孟麗，陶潔，李本強(qiáng)，馬玉飛，程靖華，張春玲，劉惠莉

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106 2 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

豬7種腹瀉相關(guān)病毒的臨床檢測(cè)及豬嵴病毒的遺傳進(jìn)化分析

孟麗1,2，陶潔1，李本強(qiáng)1，馬玉飛1,2，程靖華1，張春玲1，劉惠莉1

1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106 2 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

孟麗, 陶潔, 李本強(qiáng), 等. 豬 7種腹瀉相關(guān)病毒的臨床檢測(cè)及豬嵴病毒的遺傳進(jìn)化分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(8):1292-1303.

Meng L, Tao J, Li BQ, et al. Clinical detection of seven porcine diarrhea-associated viruses and evolution analysis of porcine kobuvirus. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1292-1303.

為了解引起豬腹瀉疫病的病毒性病原種類及感染現(xiàn)狀，本研究首先針對(duì) 7種報(bào)道較少但可引起豬腹瀉的病毒性病原建立了多重RT-PCR檢測(cè)方法，包括豬捷申病毒 (PTV)、豬薩佩羅病毒 (PSV)、豬丁型冠狀病毒 (PDCoV)、豬嵴病毒 (PKV)、豬札幌病毒 (PSaV)、豬星狀病毒 (PAstV)和豬環(huán)曲病毒 (PToV)。利用該方法對(duì)419份臨床腹瀉糞便樣品進(jìn)行篩檢，結(jié)果顯示PKV檢出率最高，陽(yáng)性率達(dá)26.98%–45.79%；PKV和其他病原混合感染率達(dá)9.52%–18.54%?；赑KV的高檢出率及其可能在豬腹瀉疾病中發(fā)揮的作用，本試驗(yàn)進(jìn)一步選取3個(gè)PKV陽(yáng)性樣品進(jìn)行全基因組序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，這3個(gè)陽(yáng)性樣品PKV均歸屬于豬嵴病毒屬，且與其他動(dòng)物嵴病毒遺傳距離較遠(yuǎn)，分別標(biāo)記為CM-PKV、JS-PKV和PD-PKV；它們的全基因組同源性為88.1%–89.1%；CM-PKV與2013年報(bào)道的中國(guó)株JS-02a-CHN/2013同源性最高，而JS-PKV和PD-PKV則與2008年報(bào)道的匈牙利株K-30-HUN/2008/HUN同源性最高。表明上海不同地區(qū)豬群中存在的PKV有明顯的遺傳差異，但毒株遺傳特性的差異與其致病力的相關(guān)性需進(jìn)一步研究。本研究為深入了解PKV的流行現(xiàn)狀及探討其在豬腹瀉疫情中的作用提供了參考。

多重RT-PCR，豬嵴病毒，全基因組序列，遺傳進(jìn)化分析

近年來(lái)，豬腹瀉病的流行越來(lái)越廣，且疾病的復(fù)雜程度日益增加，給我國(guó)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒 (Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和豬輪狀病毒 (Porcine rotavirus, PoRV) 是引起豬腹瀉的三種重要的病毒性病原[1]。但近年來(lái)不斷報(bào)道有新的腹瀉病原出現(xiàn)，導(dǎo)致豬腹瀉病原復(fù)雜化，疾病防控難度增加。蘭道亮等[2]報(bào)道華東地區(qū)豬群中豬薩佩羅病毒 (Porcine sapelovirus,PSV) 平均陽(yáng)性率達(dá) 17.2%。蔡雨涵等[3]報(bào)道湖北、湖南、河南省各大豬場(chǎng)中豬博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV) 的陽(yáng)性率達(dá)73.95%。劉玲玲等[4]利用RT-PCR方法對(duì)江西省地區(qū)腹瀉糞便檢測(cè)，結(jié)果顯示腹瀉樣本中豬丁型冠狀病毒 (Porcine deltacoronavirus, PDCoV) 的檢出率為31.33%。Xiao等[5]檢測(cè)湖南豬場(chǎng)中豬星狀病毒 (Porcine astrovirus, PAstV) 感染率達(dá)11.5%。豬嵴病毒 (Porcine kobuvirus, PKV) 也廣泛存在于豬群中，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為胃腸炎，因此容易與TGEV相混淆，從而導(dǎo)致所謂的“疫苗使用效果不佳”[6]。所以，開(kāi)展豬病毒性腹瀉病原調(diào)查十分必要，有助于對(duì)豬腹瀉病的針對(duì)性治療。

豬嵴病毒是小RNA病毒科嵴病毒屬成員，該病毒于 2007年首次在匈牙利健康豬腹瀉糞便樣品中發(fā)現(xiàn)。PKV主要危害3周齡以下的仔豬，可引起仔豬胃腸炎，出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，甚至死亡[7]。PKV呈地方性流行，中國(guó)、泰國(guó)、韓國(guó)、日本、新西蘭及巴西等[8-13]均有PKV感染的相關(guān)報(bào)道。PKV與其他病毒混合感染現(xiàn)象也較普遍[14]，不僅會(huì)促進(jìn)仔豬腹瀉疾病的發(fā)生，同時(shí)還會(huì)加重病情，其感染也不僅僅局限于腸道，還可以侵入血液并造成病毒血癥。國(guó)內(nèi)從2009年開(kāi)始PKV陽(yáng)性檢出率呈逐年遞增的趨勢(shì)。很多學(xué)者推斷PKV和目前的豬腹瀉有著很大的關(guān)系，但也有報(bào)道指出PKV在無(wú)腹瀉癥狀豬群中的陽(yáng)性率比腹瀉癥狀豬群還要高[15]。因此，對(duì)豬群中PKV監(jiān)測(cè)并進(jìn)一步了解其致病特性和遺傳規(guī)律具有重要意義。

本研究首先建立了針對(duì)7種報(bào)道較少的豬病毒性腹瀉相關(guān)病原的多重RT-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，明確了上海地區(qū)PKV的感染率及其混合感染情況；進(jìn)一步測(cè)定了不同豬場(chǎng)來(lái)源的PKV毒株的全基因組序列，并分析其遺傳進(jìn)化規(guī)律，為后續(xù)深入研究PKV的致病性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及病料樣品采集

PEDV、TGEV、豬瘟病毒 (Classical swine fever virus, CSFV)、豬源牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV) 均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離保存。

419份糞便樣品采自上海及周邊豬場(chǎng)中有腹瀉癥狀的豬。

1.1.2 主要試劑和儀器

100 bp DNA ladder marker、pMD-18 T 載體、rTaq DNA聚合酶、TRIzol、M-MLV (RNase H-)、dNTPs均購(gòu)自 TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Tiangen公司；DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

主要儀器包括梯度PCR儀 (ABI)、低溫臺(tái)式高速離心機(jī) (Beckman)、渦旋振蕩儀 (Vision)、凝膠成像分析系統(tǒng) (Bio-Rad)、Q5000蛋白核酸測(cè)定儀等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[2-6]，根據(jù)GenBank中已有PKV(EU787450、KT892971、JX401523、KM977675)、PAstV (JX556692、KU764486、JX556693、JX556691)、PSaV (KT922089、FJ387164、KT922087、KF204570)、PDCoV (KJ769231、KR265865、KT021234、KX022605)、PToV(GU196786、JQ740195、FJ555569)、PTV(AF231767、AF296096、GU446660、JQ664746、AJ516011)、PSV (HQ875059、KJ821020、KJ821021) 全基因組序列，通過(guò)比較其保守區(qū)域，利用Oligo7.37軟件分別針對(duì)PTV 3D基因、PKV 3D基因、PDCoV M基因、PSV 5′UTR基因、PSaV ORF1基因、PAstV ORF2基因、PToV S基因設(shè)計(jì)7對(duì)特異性檢測(cè)引物 (表1)。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

1.2.2 樣品處理與RNA提取

采集的糞便溶于適量 PBS中，反復(fù)凍融2次，12 000 r/min離心2 min，吸取250 μL上層樣品進(jìn)行總RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

表1 豬7種病毒性腹瀉病原的多重PCR引物序列Table 1 Multiplex PCR primers of the seven porcine diarrhea-associated viruses

1.2.3 多重RT-PCR的建立與優(yōu)化

以 cDNA為模板，分別利用相對(duì)應(yīng)的病原檢測(cè)引物進(jìn)行單一RT-PCR擴(kuò)增，并克隆各目的片段，測(cè)序鑒定，制備陽(yáng)性質(zhì)粒模板。

進(jìn)一步將 7種分別含有特定病原基因片段的質(zhì)粒的混合物作為模板，進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，包括最佳退火溫度、引物濃度、多重RT-PCR特異性和靈敏性等。

1.2.4 臨床樣品檢測(cè)

用建立的多重RT-PCR方法對(duì)臨床419份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 全基因組序列的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]，合成8對(duì)PKV全基因組擴(kuò)增引物，選取3例陽(yáng)性樣本分別進(jìn)行基因組序列的測(cè)定，得到3株P(guān)KV全基因組。其中5′末端序列利用5′ RACE kit測(cè)定。每個(gè)片段送樣3份，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 序列分析

應(yīng)用Lasergene分析軟件對(duì)各測(cè)定片段進(jìn)行拼接，獲得PKV全基因組序列并進(jìn)行分析，利用MEGA6.0軟件制作進(jìn)化樹分析其親緣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性質(zhì)粒的克隆和鑒定

分別利用 7種腹瀉病原的檢測(cè)引物，對(duì)臨床采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得擴(kuò)增出陽(yáng)性目的片段的樣品 (圖 1)。進(jìn)一步回收各目的片段，利用 pEASY-T1 Simple Cloning Kit進(jìn)行“TA”連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α。通過(guò)菌液PCR方法鑒定，獲得疑似陽(yáng)性質(zhì)粒 pEASY-PTV/3D、pEASY-PKV/3D、pEASY-PDCoV/M、pEASYPSV/5′UTR、pEASY-PSaV/ORF1、pEASY-PAstV/ORF2、pEASY-PToV/S。測(cè)序證實(shí)，各片段均與相應(yīng)的腹瀉病原序列吻合，獲得正確的陽(yáng)性質(zhì)粒。

圖1 豬7種病毒性腹瀉病原的目的片段擴(kuò)增Fig. 1 Specific fragments amplification of the seven porcine diarrhea-associated viruses. M: 100 bp DNA marker; 1: PTV 3D fragment; 2: PAstV ORF2 fragment;3: PKV 3D fragment; 4: PSaV ORF1 fragment; 5:PToV S fragment; 6: PDCoV M fragment; 7: PSV 5′UTR fragment.

2.2 多重PCR的建立

將 7種陽(yáng)性質(zhì)粒模板逐漸增加，依次進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，最終建立了7重RT-PCR方法 (圖 2)，7個(gè)目的片段大小依次為 624 bp、504 bp、421 bp、340 bp、280 bp、249 bp 和176 bp，大小正確，條帶特異。進(jìn)一步優(yōu)化退火溫度，如圖3所示，退火溫度為52 ℃、55 ℃、58 ℃和61 ℃時(shí)，7重PCR均能擴(kuò)增成功；其中，當(dāng)退火溫度為58 ℃時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶最清晰。

2.3 多重RT-PCR特異性和靈敏性的鑒定

2.3.1 特異性試驗(yàn)

用建立的多重 RT-PCR方法檢測(cè) PEDV、TGEV、CSFV、BVDV、SIV，結(jié)果如圖4所示，沒(méi)有擴(kuò)增出片段；而以含有PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV特異性目的片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行多重 RT-PCR，擴(kuò)增出了7條特異的目的片段；證實(shí)該方法特異性較好(圖 4)。

圖2 多重RT-PCR的建立Fig. 2 Development of the multiplex RT-PCR. M:100 bp DNA marker; 1: multiplex RT-PCR for PTV and PSV; 2: multiplex PCR for PTV, PDCoV and PSV; 3:multiplex RT-PCR for PTV, PToV, PDCoV and PSV; 4:multiplex RT-PCR for PTV, PSaV, PToV, PDCoV and PSV; 5: multiplex RT-PCR for PTV, PKV, PSaV, PToV,PDCoV and PSV; 6: multiplex RT-PCR for PTV, PAstV,PKV, PSaV, PToV, PDCoV and PSV; M: marker.

圖3 多重RT-PCR的退火溫度篩選Fig. 3 Temperature screening of the multiplex RT-PCR.1–4: Tm52 ℃, 55 ℃, 58 ℃ and 61 ℃; M: marker.

2.3.2 靈敏性試驗(yàn)

分別以7個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒模板10倍倍比稀釋后，進(jìn)行多重PCR，檢測(cè)其靈敏性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)質(zhì)粒稀釋至10–5倍時(shí)，多重PCR條帶很淺。因此，我們判定該多重 PCR方法可檢測(cè) PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV和PToV的質(zhì)粒最低檢測(cè)限量分別為 5.0×104、5.5×104、6.0×104、6.0×104、3.8×104、6.1×104和 6.9×104copies/μL，對(duì)應(yīng)的最低核酸檢測(cè)濃度分別為 0.32、0.36、0.41、0.41、0.18、0.39 和 0.43 μg/L (圖 4)。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用多重 RT-PCR對(duì)同一陽(yáng)性模板進(jìn)行檢測(cè)，5次試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均一致，表明本方法的重復(fù)性較好。

圖4 多重RT-PCR特異性和靈敏性鑒定Fig. 4 Specificity and sensitivity of the multiplex RT-PCR. M: 100 bp DNA ladder; 1: multiplex RT-PCR used PTV, PKV, PDCoV, PSV, PSaV, PAstV and PToV as the templates; 2: multiplex RT-PCR used PEDV as the template; 3: multiplex RT-PCR used TGEV as the template; 4: multiplex RT-PCR used BVDV as the template; 5: multiplex RT-PCR used CSFV as the template; 6: multiplex RT-PCR used SIV as the template; 7-12: sensitivity detection of the multiplex RT-PCR with the plasmids of 10-1-10-6.

2.4 多重RT-PCR與單項(xiàng)RT-PCR臨床檢測(cè)結(jié)果的比較

利用建立的多重 RT-PCR方法對(duì)上海地區(qū)采集的419份臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2，其中PKV的感染率最高，2015和2016年分別為26.98%和45.79%。2種以上病原混合感染率較高，其中PKV和其他病原的混合感染率達(dá)9.52% (2015年)、18.54% (2016年)。與用單一RT-PCR檢測(cè)7種腹瀉相關(guān)病原結(jié)果的符合率均為 100%，表明該方法能夠快速準(zhǔn)確地篩檢出這7種腹瀉相關(guān)病原的混合感染病例。

2.5 PKV全基因組序列的測(cè)定

選擇來(lái)源于不同豬場(chǎng)的PKV陽(yáng)性樣品3例，進(jìn)行PKV全基因組序列的測(cè)定，如圖5所示，共有 11個(gè)目的片段，大小正確且特異。利用Lasergene和Cluster X軟件拼接，獲得3株P(guān)KV全基因組序列，分別編號(hào)為 PD-PKV、JS-PKV和CM-PKV。PD-PKV、JS-PKV和CM-PKV全長(zhǎng)分別為8 054 bp、8 053 bp和8 057 bp，均包含 5′UTR、3′UTR 和一個(gè)大的 ORF。PD-PKV和 JS-PKV編碼一個(gè) 2 459 aa的多聚蛋白，CM-PKV編碼2 460 aa的多聚蛋白。

表2 2015-2016年豬病毒性腹瀉病原的陽(yáng)性檢出率Table 2 Infection rate of the porcine diarrhea-associated viruses during 2015 to 2016

圖5 PKV全基因組PCR擴(kuò)增Fig. 5 PCR amplification of the complete genomic sequence of PKV.

2.6 全基因組遺傳進(jìn)化分析

從GenBank中選取不同地區(qū)、年代、種屬的嵴病毒全基因組序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建全基因組進(jìn)化樹，具體參考毒株見(jiàn)表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn) (圖6)，JS-PKV、PD-PKV和JS-PKV均歸屬于豬嵴病毒，分別與中國(guó)北京株 JS-2010a PDPKV、中國(guó)甘肅株 K-4/2012/CH、中國(guó)江蘇株 JS-01-CHN/2013/China的親緣性最近，與其他動(dòng)物嵴病毒遺傳距離較遠(yuǎn)。

表3 全基因組進(jìn)化樹參考毒株Table 3 Reference strains of the phylogenetic tree based on the complete genomic sequences

圖6 PKV全基因組進(jìn)化樹分析Fig. 6 Phylogenetic tree based on the complete genomic sequences of PKV.

這3株P(guān)KV的全基因組序列同源性為88.1%-89.1% (圖 7)，CM-PKV 和中國(guó)株 JS-02a-CHN/2013/China同源性最高 (89.5%)，而JS-PKV和 PD-PKV則與匈牙利株 K-30-KUN/2008/HUN的同源性最高 (89.6%)，說(shuō)明近年來(lái)不同國(guó)家流行的豬嵴病毒之間存在著一定的相似性。

2.7 VP1基因的遺傳進(jìn)化分析

VP1是PKV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有較大變異性。通過(guò)構(gòu)建VP1基因的進(jìn)化樹 (圖8)，我們發(fā)現(xiàn)雖然JS-PKV、PD-PKV和CM-PKV處于不同分支，但它們均與日本株的親緣性最近；JS-PKV、CM-PKV分別與 2007年日本報(bào)道的CMP03/07株、CMP17/07-THA株處于同一分支，而PD-PKV與2009年日本報(bào)道的T247/2009/JP株處于同一分支。說(shuō)明本試驗(yàn)中的3株P(guān)KV很有可能是由日本株變異而來(lái)。

圖7 PKV全基因組序列的同源性比對(duì)Fig. 7 Identity analyzation of the complete genomic sequences of PKV.

圖8 VP1基因的進(jìn)化樹分析Fig. 8 Phylogenetic tree based on the VP1 genes.

3 討論

近年來(lái)，豬病毒性腹瀉流行甚廣，對(duì)引起腹瀉病原的診斷、檢測(cè)技術(shù)也有很多報(bào)道。特別是多病原檢測(cè)方法研究較多。目前，關(guān)于 PEDV、TGEV和PoRV等腹瀉病原的多重RT-PCR方法較多[1,17-21]，且多是3重RT-PCR或4重RT-PCR。本研究首次建立了可同時(shí)檢測(cè) 7種豬病毒性腹瀉病原的多重 RT-PCR方法。該方法特異性較好，只可特異性擴(kuò)增出 PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV和PToV的條帶，不會(huì)出現(xiàn)其他病毒性腹瀉病原的交叉擴(kuò)增現(xiàn)象；最低核酸檢測(cè)濃度分別為0.32、0.36、0.41、0.18、0.39和0.43 μg/L，與已有多重 RT-PCR方法[22-26]相比，靈敏性較高。利用該方法對(duì)臨床腹瀉樣品進(jìn)行篩檢，共檢出PKV陽(yáng)性樣品180例、PTV和PDCoV陽(yáng)性各25例、PToV陽(yáng)性10例、PAstV陽(yáng)性108例、PSV陽(yáng)性75例；PKV和其他病原混合感染 72例。測(cè)序證實(shí)PCR檢測(cè)正確。說(shuō)明本研究建立的7重RT-PCR方法可適用于臨床大批量樣品的篩查。

鑒于PKV的感染率較高，研究進(jìn)一步選取了 3個(gè)地區(qū)的 PKV毒株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。結(jié)果表明，JS-PKV、PD-PKV和CM-PKV的基因組構(gòu)成符合PKV的基因組結(jié)構(gòu)，依次分為 5′ UTR、一個(gè)大的 ORF和3′ UTR。除 polyA尾巴外，它們的全基因組長(zhǎng)度依次為8 053 bp、8 054 bp和 8 057 bp；G+C百分含量依次為52.07%、52.04%和52.09%；A+T百分含量依次為 47.93%、47.96%和 47.91%。它們的全基因組同源性不高，僅達(dá) 88.1%–89.1%，說(shuō)明上海不同地區(qū)流行的PKV毒株之間存在著一定的變異。與參考毒株相比，JS-PKV和 PD-PKV與匈牙利株K-30-KUN/2008/HUN的同源性最高，達(dá)89.6%；CM-PKV和中國(guó)株JS-02a-CHN/2013/China同源性最高，達(dá) 89.5%。全基因組進(jìn)化樹表明，這3株P(guān)KV均與中國(guó)株的親緣性最近；但VP1基因進(jìn)化樹表明，它們與日本株P(guān)KV的親緣性最近。由此推測(cè)，近年來(lái)我國(guó)流行的PKV和日本株P(guān)KV之間有著一定的相似性，很有可能是從日本株變異而來(lái)。后續(xù)我們將開(kāi)展這3株P(guān)KV的致病性及其在腹瀉疾病中的作用研究。

REFERENCES:

[1] Ogawa H, Taira O, Hirai T, et al. Multiplex PCR and multiplex RT-PCR inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiplex infections. J Virol Methods, 2009,160(1/2): 210–214.

[2] Lan DL, Ji WH, Wang CS, et al. Molecular epidemiology investigation of porcine sapelovirus in pigs in East China. Prog Vet Med, 2012, 33(12):116–121 (in Chinese).蘭道亮, 吉文匯, 王長(zhǎng)松, 等. 華東部分地區(qū)豬群中豬薩佩羅病毒分子流行病學(xué)調(diào)查. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(12): 116–121.

[3] Cai YH, Zhu L, Zhou YC, et al. Development and application of the duplex PCR for detection of porcine bocavirus. Chin Vet Sci, 2013, 43(8):833–838 (in Chinese).蔡雨涵, 朱玲, 周遠(yuǎn)成, 等. 豬博卡病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2013, 43(8): 833–838.

[4] Liu LL, Cao BB, Zhang LW, et al. Establishment and preliminary application of duplex RT-PCR for detection of emerging porcine deltacoronavirus and porcine transmissible gastroenteritis virus. J Agricul Biotechnol, 2016, 24(12): 1955–1963 (in Chinese).劉玲玲, 曹貝貝, 張利衛(wèi), 等. 新發(fā) PDCoV 和TGEV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 24(12): 1955–1963.

[5] Xiao CT, Luo Z, Lv SL, et al. Identification and characterization of multiple porcine astrovirus genotypes in Hunan province, China. Arch Virol,2017, 162(4): 943–952.

[6] Jackova A, Sliz I, Mandelik R, et al. Porcine kobuvirus 1 in healthy and diarrheic pigs: Genetic detection and characterization of virus and co-infection with rotavirus A. Infect Genet Evol,2017, 49: 73–77.

[7] Jin WJ, Yang Z, Zhao ZP, et al. Genetic characterization of porcine kobuvirus variants identified from heathy pigs in China. Infect Genet Evol, 2015, 35: 89–95.

[8] Yu JM, Jin M, Zhang Q, et al. Candidate porcine kobuvirus, China. Emerg Infect Dis, 2009, 15(5):823–825.

[9] Wang C, Lan D, Hua X. Porcine kobuvirus from pig stool specimens in Shanghai, China. Virus Genes, 2011, 43(3): 350–352.

[10] Khamrin P, Maneekarn N, Kongkaew A, et al.Porcine kobuvirus in piglets, Thailand. Emerg Infect Dis, 2009, 15(12): 2075–2076.

[11] Park SJ, Kim HK, Moon HJ, et al. Molecular detection of porcine kobuvirus in pigs in Korea and their association with diarrhea. Arch Virol,2010, 155(11): 1803–1811.

[12] Khamrin P, Maneekarn N, Hidaka S, et al.Molecular detection of kobuvirus sequences in stool samples collected from heathy pigs in Japan.Infect Genet Evol, 2010, 10(7): 950–954.

[13] Barry AF, Ribeiro J, Alfieri AF, et al. First detection of kobuvirus in farm animals in Brazil and the Netherlands. Infect Genet Evol, 2011,11(7): 1811–1814.

[14] Zhao ZP, Yang Z, Lin WD, et al. The rate of co-infection for piglet diarrhea viruses in China and the genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus and porcine kobuvirus.Acta Virol, 2016, 60(1): 55–61

[15] Phan NT, Trinh QD, Khamrin P, et al. Sequence analysis of the capsid gene of Aichi viruses detected from Japan, Bangladesh, Thailand, and Vietnam. J Medical Virol, 2008, 80(7): 1222–1227.

[16] Peng Q, Song D, Huang D, et al. Complete genome sequence of a porcine kobuvirus variant strain from Jiangxi, China. Genome Announc,2017, 5(5): pii: e01580-16.

[17] Ben Salem AN, Chupin Sergei A, Bjadovskaya Olga P, et al. Multiplex nested RT-PCR for the detection of porcine enteric viruses. J Virol Methods, 2010, 165(2): 283–293.

[18] Zhao J, Shi BJ, Huang XG, et al. A multiplex RT-PCR assay for rapid and differential diagnosis of four porcine diarrhea associated viruses in field samples from pig farms in East China from 2010 to 2012. J Virol Methods, 2013, 194(1/2): 107–112.

[19] Song DS, Kang BK, Oh JS, et al. Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus,transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus. J Vet Diagn Invest, 2006, 18(3):278–281.

[20] Ren YP, Zhang B, Tang C, et al. Development and application of a multiplex RT-PCR for detecting PEDV, TGEV and PDCoV. Chin Vet Sci, 2016,46(6): 756–762 (in Chinese).任玉鵬, 張斌, 湯承, 等. 同時(shí)檢測(cè) PEDV 和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2016, 46(6): 756–762.

[21] Xiong NN, Tao J, Zhang QZ, et al. Establishment and application of the multiplex PCR for detection of four porcine viral diarrhea viruses.Chin J Vet Sci, 2016, 46(8): 972–978 (in Chinese).熊年年, 陶潔, 張清真, 等. 豬四種病毒性腹瀉病原多重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用. 中國(guó)醫(yī)科學(xué), 2016, 46(8): 972–978.

[22] Li LM, Zhu WX, Wang XB, et al. Establishment and application of a multiplex reverse transcription-PCR for detecting porcine epidemic diarrhea virus, porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine group A rotavirus. Chin J Vet Sci,2016, 36(2): 216–220 (in Chinese).李麗敏, 朱衛(wèi)霞, 王曉波, 等. 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬A型輪狀病毒多重R-PCR方法的建立及其應(yīng)用. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016, 36(2): 216–220.

[23] Long FX, Shi KC, Zhang Z, et al. Establishment and application of a multiplex RT-PCR assay for detection of PEDV, TGEV and PRoV. Chin Anim Husb & Vet Med, 2016, 43(10): 2518–2526 (in Chinese).龍飛翔, 施開(kāi)創(chuàng), 張珍, 等. PEDV、TGEV 和PRoV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2016, 43(10): 2518–2526.

[24] Yang WY, Zhou YC, Han Y, et al. Establishment and clinical application of a multiplex reverse transcription-PCR for simultaneous detection of porcine group A rotavirus, porcine group C rotavirus and porcine astrovirus. Chin Vet Sci,2014, 44(4): 394–400 (in Chinese).楊文宇, 周遠(yuǎn)成, 韓燕, 等. 豬A群輪狀病毒和C群輪狀病毒以及豬星狀病毒多重 RT-PCR同時(shí)檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2014,44(4): 394–400.

[25] Gu F, Zhou YC, Huang JB, et al. Establishment and clinical application of a multiplex RT-PCR for detection of porcine kobuvirus, porcine astrovirus and porcine torovirus. Chin Vet Sci, 2015, 45(7):661–667 (in Chinese).顧凡, 周遠(yuǎn)成, 黃劍波, 等. 豬嵴病毒和豬星狀病毒及豬環(huán)曲病毒多重 RT-PCR檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2015, 45(7):661–667.

[26] Xu YD, Zhang QX, Li JL, et al. Establishment and application of multiple RT-PCR method for diagnosis of PEDV, TGEV and RV infection. Chin J Vet Drug, 2014, 48(11):10–13 (in Chinese).徐引弟, 張青嫻, 李建林, 等. PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用. 中國(guó)獸藥雜志, 2014, 48(11): 10–13.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Clinical detection of seven porcine diarrhea-associated viruses and evolution analysis of porcine kobuvirus

Li Meng1,2, Jie Tao1, Benqiang Li1, Yufei Ma1,2, Jinghua Cheng1, Chunling Zhang1,and Huili Liu1

1 Shanghai Engineering Research Center for Breeding Pigs, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China 2 College of Fisheries and Life Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China

In order to analyze the epidemic situation of porcine viral diarrhea-associated diseases, a multiplex RT-PCR method was developed for detection of Seven diarrhea-associated viruses, including porcine teschovirus (PTV), porcine sapelovirus(PSV), porcine deltacoronavirus (PDCOV), porcine kobuvirus (PKV), porcine sapovirus (POSAV), porcine astrovirus (PASTV)and porcine torovirus (PTOV). A total of 419 samples were screened using the method, the results showed that PKV has the highest positive rate of 26.98%–45.79% and the mixed infection rate of PKV with others viruses were 9.52%–18.54%. On account of high positive rate of PKV and its potential important role in diarrhea disease, complete genome sequences of three PKV positive samples were further sequenced and genetic evolution were established. Sequences analysis indicated that three PKV-positive samples, designated as PD-PKV, JS-PKV and CM-PKV, respectively, were classified into the porcine kobuvirus genus. The genomic homologies of three viruses were 88.1%–89.1%. CM-PKV had the highest homology with a kobuvirus JS-02a-CHN/2013 reported in 2013, while JS-PKV and PD-PKV were most closed to a kobuvirusv K-30-HUN/2008/HUN reported in Hungary in 2008. This illustrated the significant genetic differences were existed among the PKV isolates in Shanghai.The relationship between the difference among the PKV isolates and the viral pathogenicity still needs to be explored. This research provides references for understanding the prevalence of PKV and its role in swine diarrhea disease.

multiplex RT-PCR, porcine kobuvirus, complete genomic sequences, evolution analysis

March 24, 2017; Accepted: May 10, 2017

Huili Liu. Tel: +86-21-62202473; E-mail: huilil@163.com

Supported by: Shanghai Agricultural Committee Key Project (Nos. 2013-5-5, 2013-3-6), Pig Industry Project of Shanghai Municipal(No. 2016-6).

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 (Nos. 2013-5-5，2013-3-6)，上海市生豬產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目 (No. 2016-6) 資助。

時(shí)間：2017-07-03

：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170705.1051.004.html