劉 楠，張 磊，6，王 震，成迎端，2，張鵬幸，王 欣，溫偉紅，楊宏偉，劉 輝，金衛(wèi)林，張永生，涂艷陽，

（1第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西 西安710038；2北布倫瑞克醫(yī)院研究部，新澤西 美國 08902；3哈佛醫(yī)學(xué)院布萊根婦女醫(yī)院神經(jīng)外科，波士頓美國02115；4第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，陜西西安710032；5上海交通大學(xué)電子信息與電子工程學(xué)院，薄膜與微細(xì)技術(shù)教育部重點實驗室，儀器科學(xué)與工程中心，納米生物醫(yī)學(xué)與工程研究室，上海 200240；6西安兒童醫(yī)院矯形外科，陜西西安710003）

·論著·

MicroRNA?101通過靶向SOX9抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲

劉 楠1，張 磊1，6，王 震1，成迎端1，2，張鵬幸1，王 欣3，溫偉紅4，楊宏偉3，劉 輝1，金衛(wèi)林5，張永生1，涂艷陽1，3

（1第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實驗外科，陜西 西安710038；2北布倫瑞克醫(yī)院研究部，新澤西 美國 08902；3哈佛醫(yī)學(xué)院布萊根婦女醫(yī)院神經(jīng)外科，波士頓美國02115；4第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，陜西西安710032；5上海交通大學(xué)電子信息與電子工程學(xué)院，薄膜與微細(xì)技術(shù)教育部重點實驗室，儀器科學(xué)與工程中心，納米生物醫(yī)學(xué)與工程研究室，上海 200240；6西安兒童醫(yī)院矯形外科，陜西西安710003）

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）起源于大腦皮質(zhì)，是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤.盡管當(dāng)今的治療手段不斷進(jìn)步，包括手術(shù)、放療、化療和光動力治療等，然而GBM患者的預(yù)后情況仍然較差.最近的研究表明，microRNA?101（miR?101）在人腫瘤中顯著下調(diào)，并與腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤干細(xì)胞的自我更新有關(guān).另外，miR?101在神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，但膠質(zhì)瘤中miR?101的這種下調(diào)現(xiàn)象的分子機(jī)制尚不明確.本研究發(fā)現(xiàn)miR?101可以通過靶向SOX9在體內(nèi)和體外抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲.沉默SOX9對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲影響與miR?101類似.qRT?PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG和U87MG中miR?101與SOX9呈負(fù)相關(guān)，熒光素酶報告分析發(fā)現(xiàn)miR?101可以通過靶向SOX9的3'UTR區(qū)抑制SOX9的表達(dá).研究結(jié)果表明miR?101通過靶向抑制SOX9的表達(dá)在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲，說明miR?101是未來神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶標(biāo).

miR?101；SOX9；侵襲；遷移；增殖

0 引言

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的惡性腦瘤，通常來源于神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞可以形成星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤和少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤［1］.世界衛(wèi)生組織WHO分類系統(tǒng)將神經(jīng)膠質(zhì)瘤分為四個級別，每個級別包含多種病理亞型［2］.如今，手術(shù)、放療等傳統(tǒng)的膠質(zhì)瘤治療方法的預(yù)后很差［3－7］，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的治愈率低，生存期短.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的5年生存率低于5%，平均生存期僅14個月［8］.

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，對放療和化療的敏感性低，預(yù)后差且復(fù)發(fā)率高［9－11］.當(dāng)前，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的國際標(biāo)準(zhǔn)治療是手術(shù)切除后采用替莫咗胺（TMZ）同步周期性化療［12－13］.然而，由于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對放療和化療具有強(qiáng)抵抗性，只有30%的患者的平均生存期可以超過2年，其中只有9.8%的患者能達(dá)到 5年［14］.理論研究發(fā)現(xiàn)，微小 RNA（microRNA，miRNA）能夠抑制膠質(zhì)瘤的生物功能，提高患者存活率.研究也表明，敲除miR?21能夠抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）的增殖和誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［15－16］.這些發(fā)現(xiàn)為未來神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了新策略.

MicroRNA是一種內(nèi)源性的單鏈小RNA（19～25 nt）［17］，沒有開放閱讀框.作為非編碼的核苷酸，microRNA在許多重要的生命活動過程和疾病中起至關(guān)重要的作用［18］.microRNA通過與3'非翻譯區(qū)配對在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)［19］.microRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及其他重要的生命活動，而上述功能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［20］.例如，miR?21，miR?7，mir?128和miR?221／22與膠質(zhì)瘤的惡性發(fā)展［21－22］.有研究表明，miR?101在患者腫瘤樣本和細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，例如肺癌［28］、乳腺癌［29］、喉鱗狀細(xì)胞癌［30］、胚胎性橫紋肌肉瘤［31］和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［32］.本研究探討了miR?101在GBM中的功能.數(shù)據(jù)表明，miR?101通過靶向抑制SOX9的表達(dá)在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲，同時證明了SOX9對膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，這些結(jié)果闡明了SOX9在膠質(zhì)瘤中的重要功能，同時表明miR?101是膠質(zhì)瘤治療的新靶標(biāo).

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本和細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251MG和U87MG于2012年購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，正常膠質(zhì)細(xì)胞系A(chǔ)172、T98和HEB購自北京創(chuàng)聯(lián)生物科技公司（中國，北京）.細(xì)胞系真實性均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列驗證.所有細(xì)胞均用高糖DMEM（In?vitrogen公司，美國），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美國）、100單位／毫升的青霉素（NCPC公司，中國）和100 μg／mL的鏈霉素（NCPC公司，中國），培養(yǎng)環(huán)境為含5%二氧化碳的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱.人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本收集自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院的25例患者.正常腦組織標(biāo)本取自5位創(chuàng)傷性腦損傷的患者.本研究經(jīng)過第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn).本研究涉及的所有患者均已簽署知情同意書，所有標(biāo)本均根據(jù)倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)匿名處理.

1.2 總RNA提取和qRT?PCR通過實時熒光定量PCR（qRT?PCR）來檢測miR?101在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和創(chuàng)傷性腦損傷組織中的表達(dá)水平.按照試劑盒操作規(guī)程使用Trizol（Invitrogen公司，美國）從凍存的組織樣品和細(xì)胞中抽提總RNA.RNA用不含RNase的DNase處理（羅氏公司，瑞士）.然后使用BcaBest RNA PCR試劑盒（TAKAR公司，中國）合成cDNA.所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，熒光定量PCR使用SYBR底物，用iQ5實時PCR檢測系統(tǒng)（Bio?Rad公司）檢測信號.

1.3 載體構(gòu)建與慢病毒感染構(gòu)建miR?101過表達(dá)的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，miR?101的正向 引 物為：CCTGAATTCATTCTAATTTAAT?TCAACTGG；反向引物為：TATGGATCCTCAGCACAA?CATGGCTGCAC，酶切位點分別是EcoR I和BamH I.通過EcoR I和BamH I將miR?101亞克隆到pCDH1載體上（Promega公司，美國）.用表達(dá)miR?101的慢病毒以及陰性對照慢病毒（GenePharma公司，上海中國）.感染并用5 μg／L的嘌呤霉素篩選10 d后，收集細(xì)胞并提取總RNA進(jìn)行qRT?PCR表達(dá)分析.我們還構(gòu)建了SOX9敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系.SOX9的短發(fā)卡RNA（shRNA）和陰性對照慢病毒shRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海，中國）合成.慢病毒shRNA靶向序列分別是 shSOX9?1：GCATCCT?TCAATTTCTGTATA，sh?SOX9?2：CTCCACCTTCAC?CTACATGAA.干擾片段亞克隆到LV3慢病毒載體上，慢病毒產(chǎn)品也由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海，中國）合成.利用PCR擴(kuò)增包含miR?101結(jié)合序列的野生型SOX9的3'UTR序列為：5'?GAATTCT?CAGTGGCCAGGCCAACCTTC?3'和5'?CATATGAAAC?TGATCACATAACACAA?3'，擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到PGL3?luc載體上（Promega公司，美國）.將預(yù)測的miR?101靶向位點GUACUGU突變?yōu)镚AUGACA.野生型SOX9的引物是5'?GAATTCTCAGTGGCCAGGCCAAC?CTTC?3'和5'?CATATGAAACTGATCACATAACACAA?3'，突變體的引物是5'?ATATTTTTAGTATGATGACAG?TATGATTCAT?3'和5'?ATGAATCATACTGTCATCATA?CTAAAAATAT?3'.

1.4 MTT實驗MTT實驗步驟參照之前的報道［23］.將1×104個細(xì)胞重懸在200 μL培養(yǎng)基中種到96孔板中.處理后，培養(yǎng)基換成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.棄掉上清，細(xì)胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.測量490 nm處的OD值（SpectraMax公司，美國）.

1.5 細(xì)胞侵襲和遷移實驗用 250 μL無血清DMEM重懸2.5×105個細(xì)胞并種在24孔的transwell板的內(nèi)室（Cornin公司，美國），transwell板預(yù)先涂上30 μL的基質(zhì)膠（BD Biosciences，美國）.transwell板的內(nèi)室外部加入 600 μL的含 10%胎牛血清的DMEM.細(xì)胞在37°C遷移48 h（侵襲實驗）［24］.然后，transwell板內(nèi)室的細(xì)胞用棉簽擦掉，transwell板室底部的細(xì)胞用4%的多聚甲醛（Sigma?Aldrich公司）固定并用Hoechst染色.在顯微鏡下取五個不同的視野觀察并計數(shù)染色的細(xì)胞，每組實驗至少重復(fù)三次.遷移實驗與侵襲實驗類似，只是transwell板的內(nèi)室不要基質(zhì)膠包被，內(nèi)室外的培養(yǎng)基為含2.5%胎牛血清的DMEM.細(xì)胞遷移時間為8 h.

1.6 劃痕實驗將細(xì)胞種在6孔板上培養(yǎng)至細(xì)胞完全匯合，然后用200 μL槍頭劃出一道均勻的劃痕.PBS洗兩次去除懸浮細(xì)胞，然后用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞.分別在0 h，12 h，24 h觀察并在白光下拍照（尼康DS?5M相機(jī)）.

1.7 免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)（immunohis?tochemistry，IHC）中，8 μm的福爾馬林固定并用石蠟包被的腦組織切片先去蠟和水化.SOX9抗體（1∶100稀釋；Abcam 公司，美國）和 Ki67抗體（1∶100稀釋；羅氏公司；瑞士）4°C孵育過夜.一抗孵育完后，洗掉一抗，用生物素標(biāo)記的二抗（1∶800）室溫孵育1 h.用蘇木精染細(xì)胞核.光學(xué)顯微鏡（1×200）拍照，每組樣品至少選五個不同視野用于統(tǒng)計.

1.8 Western blot用高氯化鉀裂解緩沖液裂解細(xì)胞（10 mmol／L Tris?HCl，pH＝8.0，140 mmol／L氯化鈉，300 mmol／L氯化鉀，1 mmol／L EDTA，0.5%Triton X?100和0.5%鈉脫氧膽酸鹽）.裂解液中添加1%的蛋白酶抑制劑（Roche公司）.用BCA試劑盒測定蛋白濃度（Bio?Rad公司）.Western blot的主要過程參照之前的報道［25］.信號采集使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（GE healthcare公司，英國）.

1.9 熒光報告酶實驗Hsa?miR?101載體 （吉瑪公司，上海）和 PGL3，PGL3?SOX9 3'UTR，PGL3?SOX9 3'?UTRmut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293T細(xì)胞.轉(zhuǎn)染24 h后，收集并裂解細(xì)胞.采用雙熒光素報告酶分析系統(tǒng)檢測熒光素酶活性（Promega公司，美國）.

1.10 動物實驗所有動物實驗均經(jīng)過第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn).無胸腺的裸鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)（陜西，中國），并在動物房標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng).膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤實驗參照之前的報道［26］，分別為miR?NC和miR?101兩組U87MG細(xì)胞進(jìn)行移植.移植前裸鼠用10%水合氯醛麻醉，3.0×106的兩組細(xì)胞重懸在5 mL PBS中植入兩側(cè)來建立裸鼠皮下注射移植瘤模型.每天對裸鼠稱重.腫瘤體積通過測量腫瘤的長度（a）和（b）進(jìn)行計算，腫瘤體積（V）計算公式為：V＝ab2／2［27］.

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件（SPSS公司，美國）通過單邊非配對t檢驗對獨立樣本進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.所有統(tǒng)計結(jié)果的定量分析均采用標(biāo)準(zhǔn)誤（±SEM）進(jìn)行分析，并在圖中標(biāo)注，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR?101抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外的增殖、遷移和侵襲為了檢測miR?101在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，本研究收集了20例臨床標(biāo)本，包括10例四級標(biāo)本，10例三級標(biāo)本，10例二級標(biāo)本，10例一級標(biāo)本和4例腦損傷的正常大腦組織.數(shù)據(jù)表明，miR?101在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于正常腦組織的表達(dá)水平（圖1A），同時miR?101在U87MG，U251MG，A172和T98等膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平低于HEB細(xì)胞（圖1B）.為了檢測miR?101在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能，用miR?101慢病毒感染U87MG和U251MG細(xì)胞.感染miR?101慢病毒的U87MG和U251MG細(xì)胞能夠表達(dá)高水平的miR?101（圖1C）.劃痕實驗檢測miR?101對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷徙能力的影響，過表達(dá)miR?101的U87MG和U251MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷徙速度相對于陰性對照明顯變慢（圖1D，E）.此外，Transwell侵襲實驗表明過表達(dá)miR?101可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲（圖1F～I(xiàn)）.過表達(dá)miR?101的U87MG細(xì)胞侵襲能力只有對照細(xì)胞的大約八分之一，而遷移能力也只有對照的五分之二（圖1F，G）.過表達(dá)miR?101的U251MG細(xì)胞侵襲能力只有對照細(xì)胞的大約九分之一，遷移能力也降到對照的五分之二（圖1H，I）.MTT實驗檢測miR?101對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響（圖1J，K），感染后24 h～96 h內(nèi)，過表達(dá)miR?101的U87MG和U251MG細(xì)胞的增殖速度均顯著降低（P＜0.05），說明miR?101能顯著抑制膠質(zhì)瘤的增殖.

圖1 過表達(dá)miR?101抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外的增殖、遷移和侵襲

2.2 過表達(dá)miR?101抑制膠質(zhì)瘤腫瘤的體內(nèi)生長為了明確miR?101在膠質(zhì)瘤中的功能，本研究進(jìn)一步檢測了過表達(dá)miR?101對膠質(zhì)瘤腫瘤體內(nèi)生長的影響.根據(jù)前期報道，本研究選擇U87MG細(xì)胞進(jìn)行裸鼠移植腫瘤實驗［24］.將3.0×106個miR?101?U87MG細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞分別裸皮下注射裸鼠身體兩側(cè).注射30 d后，結(jié)果顯示miR?101?U87MG細(xì)胞形成的腫瘤體積明顯小于NC?U87MG形成的腫瘤（每組五只裸鼠，P＝2.89×10－3；圖2A～C）.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，miR?101?U87MG細(xì)胞形成的腫瘤中Ki67陽性細(xì)胞比例明顯小于NC?U87MG腫瘤（圖2D）.因此，miR?101在體內(nèi)體外均能抑制膠質(zhì)瘤腫瘤的生長.

2.3 MiR?101在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中直接靶向SOX9用生物信息學(xué)方法預(yù)測GBM中miR?101的潛在靶標(biāo).TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)SOX9基因的3'UTR區(qū)域包含miR?101的結(jié)合位點（圖3A），并且SOX9在二級三級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平高于正常的大腦組織（圖3B）.此外，qRT?PCR檢測發(fā)現(xiàn)裸鼠移植腫瘤中SOX9在miR?101?U87MG細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于NC?U87MG細(xì)胞.說明SOX9可能是miR?101的靶標(biāo).為了明確miR?101和SOX9的調(diào)控關(guān)系，我們使用qRT?PCR和Western blot比較了miR?101或miR?control慢病毒感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中SOX9的表達(dá)水平.miR?101過表達(dá)細(xì)胞中SOX9的mRNA水平和蛋白水平都顯著下調(diào)（圖3C～E）.本研究進(jìn)一步構(gòu)建了一個SOX9 3'UTR的熒光素酶報告質(zhì)粒.研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Luc?SOX9?UTR的細(xì)胞相比于miR?101靶向位點突變的SOX9 3'UTR質(zhì)粒和陰性對照的熒光素酶活性顯著降低 （圖3C）.以上結(jié)果表明在膠質(zhì)瘤中SOX9是miR?101的直接靶標(biāo).進(jìn)一步利用免疫熒光比較了miR?101和miR?control細(xì)胞中SOX9的表達(dá).結(jié)果表明，過表達(dá)miR?101只改變SOX9的表達(dá)水平，不改變其定位（圖3E）.

圖2 過表達(dá)miR?101抑制膠質(zhì)瘤腫瘤的體內(nèi)生長

2.4 SOX9在體內(nèi)體外的抑癌功能為了進(jìn)一步驗證SOX9和miR?101之間的靶向關(guān)系，本研究分析了SOX9在膠質(zhì)瘤中的功能.利用兩條shRNA sh?SOX9?1和sh?SOX9?2在U87MG和U251MG細(xì)胞中沉默SOX9.結(jié)果表明，sh?hSOX9?1的效果更好（圖4A，B）.然后利用MTT實驗、劃痕實驗和trans?well實驗檢測SOX9在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能.用sh?hSOX9?1慢病毒感染U87MG和U251MG細(xì)胞.MTT實驗檢測SOX9對U251MG和U87MG細(xì)胞增殖的影響.感染后24～96 h，相對于對照組，SOX9敲除細(xì)胞的細(xì)胞增殖速度顯著減慢（P＜0.05，圖4C，D）.Trans?well檢測發(fā)現(xiàn)SOX9沉默后U87MG和U251MG細(xì)胞遷移和侵襲能力均受到抑制（圖4E～H）.劃痕實驗檢測沉默SOX9對細(xì)胞遷徙能力的影響（圖4I，J），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX9?KD?U251MG細(xì)胞SOX9?KD?U87MG細(xì)胞的遷徙能力相對各自對照細(xì)胞均顯著變慢.這些結(jié)果表明SOX9在體外和體內(nèi)都是膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的必需因素.

圖4 SOX9在體內(nèi)體外均發(fā)揮抑癌功能

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是大腦最常見的原發(fā)性惡性腫瘤.盡管治療技術(shù)不斷進(jìn)步，包括手術(shù)、放射治療、光動力治療、化療等，然而惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后依舊很差，其高發(fā)病率和高死亡率促使人們不斷尋找新的治療策略.microRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，microRNA可以通過靶向目標(biāo)基因的3'UTR區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因的表達(dá)［33］.在人類許多腫瘤內(nèi)都發(fā)現(xiàn)microRNA的下調(diào)現(xiàn)象，如卵巢癌［34］、肺癌［35－36］、肝癌［37］、結(jié)腸癌［38－39］和GBM［40］等.microRNA的下調(diào)已經(jīng)成為一個新的惡性腫瘤的特征，所以一些特定的microRNA具有成為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物［41－45］.miR?101在幾種人類腫瘤中都是下調(diào)的.研究表明，miR?101能夠通過抑制纖維母細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用和靶向 CXCL12抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖［27］.miR?101在多種腫瘤中通過與CXCR7［29］，CDK8［30］，EZH2［31，47］和CPEB1［32］相互作用發(fā)揮生物功能.在GBM中，研究表明，miR?101可以通過靶向人Kruppel家族相關(guān)因子6在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中起腫瘤抑制因子的作用［46］.此外，miR?101可以逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LMO3啟動子的高甲基化［48］.總之，miR?101是包括惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤的重要調(diào)控因子.值得注意的是，研究表明在肝癌中miR?101可以直接靶向SOX9，抑制SOX9相關(guān)的腫瘤功能，促進(jìn)改善肝癌的預(yù)后［49］.SOX9是一個高機(jī)動的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎形成、分化、腫瘤發(fā)生、侵襲和干細(xì)胞自我更新中都扮演重要角色［50－51］.這些研究提示 SOX9可能參與miR?101的腫瘤抑制過程.因此本研究分析了膠質(zhì)瘤中SOX9和miR?101的關(guān)系.數(shù)據(jù)表明miR?101可以通過直接靶向SOX9抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.結(jié)果還表明，SOX9對于膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生在體外和體內(nèi)的增殖必不可少.前期報道指出SOX9受到EGFR［52］，Notch［53］，SHH［54］的調(diào)控，同時 SOX9可以調(diào)控Akt［55］，Wnt［56］和 BMI1［57］等信號通路.由此得出結(jié)論，miR?101和SOX9調(diào)控軸可以通過調(diào)控Akt、BMI1、Wnt信號通路調(diào)節(jié)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲（圖5）.本研究表明miR?101和SOX9是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并為未來膠質(zhì)瘤的治療提供了新的治療靶點.

圖5 miR?101通過靶向SOX9抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲模式圖

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MicroRNA?101 inhibits proliferation，migra?tion and invasion of human glioblastoma by targeting SOX9

LIU Nan1，ZHANG Lei1，6，WANG Zhen1，CHENG Ying?Duan1，2，ZHANG Peng?Xing1，WANG Xin3，WEN Wei?Hong4，YANG Hong?Wei3，LIU Hui1，JIN Wei?Lin5，ZHANG Yong?Sheng1，TU Yan?Yang1，3
1Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710038，China；2Department of Research Office，Cipher Ground，North Brunswick，NJ 08902，USA；3Department of Neurosurgery， Brigham and Women's Hospital，Harvard Medical School，Boston，MA 02115，USA；4Department of Immunology，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；5Institute of Nano Biomedicine and Engi?neering，Department of Instrument Science and Engineering，Key Laboratory for Thin Film and Microfabrication Technology of Ministry of Education，School of Electronic Information and Elec?tronic Engineering， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240，China；6Department of Orthopedics，Xi'an Children's Hospital，Xi'an 710003，China

Glioblastoma multiforme（GBM）is the most common primary malignant tumors originating in the brain parenchyma.At present，GBM patients have a poor prognosis despite of the con?tinuous progress in therapeutic technologies including surgery，ra?diotherapy，photodynamic therapy，and chemotherapy.Recent studies revealed that miR?101 was remarkably down?regulated in kinds of human cancers and was associated with aggressive tumor cell proliferation and stem cell self?renewal.Data also showed that miR?101 was down?regulated in primary glioma samples and cell lines，but the underlying molecular mechanism of the deregulation of miR?101 in glioma remained largely unknown.In this study，we found that miR?101 could inhibit the proliferation and invasion of glioma cells both in vitro and in vivo by directly targeting SOX9［sex?determining region Y（SRY）?box 9 protein］.Silencing of SOX9 exerted similar effects with miR?101 overexpression on glio?ma cells proliferation and invasion.Quantitative reverse transcrip?tion PCR and Western blotting analysis revealed a negative rela?tionship between miR?101 and SOX9 in human glioma U251MG and U87MG cells，and the luciferase assay indicated that miR?101 altered SOX9 expression by directly targeting on 3'UTR.Taken together，our findings suggest that miR?101 regulates glio?ma proliferation，migration and invasion via directly downregulat?ing SOX9 both in vitro and in vivo，and miR?101 may be a poten?tial therapeutic target for future glioma treatment.

miR?101；SOX9；invasion；migration；proliferation

R739.41

A

2095?6894（2017）07?37?07

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

國家自然科學(xué)基金（81572983）；陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目 （2015SF027）；唐 都 醫(yī) 院 創(chuàng) 新 發(fā) 展 基 金 資 助 項 目（2016JCYJ013）

劉 楠.碩士.研究方向：膠質(zhì)瘤基因治療.Tel：029?84778169 E?mail：liu＿nanabc＠126.com

涂艷陽.博士，副教授，副主任醫(yī)師.E?mail：tu.fmmu＠gmail.com