□ 金艷紅 朱群英 南昌市疾病預(yù)防控制中心

QuEChERS耦合UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定葡萄中9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

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目的：采用液質(zhì)聯(lián)用同時(shí)測(cè)定葡萄中α-萘乙酸、多效唑、2、4-D、矮壯素、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤、氯吡脲、縮節(jié)胺和對(duì)氯苯氧乙酸9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。方法：樣品按QuEChERS方法前處理采用乙腈提取、PSA凈化，以乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱分離，三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果：9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)性r≥0.99，檢出限在0.15～8.89 μg/kg，加標(biāo)回收率在77.2%～112.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.08%～9.12%。結(jié)論：該方法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、有機(jī)試劑使用少，靈敏度高、回收率好，適用于日常葡萄中多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)，可縮短檢測(cè)周期。

QuEChERS；液質(zhì)聯(lián)用；葡萄；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(Regulator)的使用已逐漸成為推動(dòng)現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要手段，它是一類具有植物激素活性的人工合成化學(xué)物質(zhì)，屬于農(nóng)藥范疇[1]。然而，與其他農(nóng)藥一樣，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有一定的毒性?，F(xiàn)農(nóng)業(yè)植物激素使用情況增多，安全性也受到廣泛關(guān)注[2]。

隨著人們食品安全意識(shí)的提高，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法不斷更新。使用方法為氣相色譜法（GC）[3-8]，需要衍生化反應(yīng)，前處理過(guò)程較繁瑣；酶聯(lián)免疫法[9-11],該方法可作為一種快速篩查方法，有特異性強(qiáng)、靈敏度高、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，但也存在很多缺陷。高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是目前最常用的分析方法，液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用法以其抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高并且能夠提供化合物結(jié)構(gòu)信息而應(yīng)用于多組分同時(shí)分析檢測(cè)[12-19]。本文以采用乙腈提取、PSA凈化按QuEChERS方法前處理，液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定葡萄中9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

超高效液相色譜儀LC-30A與三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)（日本島津公司）；Organomation N-EVNP24氮吹儀；IKA MS3渦旋振蕩器；Milli-Q Direct8 超純水機(jī)；Peak Scientific氮?dú)獍l(fā)生器(NM32L)；eppendorf 5424臺(tái)式高速離心機(jī)。

1.1.2 試劑

乙腈（LCMS級(jí)）；乙酸銨、氨水，為色譜純；超純水；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：多效唑、2、4-D、矮壯素、氯吡脲，購(gòu)于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；縮節(jié)胺、對(duì)氯苯氧乙酸，購(gòu)于上海市農(nóng)藥研究所有限公司，以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度均為100 μg/mL；α-萘乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤為固體，購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件

Waters AC QUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱；流動(dòng)相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨（含0.05%氨水），梯度洗脫程序：0～7 min，95%～85%的B流動(dòng)相；7.10～10.50 min 65%的B流動(dòng)相；11.0～15.0 min，20%的B流動(dòng)相；15.1 min 95%的B流動(dòng)相；柱溫:33 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速: 0.2 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源ESI，采用ESI正負(fù)模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM：離子源接口電壓：±3.5 kV；脫溶劑管溫度：240 ℃；加熱模塊溫度：400℃；霧化氣流量：氮?dú)?.0 L/min；干燥氣流量：15 L/min；碰撞氣：氬氣；駐留時(shí)間：100 ms；延遲時(shí)間：1 ms。

表1 9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑MRM參數(shù)表

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)使用液的的配制

用移液器分別吸取6種標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）100 μL，用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容到10 mL，制備成6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。稱取0.01 gα-萘乙酸、吲哚-3-丁酸、6-芐基腺嘌呤用乙腈定容到100 mL成100 μg/ mL標(biāo)準(zhǔn)液，再用移液器分別吸取上述三種標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）100μL，用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容到10 mL，制備成9種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.4 樣品處理

將樣品混勻，準(zhǔn)確稱取10.00 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，超聲15 min，取出加入0.5 g氯化鈉，2.0 g硫酸鎂， 渦1 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液4 mL到10 mL離心管中，加250 mg PSA、0.5 mg硫酸鎂， 渦1 min，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心3 min，準(zhǔn)確吸取2 mL凈化液于玻璃試管中，在50 ℃下用氮?dú)獯蹈?。再用乙?10 mmol/L乙酸銨水溶液（20∶80，V∶V）定容至1 mL。渦旋混合1 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，準(zhǔn)備上機(jī)。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

對(duì)常用的C18反相色譜柱考察，需要從所用的色譜柱的內(nèi)徑、柱分離效果等不同角度考慮，較小流量可獲得較高離子化效率。實(shí)驗(yàn)考察兩個(gè)不同型號(hào)的色譜柱1：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)不銹鋼色譜柱，2：Shim-pack XR-ODS (3.0 mm×50 mm，2.2 μm)不銹鋼色譜柱，在相同流速下柱1分離效果較好且離子化效率高，所以選擇柱了1為本方法用的分離柱。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中液相分離與質(zhì)譜的離子化是一對(duì)矛盾體,為實(shí)現(xiàn)有效離子化，目標(biāo)化合物最好在流動(dòng)相中以離子形式存在，為取得良好分離，目標(biāo)化合物以非離子形式存在，所以流動(dòng)相的選擇時(shí)要考慮分離效果，也要兼顧分離組分進(jìn)入質(zhì)譜前的離子化效率，以獲得最佳分辨率和最高靈敏度。分別考察以乙腈-10 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）作為流動(dòng)相，考察三者對(duì)待測(cè)化合物峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）、乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）對(duì)目標(biāo)物能更好分離，但乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）相對(duì)10 mmol/L乙酸銨（0.5%乙酸）能使對(duì)氯苯氧乙酸的峰形平滑。故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）作為流動(dòng)相。

表2 9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限表

表3 9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的回收率和精密度表

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 母離子的優(yōu)化

將各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配成相應(yīng)單標(biāo)，不接分析柱下進(jìn)樣5 μL，分別在ESI（-）和ESI(＋)模式下進(jìn)行Q3 Scan，最后確定各目標(biāo)物的母離子質(zhì)量數(shù)。

2.2.2 碰撞能的優(yōu)化以及子離子的選擇

在確定好的母離子情況下，將0.5 μg/mL的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑單標(biāo)，在不接色譜柱情況下，對(duì)子離子選擇以及對(duì)相應(yīng)電壓和能量，優(yōu)化子離子以響應(yīng)值最高為定量離子，響應(yīng)其次為定性離子。MRM參數(shù)見(jiàn)表1，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）見(jiàn)圖1。

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

為提高植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)的靈敏度和選擇性，降低樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物離子化的影響，延長(zhǎng)分析柱壽命，對(duì)提取液凈化處理以降低色素、蛋白和脂肪等基質(zhì)組分干擾。乙腈對(duì)不同極性的物質(zhì)有一定溶解能力，適合多種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)，故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取劑；硫酸鎂和氯化鈉的混合加入是為避免部分干擾物（如糖）一起提取出來(lái)。

2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法的檢出限和定量限

用乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）（20∶80，V∶V）配成不同濃度范圍的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)化合物標(biāo)示濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，回歸計(jì)算見(jiàn)表2。以3倍信噪比估算檢出限，10倍信噪比對(duì)應(yīng)濃度為定量限見(jiàn)表2。

由表2可知，目標(biāo)物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.99，可克服樣品提取、凈化及上機(jī)測(cè)定過(guò)程造成的誤差，滿足不同含量的樣品檢測(cè)，方法檢出限低。

圖1 9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

2.4.2 方法的回收率和精密度

取葡萄空白樣品，分別加入高中低3個(gè)濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.4樣品前處理方法處理，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3，可知9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有較好的回收率。

2.4.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法測(cè)定本地市售的12份葡萄樣品，其中在兩份葡萄樣品中都檢測(cè)出氯吡脲（8.26 μg/kg、5.74 μg/ kg），其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均未檢出。

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS耦合液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定葡萄中9種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。該方法采用乙腈提取、PSA凈化,以乙腈-10 mmol/L乙酸銨（0.05%氨水）溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫， Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)不銹鋼色譜柱分離，三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。該方法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、有機(jī)試劑使用少，靈敏度高、回收率好，適用于日常葡萄中多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑檢測(cè)，可縮短檢測(cè)周期。

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南昌市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（立項(xiàng)文號(hào)210，編號(hào)：59）。

金艷紅（1986—）女，江西吉安人，碩士，主管技師。研究方向：衛(wèi)生理化檢驗(yàn)。