夏艷秋，朱強，李偉偉，尹鳳鳴

（江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港222005）

低值海藻滸苔乙醇發(fā)酵條件的研究

夏艷秋，朱強，李偉偉，尹鳳鳴

（江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港222005）

通過單因素試驗及正交試驗，采用硫酸水解法，以酸解液中還原糖產率為檢測指標，考察適宜的滸苔酸解條件；之后采用滸苔酸解液直接發(fā)酵法，以發(fā)酵液中乙醇產率為檢測指標，研究滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件。結果表明，優(yōu)化的滸苔酸解條件為：滸苔懸液質量濃度40 g/L、硫酸體積分數4%、80℃酸解2 h。在此條件下，還原糖產率最高可達40.05%。優(yōu)化的滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件為：釀酒高活性干酵母、接種量10%、初始pH6.0、30℃發(fā)酵48 h。在此條件下，乙醇產率最高可達16.46%。結果為滸苔生物質燃料乙醇生產提供一定的理論依據與試驗數據。

滸苔；酸解液；乙醇；發(fā)酵

滸苔（Enteromorpha prolifera）為綠藻門、石莼科、大型綠藻。我國野生滸苔資源十分豐富[1-2]，報道稱，滸苔含70%以上碳水化合物，主要為多糖類和粗纖維，另外還含有13%粗蛋白、15%灰分和1%粗脂肪等，可作為食品、藥品、飼料、肥料等開發(fā)原料，但與滸苔的生長速度及目前的存有量相比，依然缺乏大規(guī)模資源化利用的新途徑[3-5]。自2008年至今，我國已連續(xù)9年頻繁爆發(fā)滸苔“綠潮”災害，大量滸苔的堆積，生物資源浪費且嚴重影響海洋生態(tài)環(huán)境及海水養(yǎng)殖業(yè)，積極探索合理有效處理滸苔的新途徑已迫在眉睫[2，6]。在能源緊缺的當下，生物質燃料的生產理應成為滸苔資源化應用的一個重要突破口，必將掀起工業(yè)研究熱潮[7]。目前，關于滸苔生物燃料的文獻報道主要集中于滸苔生物燃油的制備[8-10]。然而，關于滸苔生物乙醇生產的研究相對較少[11-13]。本研究采用連云港海域緣管滸苔，旨在通過滸苔硫酸酸解液酵母菌直接發(fā)酵法生產燃料乙醇，探索一條滸苔乙醇發(fā)酵的產率高、簡單可行、節(jié)能降耗的新工藝，擬為滸苔生物質燃料乙醇生產提供一定的理論依據與試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔：2015年3月底于連云港市附近海域采集，經過清洗、脫鹽、曬干、粉碎過80目篩，于干燥箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

釀酒高活性干酵母、面包酵母、黃酒酵母、啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司。

濃硫酸、重蒸苯酚、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、葡萄糖、重鉻酸鉀、氫氧化鈉、無水碳酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

WF-20B型錘式萬能粉碎機：南京申運佳機械有限科技有限公司；GZX-9140MBE型數顯鼓風式干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；BZS-82型往復式恒溫水浴振蕩器：上海博珍儀器設備制造廠；HZQ-F160型臥式恒溫振蕩培養(yǎng)箱：黑龍江省哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計：美國Varian公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 滸苔酸解條件研究

基礎條件為30 g/L滸苔懸液中硫酸體積分數為2%，70℃水浴振蕩酸解2h，pH自然。在此基礎上，分別調整滸苔懸液質量濃度梯度為10～60g/L，硫酸體積分數梯度1%～6%，酸解溫度梯度為50～120℃，酸解時間梯度0～4h，酸解液過濾，濾液8000 r/min離心5m in，取上清液測定還原糖含量，以酸解液中還原糖產率為檢測指標，分別研究適宜的滸苔懸液質量濃度、硫酸體積分數、酸解溫度及酸解時間，并分析滸苔酸解過程中還原糖的消長規(guī)律。3次平行試驗，取平均值。

1.3.2 滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件研究

采用1.3.1優(yōu)化條件酸解滸苔，在250m L三角瓶中加入50m L上述滸苔酸解液作為發(fā)酵液，冷卻至30℃接種活化的酵母菌（細胞濃度為4×107CFU/m L），以發(fā)酵液中乙醇產率為檢測指標，研究滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件。3次平行試驗，取平均值。

單因素試驗：基礎條件為滸苔酸解液初始pH5.5，接種量10%，釀酒高活性干酵母28℃發(fā)酵48h。在此基礎上，分別采用釀酒高活性干酵母、啤酒酵母、黃酒酵母、面包酵母，調整滸苔酸解液初始pH梯度為5.0～7.0，接種量為5%～20%，發(fā)酵溫度梯度為15～35℃，分別研究適宜的發(fā)酵菌種、初始pH、接種量、發(fā)酵溫度區(qū)間。

正交試驗：在單因素試驗基礎上，采用正交試驗確定優(yōu)化的滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件并驗證。

1.3.3 檢測方法

還原糖的測定采用3,5-二硝基水楊酸法；乙醇含量的測定采用重鉻酸鉀-DNS比色法[14]：在經典重鉻酸鉀氧化比色法測定乙醇含量的基礎上，使用DNS氧化比色法測定發(fā)酵液中葡萄糖含量，修正乙醇含量的測定結果。

2 結果與分析

2.1 滸苔酸解條件研究

2.1.1 滸苔懸液質量濃度的確定

滸苔懸液質量濃度對還原糖產率的影響見圖1。由圖1可明顯看出，隨滸苔懸液質量濃度增加，酸解液中還原糖產率呈增加趨勢，其中，10～40 g/L低質量濃度區(qū)增加幅度遠大于40～60 g/L高質量濃度區(qū)?？梢姡捎昧蛩崴鉂G苔適宜選擇較低懸液濃度，以實現(xiàn)酸根離子與滸苔糖苷鍵的充分接觸，亦可避免因葡萄糖濃度的增加而發(fā)生的葡萄糖復合反應及分解反應，從而減少副產物的生成，提高糖液質量。因此，試驗確定最佳滸苔懸液質量濃度為40 g/L。

圖1 滸苔懸液質量濃度對還原糖產率的影響Fig.1 Effects of E.prolifera concentration on reducing sugar yield

2.1.2 硫酸體積分數的確定

硫酸體積分數對滸苔還原糖產率的影響見圖2。由圖2可知，隨硫酸體積分數增加，酸解液中還原糖產率呈先增加后下降趨勢。其中，硫酸體積分數為4%時還原糖產率最高。由于H+對滸苔糖苷鍵的水解作用沒有一定的秩序，水解過程中，同時有鼠李糖、葡萄糖和木糖等的生成[11]。因此，硫酸體積分數越高，水解速度越快，但同時副反應和副產物也隨之增加，酸解液色澤也相應加深，必將影響后續(xù)乙醇發(fā)酵。因此，試驗確定最佳硫酸體積分數為4%。

圖2 硫酸體積分數對滸苔還原糖產率的影響Fig.2 Effects of sulfuric acid concentration on reducing sugar yield of E.prolifera

2.1.3 酸解溫度的確定

圖3 酸解溫度對滸苔還原糖產率的影響Fig.3 Effects of acidolysis tem perature on reducing sugar yield of E.prolifera

酸解溫度對滸苔還原糖產率的影響見圖3。由圖3可知，酸解溫度100℃以內，隨酸解溫度升高，酸解液中還原糖產率呈先快速增加后緩慢增加趨勢。事實上，硫酸體積分數一定時，滸苔水解速度與溫度成正比，溫度越高，水解速度越快，水解時間亦越短，但是超過80℃上升趨勢不明顯，故選擇酸解溫度為80℃。

2.1.4 酸解時間的確定

酸解時間對滸苔還原糖產率的影響見圖4。由圖4可知，滸苔長時間接觸硫酸會導致已生成的還原糖減少，高溫條件下尤其劇烈。因此，試驗確定硫酸水解滸苔最佳溫度和時間分別是80℃、2 h，與已報道的高溫酸解相比[15]，較低的溫度既可以改善工業(yè)生產環(huán)境，又能降低熱耗，還能提高還原糖產率。

圖4 酸解時間對滸苔還原糖產率的影響Fig.4 Effect o f acidolysis time on reducing sugar yie ld o f E.prolifera

結合圖1～圖4，綜合考慮還原糖產率、能量、設備等成本投入及操作的便利性、安全性和副產物的生成，試驗確定適宜的滸苔酸解條件為：滸苔懸液質量濃度40 g/L、硫酸體積分數4%、80℃、2 h的高溫短時硫酸水解法。在此條件下，還原糖產率最高可達40.05%。

2.2 滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件研究

2.2.1 單因素試驗

菌種、初始pH、接種量以及發(fā)酵溫度對滸苔水解液乙醇發(fā)酵的影響見圖5。圖5A表明，釀酒高活性干酵母最適宜滸苔酸解液乙醇發(fā)酵，其次是面包酵母，啤酒酵母和黃酒酵母則不適宜。

由圖5B可知，乙醇產率隨滸苔酸解液初始pH的升高呈先上升后下降的趨勢，滸苔酸解液初始pH6.0時乙醇產率較高。酸根離子濃度過高，則不利于滸苔酸解液的乙醇發(fā)酵，這也同時印證了2.1.2試驗結果。

由圖5C可知，酵母接種量2%～10%時有利于乙醇積累。接種量過高，酵母耗糖主要用于生長繁殖產生單細胞，乙醇產率大大降低。接種量過低，遲滯期將延長，發(fā)酵緩慢，一部分酵母因環(huán)境不適而自溶，發(fā)酵液中殘?zhí)嵌?、乙醇少，且發(fā)酵過程中由于酵母沒有快速形成優(yōu)勢菌群易滋生雜菌，非乙醇發(fā)酵糖耗增加，導致乙醇產率降低，故選擇酵母接種量為10%。

由圖5D可知，發(fā)酵溫度為25～30℃時，乙醇產率較高，與釀酒酵母的適宜生長溫度接近，利于溫度控制及生產管理，且發(fā)酵溫度高，發(fā)酵速度快，發(fā)酵周期則短，亦可節(jié)約冷卻成本，實現(xiàn)了發(fā)酵工業(yè)的低投高產目標。

圖5 菌種（A）、初始pH（B）、接種量（C）、及發(fā)酵溫度（D）對滸苔酸解液乙醇發(fā)酵的影響Fig.5 Effects o f strains(A),initialpH(B),inoculum(C)and fermentation tem perature(D)on ethanol fermentation of E.prolifera acid solution

2.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以接種量、初始pH、發(fā)酵溫度為評價因素，乙醇產率為評價指標，進行3因素3水平正交試驗，結果與分析見表1，方差分析見表2。

表1 滸苔酸解液乙醇發(fā)酵條件正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis oforthogonalexperiments for E.pro lifera acid hydrolysis a lcohol ferm entation conditions optim ization

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance ana lysis of orthogonalexperiments results

由表1直觀分析和表2方差分析可以得出，影響滸苔酸解液乙醇發(fā)酵的因素次序為A＞C＞B，接種量影響顯著，最優(yōu)組合為A3B2C3，即最適發(fā)酵條件為接種量10%，初始pH為6.0，發(fā)酵溫度30℃。由根據優(yōu)化的最佳條件，進行3次驗證試驗，平均乙醇產率為16.46%，高于正交試驗所有試驗組。

2.3 討論

試驗表明，硫酸體積分數及酸解溫度是決定還原糖產率的關鍵因素。酸解過程中還原糖的復合或分解必然影響產率，因此，分析水解糖的種類及總糖、還原糖和副產物在滸苔酸解過程的消長規(guī)律將有利于合理控制滸苔酸解過程，后續(xù)試驗將對此進行深入研究。

試驗發(fā)現(xiàn)，接種量是影響乙醇產率的顯著因素。對酵母菌來講，直接利用滸苔酸解液發(fā)酵產乙醇是一種新的挑戰(zhàn)，從適應性生長繁殖過度到正常生產發(fā)酵既會消耗較多非生產時間，還可能因不適應而衰亡，這也是試驗過程接種量較大的主要原因。因此，通過分離或育種的方式選育能快速利用滸苔酸解液高產乙醇的酵母菌是當務之急。另外，欲解決接種后酵母快速形成優(yōu)勢菌群的現(xiàn)象，生產過程中，可通過種母的同步培養(yǎng)獲得，既能減少接種量，又能提高乙醇產率[16]，從而有效抑制雜菌滋生，這些有待于進一步深入研究。

3 結論

試驗研究并優(yōu)化了滸苔硫酸水解條件及酸解液的乙醇發(fā)酵條件，即滸苔懸液質量濃度40 g/L、硫酸體積分數4%、80℃酸解2 h，釀酒高活性干酵母接種量10%、初始pH6.0、30℃發(fā)酵48 h。在此條件下，還原糖產率最高可達40.05%，乙醇產率最高可達16.46%，與現(xiàn)有文獻報道相比，具有明顯的優(yōu)勢，即酸解條件溫和，還原糖產率及乙醇產率均較高。

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Ethanol fermentation conditionsbaseon low-value seaweed Enteromorphaprolifera

XIA Yanqiu,ZHU Qiang,LIWeiwei,YIN Fengm ing
(Jiangsu Key Laboratory ofMarine Biotechnology,Lianyungang 222005,China)

Through single factorand orthogonalexperiments,using reducing sugaryield ofacid hydrolysisasdetection index,theoptimal Enteromorpha prolifera hydrolysisconditionwasoptimized with sulfuric acid hydrolysismethod.Then using ethanolyield asevaluation index,theethanol fermentation conditionsof E.prolifera acid hydrolysiswas studied.Results showed that the optimalhydrolysis condition wasobtained as follows:E.prolifera suspension concentration 40 g/L,sulfuric acid concentration 4%,80℃acid hydrolysis for 2 h.Under the condition,the reducing sugar yield wasup to 40.05%.The optimal ethanol fermentation condition washigh activity dry yeast,inoculum 10%,initial pH 6.0,fermentation temperature 30℃, and time 48 h.Under these conditions,theethanolyield wasup to 16.46%.Theexperimental resultsprovided some theoreticalbasisand experimentaldata for the production ofbiomass fuelethanolw ith E.prolifera.

Enteromorphaprolifera;acid hydrolyzate;ethanol;fermentation

TS261.4

0254-5071（2017）08-0095-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.021

2017-03-26

連云港市科技基金項目（社會發(fā)展SH1312）；連云港市科技基金項目（農業(yè)支撐KK15007）

夏艷秋（1977-），女，講師，碩士，主要從事發(fā)酵工程及應用微生物學研究工作。