)明進(jìn)行.制好的蛋白樣品，先沸水浴煮5 min，煮完后冰上快速冷卻后離心5 min（12 000 r／min），然后上樣.將膠上的蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，400 mA、100 min于冰浴中轉(zhuǎn)移.用10 g／L酪蛋白封閉液封閉1 h，一抗孵育過(guò)夜；第2天，用TBST洗滌PVDF膜2次，用封閉液稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的抗兔IgG／HRP標(biāo)記的抗山羊IgG）孵育PVDF膜1 h（搖床100 r／min，室溫）；將PVDF膜用TBST洗滌，用X光片曝光.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件通過(guò)單邊非配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)獨(dú)立樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果的定量分析均采用標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM）進(jìn)行分析，并在圖中標(biāo)注，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MiR?29b在膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá)研究miR?29b在膠質(zhì)瘤中的功能，首先要檢測(cè)miR?29b在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，本研究收集了40例膠質(zhì)瘤標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的正常組織或癌旁組織.qRT?PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR?29b在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯低于在正常組織和癌旁組織中的表達(dá)（圖1）.

圖1 MiR?29b在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2 MiR?29b抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖MiR?29b在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中低表達(dá)，由此推測(cè)miR?29b可能在膠質(zhì)瘤中起抑癌基因的功能.因此我們?cè)?U87和U251檢測(cè)了miR?29b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響（圖2、3）.MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR?29b對(duì)U87和U251的增殖起明顯的抑制作用.

圖2 MiR?29b對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

圖3 MiR?29b對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

2.3 MiR?29b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)（圖4、5），在 U87和 U251細(xì)胞中，miR?29b組細(xì)胞在G1期所占百分率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)miR?29b組細(xì)胞在S和G2期所占百分率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.說(shuō)明miR?29b具有阻滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的功能.

圖4 MiR?29b對(duì)U87細(xì)胞周期的影響

圖5 MiR?29b對(duì)U251細(xì)胞周期的影響

2.4 MiR?29b對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響進(jìn)一步檢測(cè)G1／S關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1和cyclin E的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在U87和U251兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR?29b過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)cyclin D1和cyclin E的表達(dá)（圖6）.

圖6 MiR?29b對(duì)cyclin D1和cyclin E表達(dá)的影響

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，手術(shù)、放化療均不易根治，易復(fù)發(fā)，治愈率較低，患者存活期短.目前，各國(guó)科學(xué)家為了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，尋找診治手段作出了巨大努力，卻始終沒(méi)有取得突破性進(jìn)展，惡性膠質(zhì)瘤仍是醫(yī)學(xué)上未被攻克的一大難題.因此，尋找新的膠質(zhì)瘤治療靶標(biāo)變得越來(lái)越迫切.

microRNA是一類含量豐富的非蛋白編碼（non?protein?coding）小RNA，可作為負(fù)性基因調(diào)節(jié)器，能調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程.多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯(cuò)誤表達(dá)有關(guān).microRNA可以通過(guò)靶向目標(biāo)基因的3'UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)［7］.多種人體癌癥被證明與miRNA的突變或錯(cuò)誤表達(dá)有關(guān).如卵巢癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌和 GBM 等［8?14］.microRNA的下調(diào)已經(jīng)成為一個(gè)新的惡性腫瘤的特征，所以一些特定的microRNA具有成為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［15］.

MiR?29家族由兩個(gè) cluster編碼：miR?29a／miR?29b?1 cluster和miR?29c／miR?29b?2 cluster，分別定位于1q32.3及1q32.2.其家族的三個(gè)成員：miR?29a、miR?29b、miR?29c，序列高度相似，推測(cè)其功能也類似.研究證實(shí)，miR?29在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中都不同程度地表達(dá)下調(diào)，并且參與了結(jié)腸癌由腺瘤向結(jié)腸癌發(fā)展的早期過(guò)程［16］，提示其可能作為抑癌因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17－20］.本研究發(fā)現(xiàn)miR?29b在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，并抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖.MiR?29b調(diào)控膠質(zhì)瘤的細(xì)胞周期，使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞停留在G1的細(xì)胞顯著增多，并下調(diào)細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1和 cyclin E的表達(dá).這些研究證明miR?29b可以通過(guò)細(xì)胞周期阻滯抑制膠質(zhì)瘤的增殖和生長(zhǎng)，使miR?29b成為未來(lái)治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點(diǎn).

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Study on the expression and function of microRNA?29b in human glioma

HOU Wen?Zhong，XU Yuan?Peng，MAO Zhen?Min，CHEN Zi?Yang，ZENG Min?Min，LI Zai?Yu
Department of Neurosurgery， the Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University（Qingyuan People's Hospital），Qingyuan 511518，China

AIM：To study the function and regulation mecha?nism of miRNA?29b in hunman glioma.METHODS：Realtime PCR was used to detect miR?29b expression in glioma tissues，and MTT was used to detect the influence of miR?29b on glioma cell proliferation.Flow cytometry was used to detect the influence of miR?29b on cell cycle；Western blot was used to detect the influence of miR?29b on the expression of cyclin D1 and cyclin E.RESULTS：MiR?29b was low expression in glioma tissues，and overexpression of miR?29b could inhibit the proliferation of U87 and U251 glioma cells.miR?29b can increase the number of G1 phase cells and reduce the number of S phase cells，and inhibit the expression of cyclin D1 and cyclin E.CONCLUSION：MiR?29b can regulate glioma cell cycle，inhibit the proliferation of gli?oma cells，and miR?29b may be a tumor suppressor gene in human glioma.

microRNA?29b；glioma；proliferation；cell cycle；therapy target

R739.41

A

2095?6894（2017）07?44?04

2017－05－15；接受日期：2017－05－30

清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016B025）

侯文仲.博士.E?mail：harzard＠sina.com