裴祎，牟帥，薛峰，滕松齡，王廣斌

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，沈陽(yáng) 110042；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110004；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科，沈陽(yáng) 110024）

miR?646抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移的機(jī)制初探

裴祎1，牟帥2，薛峰2，滕松齡3，王廣斌2

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，沈陽(yáng) 110042；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110004；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外科，沈陽(yáng) 110024）

目的探討miR-646對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。方法通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-646過(guò)表達(dá)或受到抑制后對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)分析miR-646過(guò)表達(dá)或受到抑制后對(duì)U2OS細(xì)胞遷移的影響。MIRDB預(yù)測(cè)miR-646與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的位點(diǎn)結(jié)合后，利用熒光素酶報(bào)告及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-646對(duì)EGFR的靶向作用，并通過(guò)Western blotting檢測(cè)miR-646對(duì)EGFR通路的作用。結(jié)果MTT結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-646后U2OS細(xì)胞的增殖受到了顯著地抑制，24 h時(shí)抑制率為21.76%±1.05%，相反，當(dāng)miR-646受到抑制后U2OS細(xì)胞的增殖得到了促進(jìn)，24 h時(shí)促進(jìn)的比率為18.89%±0.81%。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-646可以抑制骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的遷移能力。隨后MIRDB預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-646與EGFR的3’UTR區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了miR-646可以直接作用于EGFR。Western blotting結(jié)果證明miR-646對(duì)U2OS細(xì)胞增殖遷移能力的抑制在一定程度上是通過(guò)miR-646對(duì)EGFR通路的抑制實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論miR-646可以通過(guò)抑制EGFR通路的活性，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移功能。

miR-646；骨肉瘤；表皮生長(zhǎng)因子；遷移；增殖

骨肉瘤是最常見(jiàn)的一種兒童原發(fā)性惡性腫瘤，骨肉瘤患者的5年生存率約為68%，但是一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率則銳減至20%左右［1-2］。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的異常擴(kuò)增或突變是惡性骨肉瘤中很常見(jiàn)的表現(xiàn)［3］。EGFR可以通過(guò)調(diào)節(jié)cyclin D1等蛋白的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞的增殖情況，也可以通過(guò)作用于Akt等通路影響細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，EGFR對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）的調(diào)節(jié)也會(huì)參與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［4］。微小RNA（miRNA）可以在很多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA，這些miRNA可以作為抑癌基因或者癌基因發(fā)揮作用［5］。

本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-646具有通過(guò)調(diào)節(jié)EGFR通路影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

U2OS細(xì)胞由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存，使用DMEM（Dulbecc’s modified eagle media）培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）加10%胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）培養(yǎng)。EGFR（sc-377229），cyclin d1（sc-8396），MMP2（sc-13594），gapdh（sc-365062）抗體及相關(guān)二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。EGFR WT，EGFR MUT（突變與miR-646結(jié)合位點(diǎn)的序列）引物均合成于上海生工生物工程公司。熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自上海英拜生物科技有限公司。miR-646過(guò)表達(dá)/對(duì)照、miR-646抑制劑/對(duì)照及miR-646反義鏈（AS）購(gòu)自于廣州銳博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)：分別在U2OS細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-646過(guò)表達(dá)/對(duì)照或者miR-646抑制劑/對(duì)照，24 h后取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞消化，以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。于0、12、24、36和48 h分別通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO 200 μL溶解結(jié)晶，溶解后在490 nm處記錄吸光值。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：分別將miR-646過(guò)表達(dá)質(zhì)粒/miR-646反義鏈及EGFR野生型/突變型轉(zhuǎn)染到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞中，使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)得熒光值并計(jì)算統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)：U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同處理因素24 h后，將無(wú)血清培養(yǎng)基中的U2OS細(xì)胞以1×105/孔接種于Transwell小室上室中，下室添加600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，95%乙醇固定，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色。

1.2.4 Western blotting：使用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白。每個(gè)樣本取等量蛋白在10%的SDS-PAGE膠內(nèi)電泳，電泳結(jié)束后4℃100 V轉(zhuǎn)膜1 h后洗膜，并通過(guò)5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。對(duì)應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-646對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響

分別將miR-646模擬物和對(duì)照轉(zhuǎn)染到U2OS細(xì)胞，得到miR-646過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。利用MTT方法，于0、12、24、36和48 h分別檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，miR-646對(duì)U2OS細(xì)胞的增殖具有一定抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 miR?646模擬物作用下細(xì)胞的增殖情況Fig.1 Proliferation of cells treated with miR?646

分別將miR-646抑制物和對(duì)照轉(zhuǎn)染到U2OS細(xì)胞后，得到miR-646低表達(dá)的細(xì)胞系。利用MTT的方法，于0、12、24、36和48 h分別檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，miR-646對(duì)U2OS細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。見(jiàn)圖2。

圖2 miR?646抑制物作用下細(xì)胞的增殖情況Fig.2 Proliferation of cells treated with miR?646 inhibitor

2.2 miR-646對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的調(diào)節(jié)

骨肉瘤的遷移能力極強(qiáng)，這直接導(dǎo)致了其預(yù)后效果不佳，并且一旦發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，患者的生存期通常較短。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-646可能對(duì)骨肉瘤有一定的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，為了進(jìn)一步了解其是否可以影響骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力，本研究在U2OS細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了miR-646，并且通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-646可以抑制U2OS細(xì)胞的遷移，見(jiàn)圖3。隨后，利用U2OS細(xì)胞構(gòu)建miR-646低表達(dá)的細(xì)胞系，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-646表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)U2OS細(xì)胞的遷移能力，見(jiàn)圖4。

2.3 miR-646和EGFR的關(guān)系

圖3 miR?646模擬物對(duì)U2OS遷移能力的影響 ×200Fig.3 Effect of miR?646 mimic on migration of U2OS cells×200

圖4 miR?646抑制物對(duì)U2OS遷移能力的影響 ×200Fig.4 Effect of miR?646 inhibitor on migration of U2OS cells×200

通過(guò)MTT和Transwell的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-646對(duì)于U2OS細(xì)胞的增殖和遷移能力均有一定的抑制作用，為了探索miR-646對(duì)U2OS細(xì)胞生物學(xué)功能抑制作用的機(jī)制，通過(guò)生物學(xué)軟件（MIRDB）預(yù)測(cè)尋找miR-646可能打靶的位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-646與EGFR的3’UTR區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖5。

圖5 miR?646與EGFR的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of binding sites between miR?646 and EGFR

為了進(jìn)一步了解miR-646是否可以直接調(diào)控EGFR的表達(dá)，本研究進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-646與EGFR共同轉(zhuǎn)染時(shí)，EGFR的活性顯著下調(diào)，但是轉(zhuǎn)入miR-646的反義鏈后此作用消失，而且當(dāng)miR-646與EGFR MUT共同轉(zhuǎn)染時(shí)，不會(huì)影響EGFR的活性，說(shuō)明miR-646可以直接作用于EGFR，見(jiàn)圖6。

2.4 miR-646對(duì)EGFR通路的調(diào)節(jié)

圖6 miR?646可以直接打靶EGFRFig.6 miR?646 targeted EGFR

構(gòu)建miR-646過(guò)表達(dá)的U2OS細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-646對(duì)EGFR、cyclin D1和MMP2蛋白均有一定的抑制作用，見(jiàn)圖7。隨后構(gòu)建了miR-646穩(wěn)定低表達(dá)的U2OS細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-646表達(dá)下調(diào)之后，EGFR、cyclin D1和MMP2蛋白的表達(dá)均有所上調(diào)，見(jiàn)圖8。

圖7 miR?646對(duì)EGFR通路蛋白的影響Fig.7 Effect of miR?646 on EGFR pathway

圖8 miR?646對(duì)EGFR通路蛋白的影響Fig.8 Effect of miR?646 on EGFR pathway

3 討論

骨肉瘤是兒童及青少年時(shí)期發(fā)病率較高的惡性腫瘤，也是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤。骨肉瘤生長(zhǎng)極為快速，很容易發(fā)生遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移［6］。

EGFR在多種腫瘤中被報(bào)道存在異常表達(dá)或者異常激活的現(xiàn)象，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和分化等多種生命過(guò)程中均有EGFR的參與。目前很多EGFR的靶向治療藥物（單克隆抗體或者小分子抑制劑）均已投入臨床應(yīng)用，在治療結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等多種腫瘤方面起到了重要作用。在骨肉瘤中，EGFR也被證明存在過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，很多研究［7-10］指出，EGFR可以促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

miRNA可作為癌基因或抑癌基因介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展和進(jìn)展。目前為止，很多研究報(bào)道已經(jīng)指出miRNA在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。miR-1，miR-133和miR-378均被證明在骨肉瘤組織中低表達(dá)，并且可以通過(guò)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡以及抑制其侵襲轉(zhuǎn)移來(lái)起到抑制骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的目的。

miR-646已經(jīng)被證明在肺癌、骨肉瘤、肝細(xì)胞癌和腎細(xì)胞癌中具有低表達(dá)的現(xiàn)象。miR-646可以通過(guò)抑制FGF2的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-646可以負(fù)調(diào)控NOB1進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移。miR-646與肝癌的易感性也密切相關(guān)［11-15］。

miR-646與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為了深入探討miR-646在骨肉瘤中是如何發(fā)揮作用的，本研究進(jìn)行了一系列分析實(shí)驗(yàn)。在構(gòu)建miR-646過(guò)表達(dá)與沉默的細(xì)胞系后，分別通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-646對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖和遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-646過(guò)表達(dá)后可以顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞的增殖功能大大增強(qiáng)，促進(jìn)了腫瘤的快速生長(zhǎng)，對(duì)機(jī)體構(gòu)成了壓迫性損傷，因此推斷miR-646對(duì)于骨肉瘤有一定的治療效果。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-646可以顯著抑制U2OS細(xì)胞的遷移。

MIRDB預(yù)測(cè)指出miR-646可以與EGFR有一定的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-646可以直接作用于EGFR，這證明了miR-646可以通過(guò)影響EGFR的活性影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。接下來(lái)通過(guò)對(duì)EGFR通路蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-646過(guò)表達(dá)可以抑制EGFR、cyclin D1和MMP2的表達(dá)，這說(shuō)明miR-646可以通過(guò)影響EGFR通路來(lái)調(diào)節(jié)U2OS細(xì)胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，miR-646可以通過(guò)抑制EGFR通路來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，為骨肉瘤的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

［1］HE M，JIANG L，REN Z，et al.Noscapine targets EGFR p-Tyr1068 to suppress the proliferation and invasion of MG63 cells［J］.Sci Rep，2016，10（6）：37062.DOI：10.1038/srep37062.

［2］ARETZ I，HARDT C，WITTIG I，et al.An impaired respiratory electron chain triggers down-regulation of the energy metabolism and deubiquitination of solute carrier amino acid transporters［J］.Mol Cell Proteomics，2016，15（5）：1526-1538.DOI：10.1074/mcp. M115.053181.

［3］SEVELDA F，MAYR L，KUBISTA B，et al.EGFR is not a major driver for osteosarcoma cell growth in vitro but contributes to starvation and chemotherapy resistance［J］.J Exp Clin Cancer Res，2015，2（34）：134.DOI：10.1186/s13046-015-0251-5.

［4］WANG Q，CAI J，WANG J，et al.MiR-143 inhibits EGFR-signalingdependent osteosarcoma invasion［J］.Tumour Biol，2014，35（12）：12743-12748.DOI：10.1007/s13277-014-2600-y.

［5］SARVER AL，THAYANITHY V，SCOTT MC，et al.MicroRNAs at the human 14q32 locus have prognostic significance in osteosarcoma［J］.Orphanet J Rare Dis，2013，11（8）：7.DOI：10.1186/1750-1172-8-7.

［6］MORTUS JR，ZHANG Y，HUGHES DP.Developmental pathways hijacked by osteosarcoma［J］.Adv Exp Med Biol，2014，804：93-118.DOI：10.1007/978-3-319-04843-7_5.

［7］XIAO Q，ZHANG X，WU Y，et al.Inhibition of macrophage polarization prohibits growth of human osteosarcoma［J］.Tumour Biol，2014，35（8）：7611-7616.DOI：10.1007/s13277-014-2005-y.

［8］HOU CH，LIN FL，TONG KB，et al.Transforming growth factor alpha promotes osteosarcoma metastasis by ICAM-1 and PI3K/Akt signaling pathway［J］.Biochem Pharmacol，2014，89（4）：453-463. DOI：10.1016/j.bcp.2014.03.010.

［9］LEE JA，KO Y，KIM DH，et al.Epidermal growth factor receptor：is it a feasible target for the treatment of osteosarcoma［J］.Cancer Res Treat，2012，44（3）：202-209.DOI：10.4143/crt.2012.44.3.202.

［10］MCCLEESE JK，BEAR MD，KULP SK，et a1.Met interacts with EGFR and Ron in canine osteosarcoma［J］.Vet Comp Oncol，2013，11（2）：124-139.DOI：10.1111/j.1476-5829.2011.00309.x.

［11］PAN Y，CHEN Y，MA D，et al.miR-646 is a key negative regulator of EGFR pathway in lung cancer［J］.Exp Lung Res，2016，42（6）：286-295.DOI：10.1080/01902148.2016.1207726.

［12］AZAM AT，BAHADOR R，HESARIKIA H，et al.Downregulation of microRNA-217 and microRNA-646 acts as potential predictor biomarkers in progression，metastasis，and unfavorable prognosis of human osteosarcoma［J］.Tumour Biol，2016，37（5）：5769-5773.DOI：10.1007/s13277-015-3821-4.

［13］SUN XH，GENG XL，ZHANG J，et al.Downregulation of microRNA-217 and microRNA-646 acts as potential predictor biomarkers in progression，metastasis，and unfavorable prognosis of human osteosarcoma［J］.Tumour Biol，2015，36（3）：2127-2134.DOI：10.1007/s13277-014-2822-z.

［14］FINNERTY JR，WANG WX，HEBERT SS，et al.The miR-15/107 group of microRNA genes：evolutionary biology，cellular functions，and roles in human diseases［J］.J Mol Biol，2010，402（3）：491-509.DOI：10.1016/j.jmb.2010.07.051.

［15］LI W，LIU M，F(xiàn)ENG Y，et al.Downregulation of microRNA-217 and microRNA-646 acts as potential predictor biomarkers in progression，metastasis，and unfavorable prognosis of human osteosarcoma［J］.Br J Cancer，2014，111（6）：1188-1200.DOI：10.1038/ bjc.2014.382.

（編輯 于 溪）

Mechanism of Inhibition of Proliferation and Migration of Osteosarcoma Cells by miR?646

PEI Yi1，MU Shuai2，XUE Feng2，TENG Songling3，WANG Guangbin2

（1.Department of Bone and Soft Tissue Surgery，Cancer Hospital of China Medical University，Liaoning Cancer Hospital&Institute，Shenyang 110042，China；2.Department of Orthopaedics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；3.Department of Hand Surgery，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical Collage，Shenyang 110024，China）

ObjectiveThe mechanism of inhibition of the proliferation and migration of osteosarcoma cells by miR-646 was investigated.Meth?odsThe effects of miR-646 on the proliferation of U2OS cells were detected by MTT assay.The effects of miR-646 on U2OS cell migration were analyzed by Transwell assay.MIRDB was used to predict the binding sites of miR-646 and epidermal growth factor receptor（EGFR），which were confirmed in a luciferase reporter assay.Western blotting was conducted to detect the effect of miR-646 on the EGFR pathway.ResultsThe MTT test showed that transfection of miR-646 significantly inhibited U2OS cell proliferation；the 24 h inhibition rate was 21.76%±1.05%.In contrast，the 24 h promotion was 18.89%±0.81%.Transwell experiments showed that miR-646 inhibited the migration of osteosarcoma U2OS cells.MIRDB predicted that miR-646 bound in the 3’-untranslated region of EGFR，and luciferase reporter gene experiments showed that miR-646 directly acted on EGFR.Western blotting experiments demonstrated that miR-646 inhibited the proliferation and migration of U2OS cells to some extent by inhibiting the EGFR pathway.ConclusionmiR-646 can inhibit the proliferation and migration of osteosarcoma cells by inhibiting the EGFR pathway.

miR-646；osteosarcoma；epidermal growth factor receptor；migration；proliferation

R738.1

A

0258-4646（2017）08-0729-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.013

裴祎（1984-），男，主治醫(yī)師，碩士.

王廣斌，E-mail：wanggb@sj-hospital.org

2016-12-27

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：