陳井陽(yáng)，鐘鳴，沈文靜，劉潔

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110002；3.附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110001；4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110122）

miR?608在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

陳井陽(yáng)1，鐘鳴2，沈文靜3，劉潔4

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122；2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110002；3.附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110001；4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110122）

目的研究miR-608在成釉細(xì)胞瘤（AB）中的表達(dá)及意義。方法利用實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR方法檢測(cè)miR-608在26例人成釉細(xì)胞瘤（AB組）及17例瘤旁組織（對(duì)照組）中的表達(dá)水平，比較miR-608在AB組與對(duì)照組，原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組，以及AB不同臨床病理特征的組間差異。結(jié)果AB中miR-608表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；復(fù)發(fā)組miR-608的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-608表達(dá)水平在不同年齡、性別和病理分型患者中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論人AB組織中miR-608表達(dá)水平顯著下降，可能與該腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)相關(guān)。

成釉細(xì)胞瘤；微小核糖核酸608；實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR；腫瘤復(fù)發(fā)

成釉細(xì)胞瘤（ameloblastom，AB）為口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤，是一種具有局部侵襲和易復(fù)發(fā)特征的臨界瘤［1］。由于其病因尚不明確，缺乏有效的治療措施，目前多采用手術(shù)切除，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，給患者身心帶來(lái)極大傷害。因此，闡明該腫瘤發(fā)生演進(jìn)的關(guān)鍵機(jī)制，尋找新的預(yù)防措施和治療途徑具有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類大小約22個(gè)核苷酸進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，隨著對(duì)其研究的深入，它和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，及在腫瘤診斷和治療方面潛在的應(yīng)用價(jià)值引起了廣泛的關(guān)注［2］。微小RNA 608（microRNA 608，miR-608）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用的miRNA。經(jīng)TargetScan生物信息軟件預(yù)測(cè)其下游靶基因有表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、人β-連環(huán)素蛋白互作蛋白1（catenin beta interacting protein 1，CTNNBIP1）、多種整合素分子等。研究［3-6］表明，miR-608可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)遷移能力，過(guò)表達(dá)miR-608可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，miR-608可通過(guò)影響含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶凋亡通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞調(diào)亡，并抑制細(xì)胞增殖，miR-608還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，但其在AB中的作用及機(jī)制尚未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)莖環(huán)法定量PCR檢測(cè)AB及癌旁對(duì)照組織中miR-608的表達(dá)，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2014年1月至2016年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除的26例AB標(biāo)本，作為AB組，按照復(fù)發(fā)情況又將其分為原發(fā)組（18例），復(fù)發(fā)組（8例）。AB組中男12例，女14例，年齡19～73歲，平均年齡43.44歲。按照病理分型分為實(shí)性/多囊型20例，其他型6例（包括外周型AB1例，單囊型5例）。17例瘤旁黏膜標(biāo)本為對(duì)照組，其中男性8例，女性9例，年齡19～73歲，平均年齡46.17歲?；颊咝g(shù)前未接受放化療等輔助治療，術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)診斷。標(biāo)本采集均已告知患者及家屬，并簽署知情同意書，且經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。標(biāo)本在液氮下速凍，然后置于-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

Trizol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）購(gòu)自美國(guó)Amersco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（with gDNA-ase）購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司；定量PCR擴(kuò)增試劑盒Real Star Green Fast Mixture購(gòu)自中國(guó)康潤(rùn)生物有限公司；miR-608莖環(huán)及定量PCR引物、U6內(nèi)參引物均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

1.3 莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR

1.3.1 引物序列：利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和qPCR上下游引物，miR-608莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGACGGAGC-3’；上游引物為5’-GGTGGTGTTGGGATAGCTTCGT-3’，下游引物為5’-GGCTGTCGTGGACTGCG-3’；U6莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’；上游引物為5’-TCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’。目的片段長(zhǎng)度約60 bp，退火溫度60°C。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：組織勻漿后按照Trizol說(shuō)明書操作，提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前將提取好的RNA從-80℃冰箱中取出，放在冰上溶解，待用。配置100 μmol/L各莖環(huán)原液，分別吸取1 μL至RNase-free水，使終體積為100 μL，則每個(gè)莖環(huán)的終濃度為1 μmol/L，混合莖環(huán)。首先在去除基因組DNA反應(yīng)體系中加入Total RNA 1～2 μg、5×gDNA Buffer 2 μL、RNasefree水補(bǔ)充體積到10 μL，徹底混勻，簡(jiǎn)短離心，并置于42℃孵育3 min，迅速放在冰上放置。加入10× Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、莖環(huán)混合RT引物2 μL、RNase-free水補(bǔ)充總體積到10 μL配制成反轉(zhuǎn)錄體系混合物。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的混合物，加入基因組DNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻。PCR反應(yīng)條件為42°C 15 min，95°C 3 min，-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：使用2×Real Star Green Mixture配制反應(yīng)混合物，將上述逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 1 μL、Real Star Green Mixture（2×）10 μL、Primers 0.6 μL用PCR-grade水補(bǔ)充至20 μL，使用Roche LightCycler?96熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)條件為95°C 5 min預(yù)變性，95°C 15 s、60°C 20 s、72°C 15 s，40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào)，溶解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。

1.3.4 結(jié)果分析：計(jì)算miR-608和內(nèi)參U6經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)、每例標(biāo)本3個(gè)平行孔的平均循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct）值，應(yīng)用U6對(duì)各實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行均一化校正（ΔCt），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的?Ct＝CtmiR-608-CtU6，miR-608相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔCt計(jì)算；??Ct＝?CtAB組-?Ct對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miR-608相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 U6表達(dá)情況

U6溶解曲線為銳利的單峰，出峰位置正確，表明反應(yīng)特異性好，結(jié)果可靠（圖1B）。擴(kuò)增曲線光滑，有明確的基線期、指數(shù)期和平臺(tái)期，AB組U6的Ct值為15.82±0.75，對(duì)照組U6的Ct值為17.15±0.84，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1A）（P＞0.05）。

2.2 miR-608表達(dá)情況

圖1 U6莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.1 The amplification curve and melting curve of U6 by stem?loop real?time PCR

miR-608溶解曲線沒有雜峰，產(chǎn)物單一（圖2B）。AB組miR-608表達(dá)水平顯著下降，平均Ct值為25.98±1.03，對(duì)照組miR-608的Ct值為20.24± 0.76，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2A）。

圖2 miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.2 Amplification and melting curves of miR?608 by stem?loop RT?PCR

2.3AB組和對(duì)照組miR-608表達(dá)水平比較

以對(duì)照組miR-608的平均Ct值為1，對(duì)照組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.13±0.12，AB組miR-608表達(dá)相對(duì)值為0.38±0.03，AB組miR-608表達(dá)水平明顯降低，為對(duì)照組的33.73%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 AB組和對(duì)照組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量分析Fig.3 Relative quantitative analysis of miR?608 in the amelo?blastoma and control groups by stem?loop RT?PCR

2.4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平比較

以復(fù)發(fā)組miR-608的平均Ct值為1，復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.03±0.05，原發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為2.07±0.14，復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平顯著降低，為原發(fā)組的48.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)PCR定量結(jié)果分析Fig.4 Analysis of miR?608 in the primary and recurrent amelo?blastoma groups by stem?loop RT?PCR

2.5 miR-608表達(dá)與AB臨床病理特征

不同年齡、性別和病理分型患者miR-608表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

3 討論

Sonic Hedgehog（SHH）信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵信號(hào)通路，它受靶細(xì)胞膜上2種受體 Patched（PTCH）和Smoothened（SMO）控制［7］。近年來(lái)研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)通路在牙齒早期發(fā)育和牙源性腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。自分泌刺激增殖和SHH信號(hào)通路抗凋亡作用在AB發(fā)生中起關(guān)鍵作用［10］。SHH通路上的多種信號(hào)分子，如PTCH1、SMO、Gli 1、Gli 2、Gli 3均在AB中高表達(dá)，并和腫瘤上皮增殖相關(guān)［11］。miR-608位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的第2區(qū)3號(hào)帶第3號(hào)亞帶，在軟骨細(xì)胞中，SHH表達(dá)水平和miR-608呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-608或miR-602可抑制SHHmRNA和蛋白表達(dá)水平［12］。在AB中，SMO基因與AB等牙源性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但具體突變位點(diǎn)和意義需要更多的研究證實(shí)。由此可見，miR-608可調(diào)控SHH，SMO等基因參與成牙組織異常和牙源性腫瘤［13］。

表1 不同臨床病理特征AB中miR?608的表達(dá)Tab.1 miR?608 expression levels and clinicopathological fea?tures of ameloblastoma

miR-608自身作為抑癌性miRNA，通過(guò)抑制其下游靶基因參與腫瘤診斷和治療，在肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮作用［3-5］。位于成熟miR-608序列上的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs4919510 C＞G可降低miR-608與上述癌基因的結(jié)合能力，可能是一個(gè)功能性SNP［14-16］，研究［17-21］表明其和乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎癌、脊索瘤等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過(guò)莖環(huán)定量PCR的方法檢測(cè)了AB組和對(duì)照組中miR-608的表達(dá)，并比較miR-608在AB組與對(duì)照組，原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組，以及AB不同臨床病理特征的組間差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-608在AB中表達(dá)明顯降低，原發(fā)AB組高于復(fù)發(fā)AB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-608可以抑制細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)，在AB中其表達(dá)下降，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和AB發(fā)生。本研究結(jié)果可能為成釉細(xì)胞瘤早期診斷、治療和預(yù)防提供生物標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)。由于本研究的臨床樣本數(shù)量有限，從現(xiàn)有標(biāo)本的數(shù)據(jù)分析中得出的結(jié)果，尚不能支持miR-608表達(dá)水平的高低與AB的病理學(xué)分型存在顯著的相關(guān)性，有待擴(kuò)大樣本，進(jìn)行更深入的探討。下一步還將針對(duì)miR-608SNP位點(diǎn)和AB發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及下游的靶基因功能進(jìn)行研究。

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（編輯 北 辰）

The Expression and Significance of miR?608 in Ameloblastoma

CHEN Jingyang1，ZHONG Ming2，SHEN Wenjing3，LIU Jie4

（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Department of Oral Pathology，College of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；3.Department of Gynecologic，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.The Science Experiment Center，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo study the expression and significance ofmiR-608in ameloblastoma（AB）.MethodsQuantitative stem-loop RTPCR was used to detect the expression ofmiR-608in 26 cases of human AB（AB group）and 17 cases of peritumoural tissues（control group）.The differences inmiR-608levels between the control group and the AB groups，namely，primary AB and recurrent AB，were evaluated.In addition，miR-608levels in AB cases with different clinical and pathological characteristics were compared.ResultsThe expression level ofmiR-608in the AB group was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.Additionally，the relative expression level ofmiR-608in the primary AB group was significantly lower than that in the recurrent AB group（P＜0.05）.There were no significant differences between themiR-608expression levels with respet to age，gender，or pathological type（P＞0.05）.ConclusionsThe expression ofmiR-608in human AB tissue is significantly decreased，which may be related to the recurrence of the tumor.

ameloblastoma；miR-608；quantitative stem-loop RT-PCR；tumor recurrence

R780.2

A

0258-4646（2017）08-0724-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.012

國(guó)家自然科學(xué)基金（81470758）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（LK201626）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610159025）

陳井陽(yáng)（1980-），男，技師，本科.

劉潔，E-mail：lj6152003@163.com

2017-05-24

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