李靖，馬嫄*，徐丹，蔣珍菊，車振明，高飛

（1.西華大學(xué)糧油加工與食品安全重點實驗室，四川成都610039；2.雀巢（中國）有限公司成都分公司，四川成都610041）

紅油豆瓣醬中產(chǎn)氣芽孢桿菌的分離、鑒定與抑制研究

李靖1，馬嫄1*，徐丹2，蔣珍菊1，車振明1，高飛1

（1.西華大學(xué)糧油加工與食品安全重點實驗室，四川成都610039；2.雀巢（中國）有限公司成都分公司，四川成都610041）

在儲藏過程中，紅油豆瓣醬中的微生物會利用剩余營養(yǎng)物質(zhì)二次發(fā)酵產(chǎn)生氣體導(dǎo)致脹罐，影響產(chǎn)品品質(zhì)。該實驗對產(chǎn)氣脹罐的紅油豆瓣醬中微生物進(jìn)行分離、鑒定，共分離得到兩株產(chǎn)氣菌分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniform is）；而后利用復(fù)配防腐劑對產(chǎn)氣菌株P(guān)X012進(jìn)行抑制，并通過正交試驗確定最佳的防腐劑復(fù)配配方為Nisin 0.2‰，尼泊金復(fù)合酯0.2‰，雙乙酸鈉0.6‰，富馬酸3.0‰，可有效抑制產(chǎn)氣微生物的生長，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

紅油豆瓣醬；產(chǎn)氣芽孢桿菌；鑒定；復(fù)配防腐劑

郫縣豆瓣因其風(fēng)味獨(dú)特、酯香濃郁、色澤油潤而成為“川菜之魂”。其大致加工工藝為：鮮椒選取→辣椒醅→椒醅配料→拌入甜瓣子→制曲→保溫發(fā)酵→混合發(fā)酵→翻曬→成熟豆瓣→成品檢驗[1]。作為郫縣豆瓣醬生產(chǎn)過程中最為關(guān)鍵的步驟，發(fā)酵的質(zhì)量直接決定產(chǎn)品質(zhì)量。從制曲到發(fā)酵，不同階段有著不同的功能菌參與，其種類與數(shù)量都有著較大的差異。豆瓣醬的發(fā)酵過程可分為發(fā)酵前期、發(fā)酵期和發(fā)酵后期[2]。發(fā)酵前期為制曲階段，在此階段霉菌占據(jù)著絕對的優(yōu)勢，通過曲霉分泌的各種酶類，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、植物分解酶等將豆瓣中的蛋白質(zhì)、多糖等分解、轉(zhuǎn)化為多肽、氨基酸、葡萄糖等物質(zhì)以供后續(xù)微生物的生產(chǎn)發(fā)酵，植物組織分解酶則主要將瓣子中的纖維類轉(zhuǎn)化分解為糖類，同時還有利于被纖維包裹的蛋白質(zhì)的釋放、分解[3]；發(fā)酵期由于加入了大量的鹽，不適合霉菌和酵母菌的生長，主要是巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等菌株在作用[4]，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）作為發(fā)酵期的優(yōu)勢菌種之一，其具有很強(qiáng)的分解淀粉以及利用蛋白合成有機(jī)酸和雙乙酰的能力，在豆瓣的發(fā)酵過程中，將體系中的淀粉快速分解，促進(jìn)豆瓣醬的快速發(fā)酵，同時產(chǎn)生香氣物質(zhì)，如有機(jī)酸、二乙酰等物質(zhì)[5]；發(fā)酵后期主要是芽孢桿菌屬、乳桿菌、酵母菌等微生物[6]，在甜瓣子和辣椒醅混合后即進(jìn)入后發(fā)酵（混合發(fā)酵）階段。

郫縣豆瓣后發(fā)酵的時間從幾個月到1～2年不等，不同類型的產(chǎn)品其后發(fā)酵時間存在較大的差異。后發(fā)酵時間長，微生物產(chǎn)生的酶可充分降解豆瓣醬中的淀粉、蛋白等物質(zhì)[7]。而紅油豆瓣醬后發(fā)酵時間較短，一般為30～60 d，是在辣椒醅和瓣子調(diào)配完成后，等到其中無明顯氣泡產(chǎn)生就進(jìn)行防腐劑的添加、成品檢驗和灌裝等工藝。由于后發(fā)酵時間短，豆瓣醬中存在的芽孢桿菌等會利用體系中未降解完全的氨基酸、糖等物質(zhì)進(jìn)行二次發(fā)酵產(chǎn)生氣體，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)。董丹等[2]對兩個不同發(fā)酵時期的豆瓣醬中微生物研究發(fā)現(xiàn)其中微生物的種類和數(shù)量都有著很大的差異，發(fā)酵中期主要以Bacillus、W ickerhamomyces、Candida為優(yōu)勢菌株，分別占到分離菌株的54%、14%、11%；發(fā)酵后期則以芽孢桿菌屬、海洋芽孢桿菌、嗜鹽單孢菌為優(yōu)勢菌，分別占總分離菌株的55%、16%和14%。

作為一種短期發(fā)酵豆瓣醬，紅油豆瓣醬的產(chǎn)氣脹罐經(jīng)常發(fā)生，尤其在夏季產(chǎn)氣現(xiàn)象加劇，不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)，也給企業(yè)造成大量損失?，F(xiàn)今關(guān)于紅油豆瓣醬產(chǎn)氣問題的研究鮮有報道，因此本研究以出現(xiàn)脹罐問題的紅油豆瓣醬為原料，通過分離、純化、分子生物學(xué)鑒定，確定產(chǎn)氣微生物的種類，而后根據(jù)豆瓣醬貯藏內(nèi)環(huán)境以及產(chǎn)氣微生物的種類初篩防腐劑，通過單因素抑菌試驗，選擇出抑菌效果較好的防腐劑，再通過正交試驗設(shè)計優(yōu)化復(fù)配防腐劑的配方，通過復(fù)合防腐劑對紅油豆瓣醬中產(chǎn)氣微生物的有效抑制，從而解決其在儲藏過程中的產(chǎn)氣脹罐問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出現(xiàn)產(chǎn)氣脹罐的紅油豆瓣醬：由四川省郫縣豆瓣股份有限公司提供。

平板計數(shù)瓊脂（plate countagar，PCA）培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂（soybean-casein digestagar，TSA）培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、酵母麥芽（yeastmalt，YM）培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：北京路橋技術(shù)股份有限公司。

DNA提取試劑盒：Biotech生物科技有限公司；核糖核酸酶（ribonuclease，R-Nase）：美國Sigma公司；細(xì)菌所用引物為通用引物Eu27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）、Taq酶：天根生化科技（北京）有限公司；Nisin：浙江銀象生物技術(shù)工程有限公司；尼泊金復(fù)合酯、富馬酸、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、雙乙酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5422型臺式離心機(jī)、AG22331型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：Eppendorf（中國）有限公司；T2A凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀：北京六一儀器廠；G154DWS型立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離

按照1.1中所述配制培養(yǎng)基，121℃滅菌25m in。用無菌生理鹽水對產(chǎn)氣脹罐紅油豆瓣醬樣品進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，分別吸取稀釋液0.1m L于各培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)1～2 d，真菌培養(yǎng)基于27℃培養(yǎng)2～7 d。

1.3.2 菌株純化

根據(jù)1.3.1中平板培養(yǎng)菌落的形態(tài)、大小、顏色、透明度等指標(biāo)對菌落進(jìn)行分類編號，分別用劃線法接種到對應(yīng)的分離培養(yǎng)基上，進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.3.3 產(chǎn)氣驗證試驗

運(yùn)用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基對純化菌株進(jìn)行產(chǎn)氣驗證試驗，初步確定產(chǎn)氣微生物的數(shù)量。將剛出廠的紅油豆瓣醬進(jìn)行121℃滅菌25m in，而后將初步確定的產(chǎn)氣微生物菌液接種于其中進(jìn)行培養(yǎng)觀察，對產(chǎn)氣微生物進(jìn)行再次驗證，確定產(chǎn)氣微生物。

1.3.4 PCR擴(kuò)增及序列比對

利用無菌竹簽挑取產(chǎn)氣微生物單菌落于1.5m L的EP管中，參照Biotech試劑盒說明書，提取菌體DNA。

以提取到的菌體DNA為模板，通過引物Eu27f（5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1490R（5'-CGGTTACCTT GTTACGACTT-3'）擴(kuò)增對象菌序列，PCR擴(kuò)增條件：95℃變性5m in；循環(huán)：95℃變性1m in，50℃退火1m in，72℃延伸2m in，35個循環(huán)；72℃延伸10min[8-9]。所得PCR產(chǎn)物利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行檢測，電泳時間30m in。并將擴(kuò)增成功的PCR原液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

將測序結(jié)果輸入美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）序列分析，確定產(chǎn)氣微生物種屬。

1.3.5 杯碟法抑菌實驗

（1）防腐劑的篩選[10]

將供試防腐劑配成含量為0.5%的溶液，采用杯碟法進(jìn)行抑菌實驗。供試菌的菌懸液濃度為107～108CFU/m L。在37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑。根據(jù)每種防腐劑的抑菌圈直徑及抑菌穩(wěn)定性，確定抑菌效果較好的幾種防腐劑。

（2）最低抑菌濃度的測定

將篩選出的防腐劑分別配制成系列濃度梯度，測定其針對產(chǎn)氣微生物的最低抑菌濃度（m inimal inhibitory concentration，M IC）值，操作方法參考1.3.5。根據(jù)M IC值，選擇產(chǎn)氣微生物中M IC值較大的菌株進(jìn)行后續(xù)的防腐劑正交復(fù)配試驗。

（3）正交試驗優(yōu)化防腐劑配方

根據(jù)防腐劑M IC值及國標(biāo)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的防腐劑使用限量制定正交試驗的因素與水平，見表1。

表1 防腐劑配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Tab le 1 Factors and levels of orthogonalexperiments for preservative form ula optim ization

1.3.6 抑菌驗證試驗

將復(fù)合防腐劑按照0.1‰濃度，選取PX012號菌進(jìn)行抑菌實驗，評估復(fù)合防腐劑抑菌效果。同時分別將工廠原配方防腐劑和優(yōu)化的復(fù)合防腐劑分別加入到剛出廠的紅油豆瓣醬中，37℃培養(yǎng)，在10 d的觀察期內(nèi)，記錄兩種樣品的產(chǎn)氣情況。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

2.1.1 分離純化

通過分離純化結(jié)合菌落顏色、形態(tài)、大小、邊緣形狀等，從產(chǎn)氣紅油豆瓣樣品中篩選出26株微生物，分別編號為PX001～PX026。

2.1.2 產(chǎn)氣驗證試驗

通過葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基利用杜氏發(fā)酵管進(jìn)行產(chǎn)氣驗證試驗，發(fā)現(xiàn)共有兩株菌表現(xiàn)出產(chǎn)氣性能，分別為菌株P(guān)X012和PX019。

2.2 菌株的微生物多樣性分析

通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳驗證、堿基對序列測定，電泳圖譜見圖1。而后將序列輸入NCBI基因庫中進(jìn)行Blast比對，確定兩株產(chǎn)氣微生物的種屬，結(jié)果見表2。

圖1 兩株菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose ge lelectrophoresis o f PCR am plification product of two strains

表2 分離菌株微生物多樣性分析Tab le 2 Microbialdiversity analysis o f isolated strains

由表2可知，通過對菌株進(jìn)行序列比對后，確定菌株P(guān)X012為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）；菌株P(guān)X019為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniform is）。

從紅油豆瓣醬中分離的微生物來看，大多為細(xì)菌、芽孢桿菌類。B.licheniformis為豆瓣醬發(fā)酵中的常見菌種，其主要功能是在發(fā)酵過程中協(xié)助真菌分解食品中的蛋白質(zhì)和淀粉，為其他微生物的生長創(chuàng)造條件以及形成風(fēng)味物質(zhì)[11]，B.amyloliquefaciens在豆瓣的發(fā)酵過程中，將體系中的淀粉快速分解，促進(jìn)豆瓣醬的快速發(fā)酵，同時產(chǎn)生香氣物質(zhì)，如有機(jī)酸、二乙酰等物質(zhì)。B.licheniformis、B.amyloliquefaciens大多是通過附著在原料的表面帶入到體系中，在發(fā)酵階段利用體系中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖，在豆瓣醬的發(fā)酵過程中產(chǎn)香產(chǎn)酯，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的形成，在后期儲藏過程中，B.licheniform is和B.amyloliquefaciens利用紅油豆瓣醬體系中的剩余糖、淀粉等進(jìn)行二次發(fā)酵，產(chǎn)生氣體。

2.3 防腐劑的篩選

分別利用6種防腐劑對兩株產(chǎn)氣微生物進(jìn)行抑制實試驗，通過單因素試驗，確定對產(chǎn)氣微生物抑制效果較好的防腐劑，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 單因素抑菌篩選試驗結(jié)果Fig.2 Results of single factor antibacteria screening experiments

由圖2可知，脫氫乙酸鈉和山梨酸鉀對兩株菌的抑菌效果不佳。作為食品中最常用的防腐劑，山梨酸鉀有著極廣泛的應(yīng)用，其對革蘭氏陰性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陽性菌[12]。紅油豆瓣醬屬于弱酸性環(huán)境，其中大多為芽孢桿菌，故山梨酸鉀對其抑制效果不好，其抑菌圈直徑從幾乎無現(xiàn)象到9mm之間波動，抑菌效果不穩(wěn)定[13]。脫氫乙酸鈉對細(xì)菌有著較好的抑制作用，同時對酵母菌的抑制作用更佳，且受pH值的影響較小，不同菌種對其耐受性不同，因此對菌株P(guān)X019，其抑菌圈直徑完全不明顯，抑制作用很弱，而對菌株P(guān)X012的抑制作用大致為12mm左右，但抑菌效果均弱于尼泊金復(fù)合酯、Nisin、雙乙酸鈉和富馬酸，但是強(qiáng)于山梨酸鉀，這與黎婉園等[14]研究結(jié)果一致。Nisin作為一種生物型窄譜防腐劑，對革蘭氏陽性菌（G+）的抑菌效果好于革蘭氏陰性菌（G-）[15]。尼泊金酯類防腐劑作為一種廣譜抑菌劑，對G+具有較好的抑菌效果，研究結(jié)果顯示其對枯草芽孢桿菌、霉菌等都具有較好的抑菌效果。富馬酸能夠較好的抑制食品中的細(xì)菌，同時對溫度、pH值等敏感性小[16]。實驗數(shù)據(jù)也表明，尼泊金復(fù)合酯、Nisin、雙乙酸鈉、富馬酸四種防腐劑對產(chǎn)氣菌株的抑制效果較好，抑菌圈直徑的大小較集中，分別集中在22mm、25mm、19mm、17mm左右，抑菌效果穩(wěn)定，因此選擇這四種防腐劑進(jìn)行復(fù)配試驗。

2.4 最低抑制濃度值測定

表3 各防腐劑的最低抑菌濃度Table 3 MIC value of different preservatives

由表3可知，Nisin的抑菌效果最好，而后依次為雙乙酸鈉、尼泊金復(fù)合酯和富馬酸。Nisin對兩株菌的M IC值較小，為0.05‰；而尼泊金復(fù)合酯和富馬酸對菌株P(guān)X012的抑制效果稍弱于菌株P(guān)X019。綜合四種防腐劑的M IC值，選擇菌株P(guān)X012作為后續(xù)試驗的對象菌進(jìn)行4種防腐劑配方優(yōu)化正交試驗。

2.5 正交試驗優(yōu)化防腐劑配方

以菌株P(guān)X012抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，對防腐劑Nisin、尼泊金復(fù)合酯、雙乙酸鈉和富馬酸的添加量進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗結(jié)果與分析見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 防腐劑配方優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonalexperiments for preservative form ula optim ization

由表4可知，對抑菌效果的影響大小為Nisin＞尼泊金復(fù)合酯＞雙乙酸鈉＞富馬酸。最優(yōu)防腐劑配方組合為A4B4C3D3，即Nisin 0.2‰，尼泊金復(fù)合酯0.2‰，雙乙酸鈉0.6‰，富馬酸3.0‰。在此優(yōu)化條件下，菌株P(guān)X012的抑菌圈直徑為26.5mm。

表5 正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonalexperim ents results

由表5可知，Nisin添加量對結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），雙乙酸鈉、尼泊金復(fù)合酯和富馬酸添加量對結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。

2.6 抑菌驗證試驗

將復(fù)合防腐劑按照0.1‰的比例加入到剛出廠的紅油豆瓣醬中，另一組按照工廠原生產(chǎn)工藝添加防腐劑，37℃培養(yǎng)，在10 d的觀察期內(nèi)對所有樣品的產(chǎn)氣情況進(jìn)行記錄，實驗結(jié)果見表6。

表6 出廠紅油豆瓣添加不同配方防腐劑產(chǎn)氣情況Table 6 Aerogenesis condition o f finalproduct of broad bean paste w ith chilioilwith different preservatives

由表6可知，前2 d，添加原配方和復(fù)合配方的豆瓣醬中均未出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象，此時環(huán)境中的微生物對處于適應(yīng)期，且受到防腐劑的抑制作用，生理生化反應(yīng)減弱。從第4天開始，原配方中的微生物對環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng)，且由于防腐劑的抑制作用弱，微生物開始大量增殖，產(chǎn)氣現(xiàn)象逐漸明顯，而且隨著儲藏期的延長，從第6天開始產(chǎn)氣現(xiàn)象不斷加重，最后造成脹袋。而添加復(fù)合防腐劑的樣品，在10 d觀察期內(nèi)，由于各種防腐劑的相互作用，對產(chǎn)氣微生物始終表現(xiàn)出較好的抑制作用，使其增殖和生理生化作用受到抑制，未觀察到產(chǎn)氣現(xiàn)象。

3 結(jié)論

從產(chǎn)氣紅油豆瓣醬樣品中篩選出26株微生物，通過葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)，確定其中兩株菌為產(chǎn)氣微生物，分別為PX012、PX019，分子生物學(xué)鑒定表明，菌株P(guān)X012為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）；菌株P(guān)X019為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。通過防腐劑正交優(yōu)化試驗，確定出對產(chǎn)氣菌株P(guān)X012有抑制作用的最佳防腐劑配方為Nisin 0.2‰，尼泊金復(fù)合酯0.2‰，雙乙酸鈉0.6‰，富馬酸3.0‰。將復(fù)配防腐劑加入剛出廠的紅油豆瓣中，進(jìn)行37℃恒溫培養(yǎng)，在10 d的觀察期內(nèi)未出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象。結(jié)果表明，該復(fù)配防腐劑可以有效地抑制紅油豆瓣醬產(chǎn)品在儲藏過程中產(chǎn)氣。

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Isolation,identification and inhibition ofaerogenic Bacillussp.from broad bean paste with chilioil

LIJing1,MA Yuan1*,XU Dan2,JIANG Zhenju1,CHEZhenm ing1,GAO Fei1
(1.Key Laboratory ofGrain Processing and Food Safety,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Nestle(China)Co.,Ltd.,Chengdu Branch,Chengdu 610041,China)

Themicroorganism in broad bean paste w ith chili oil can conduct secondary fermentation by using residual nutrients,and cause serious bulging bag during storage,thus affect the product quality.Themicroorganism from the broad bean pastew ith chilioil in aerogenic packageswas isolated,purified,and identified.Results showed that two strains of Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus licheniform is were isolated.Furthermore, strain PX012 was inhibited by compound preservative.Through orthogonal experiments,the optimal preservative formula was as follows:nisin 0.2‰,nipagin complex 0.2‰,sodium diacetate0.6‰,fumaric acid 3.0‰.Itcould effectively inhibit thegrow th ofaerogens,which assures thequality of the product.

broad bean pastew ith chilioil;aerogenic Bacillus sp.;identification;compound preservative

TS264.29

0254-5071（2017）08-0031-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.007

2017-06-01

四川省“郫縣豆瓣”研究所委托項目（12205508）；四川省三創(chuàng)項目（10623086）

李靖（1992-），男，碩士研究生，研究方向為食品安全。

*通訊作者：馬嫄（1978-），女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。