王曉雪，李紅杰，李永濤，高冬生，陳陸，常洪濤，劉紅英，王川慶，趙軍

河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002

豬流行性腹瀉病毒nsp1對Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響

王曉雪，李紅杰，李永濤，高冬生，陳陸，常洪濤，劉紅英，王川慶，趙軍

河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002

王曉雪, 李紅杰, 李永濤, 等. 豬流行性腹瀉病毒nsp1對Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(8): 1325-1334.

Wang XX, Li HJ, Li YT, et al. Effect of porcine epidemic diarrhea virus nsp1 on type I interferon response. Chin J Biotech,2017, 33(8): 1325-1334.

豬流行性腹瀉病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干擾素及其誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒免疫應(yīng)答，但是PEDV抑制Ⅰ型干擾素應(yīng)答的分子機(jī)制尚不明了，尤其是PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白 (Nonstructural proteins，nsps) 在Ⅰ型干擾素應(yīng)答中的調(diào)控作用研究不多。為研究PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白1 (nsp1) 對細(xì)胞Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCAGGS-nsp1，采用Western blotting和間接免疫熒光試驗(yàn)確定nsp1在細(xì)胞中的表達(dá)。通過報(bào)告基因法、ELISA以及病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)評估nsp1對Ⅰ型IFN的影響。結(jié)果顯示，nsp1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞中均高效表達(dá)。雙熒光報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果表明，nsp1能顯著抑制 IFN-β啟動(dòng)子活性，且具有劑量依賴性。ELISA結(jié)果顯示，nsp1能顯著抑制IFN-β蛋白的表達(dá)。水泡性口炎病毒 (VSV) 復(fù)制抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，nsp1明顯抑制poly(I:C)介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。結(jié)果提示，nsp1作為PEDV的保守蛋白，具有拮抗Ⅰ型干擾素啟動(dòng)子活性和應(yīng)答的功能，為揭示PEDV逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的機(jī)制和研發(fā)新型高效抗PEDV疫苗奠定基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒，非結(jié)構(gòu)蛋白1，Ⅰ型干擾素

豬流行性腹瀉 (Porcine epidemic diarrhea,PED) 是由豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV) 引起的一種急性、高度傳染性的腸道疾病，以感染豬嘔吐、脫水和水樣腹瀉以及仔豬的高死亡率為主要特征[1]。PED在中國的流行于 1984年得到證實(shí)，隨后由于滅活苗的廣泛使用使疫情得到有效控制[2-4]。2010年下半年以來，PEDV再次在中國大規(guī)模暴發(fā)，此次流行對 2周齡以內(nèi)的哺乳仔豬影響較大，死亡率可高達(dá) 100%，感染仔豬發(fā)病急，腹瀉 3–4 d后嚴(yán)重脫水死亡[5-6]。2013年美國歷史上也首次暴發(fā) PED，并很快蔓延至其他的北美國家[7-8]，PED的流行已經(jīng)對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。

PEDV屬于冠狀病毒科 (Coronaviridae) α冠狀病毒屬 (α-CoV) 的成員，為單股正鏈RNA病毒，5′端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，3′端有一個(gè)poly(A)尾。病毒基因組全長28 kb，包含ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M 和 N等 7個(gè)開放閱讀框。ORF1a編碼復(fù)制酶多聚蛋白 (Polyprotein) PPla，ORF1b編碼的是一個(gè)融合蛋白PPla/b，融合蛋白包含16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (Nsps)，從nsp1到nsp16，這些非結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)病毒蛋白酶酶切后，參與病毒 RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[9-11]。

α-CoV的nsp1編碼約110個(gè)氨基酸，為PPla蛋白N端的剪切產(chǎn)物，是宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的第一個(gè)成熟的病毒蛋白。在冠狀病毒的 4個(gè)種屬中，α-CoV和β-CoV編碼有nsp1，而γ-CoV和δ-CoV僅編碼除 nsp1外的 15個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (nsp2–nsp16)[12]，并且α-CoV和β-CoV兩個(gè)種屬的nsp1也沒有非常相似的序列同源性[13]，所以 nsp1可以被認(rèn)為是種屬特異性基因[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，鼠肝炎病毒的 nsp1截短后，在細(xì)胞上的增殖與野生株類似，但是在小鼠體內(nèi)的增殖明顯受到了抑制[14]。另外，將豬傳染性胃腸炎病毒的 nsp1與nsp2切割位置的堿基突變阻止了nsp1的釋放后，病毒的生存能力顯著降低[15]。這些結(jié)果均提示nsp1可能是病毒的毒力因子之一。近幾年，nsp1對宿主基因表達(dá)和在病毒逃避宿主天然免疫應(yīng)答當(dāng)中的調(diào)控作用備受關(guān)注。有研究顯示，與PEDV nsp1有較高氨基酸序列同源性的人冠狀病毒NL63和229E的nsp1，能顯著抑制IFN-β、干擾素刺激基因 15 (ISG15) 和攜帶有干擾素刺激反應(yīng)元件 (ISRE) 的報(bào)告基因的表達(dá)[14,16]。另外，SARS冠狀病毒 (SARS-CoV) 的nsp1能夠抑制多種宿主基因 mRNA的表達(dá)，包括參與天然免疫中的Ⅰ型干擾素的表達(dá)[17]。

為了研究 PEDV nsp1對宿主天然免疫應(yīng)答的調(diào)控功能，本研究克隆和表達(dá)了 PEDV nsp1基因，利用Western blotting、間接免疫熒光試驗(yàn)、雙熒光素酶報(bào)告基因法及豬水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) 復(fù)制抑制試驗(yàn)研究nsp1對Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞和主要試劑

PEDV流行株 CH/ZMDZY/11(GenBank登錄號：KC196276)、帶有綠色熒光標(biāo)記的豬水泡性口炎病毒 (VSV-GFP)、pET-28a(+) 原核表達(dá)載體、帶有HA標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCAGGS、含有熒光素酶基因的 IFN-β啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒(IFN-β-luc)，以及含有海腎熒光素酶的pRL-TK內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒、HEK-293T、A549和Vero細(xì)胞，均由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。DH5α和BL21(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。人IFN-β ELISA檢測試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司。

限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ、EcoRⅠ和 XhoⅠ購自寶生物工程 (大連) 有限公司。HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。FITC-羊抗兔IgG和DAPI購自武漢博士德生物工程有限公司。poly(I:C)購自 Sigma公司。Dual-Luciferase reporter assay system購自Promega公司。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室分離和保存的 PEDV河南流行株 CH/ZMDZY/11序列 (GenBank登錄號：KC196276) 為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)兩對nsp1序列特異性引物。以PEDV CH/ZMDZY/11毒株基因組cDNA為模板，PCR擴(kuò)增nsp1基因，引物對1的上、下游引物分別引入 NcoⅠ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)，序列如下，上游引物：5′-CATGCCATGGGCGCTAGCA ACCAAGTCACATTGG-3′；下游引物：5′-ATACT CGAGACCACCACGACGACCAAAAG-3′，擴(kuò)增出的片段經(jīng) NcoⅠ和 XhoⅠ酶切后克隆入經(jīng)相同酶切的pET-28a(+)載體中。引物對2的上、下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，序列如下，上游引物：5′-AATGAATTCGCTAGCAACCA AGTCACATTGGC-3′；下游引物：5′-ATACTCGAGACCACCACGACGACCAAAAGTG-3′， 擴(kuò) 增出的片段經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后克隆入經(jīng)相同酶切的 pCAGGS-HA載體中。最終獲得重組質(zhì)粒pET-28a-nsp1和pCAGGS-nsp1，經(jīng)酶切和序列測定驗(yàn)證載體序列的正確性。

1.3 Nsp1多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測定

將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pET-28a-nsp1轉(zhuǎn)化入BL21(DE3) 宿主菌中，經(jīng)過異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲裂解表達(dá)菌體，收取上清，參照His標(biāo)簽蛋白鎳柱親和層析純化說明書進(jìn)行重組蛋白的純化，洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。將純化后的nsp1用BCA法進(jìn)行蛋白含量的測定，每只兔子免疫劑量為500 μg，與弗氏佐劑體積比1∶1混合乳化后進(jìn)行背部多點(diǎn)注射免疫。間隔 2周分別進(jìn)行二免和三免，三免10 d后采血，分離血清。用純化的nsp1原核蛋白包被板子，包被量為0.5 μg/孔，將分離得到的抗nsp1陽性及陰性血清分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000等倍數(shù)進(jìn)行稀釋，以HRP-羊抗兔IgG (1∶5 000稀釋) 作為二抗，間接ELISA方法測定nsp1多克隆抗體效價(jià)。

1.4 nsp1真核表達(dá)鑒定

在六孔細(xì)胞板中培養(yǎng) HEK-293T細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層時(shí)轉(zhuǎn)染pCAGGS-nsp1和pCAGGS質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染劑量為2 μg/孔，轉(zhuǎn)染24 h后，分別以兔抗nsp1多克隆抗體和鼠抗GAPDH為一抗，以HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗鼠IgG為二抗，通過 Western blotting來驗(yàn)證 nsp1和內(nèi)參蛋白GAPDH的真核表達(dá)。

1.5 PEDV感染細(xì)胞中nsp1表達(dá)鑒定

在六孔細(xì)胞板中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層時(shí)感染 PEDV流行株 CH/ZMDZY/11，接毒劑量為0.5 MOI (Multiplicity of infection, MOI)，待20 h細(xì)胞病變完全后，通過常規(guī)方法進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定病毒感染細(xì)胞中nsp1的表達(dá)：以兔抗nsp1多克隆抗體 (1∶100稀釋) 為一抗，以FITC-羊抗兔IgG (1∶100稀釋) 為二抗，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.6 雙熒光素酶法驗(yàn)證nsp1對IFN-β啟動(dòng)子活性影響

HEK-293T接種12孔板，待細(xì)胞生長密度達(dá)到 70%左右時(shí)轉(zhuǎn)染 pCAGGS-nsp1質(zhì)粒以及干擾素報(bào)告質(zhì)粒IFN-β-luc和內(nèi)參基因質(zhì)粒pRL-TK，3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量比率為 10∶10∶1，轉(zhuǎn)染總劑量為1.05 μg/孔，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS和報(bào)告質(zhì)粒對照。24 h后再次轉(zhuǎn)染 poly(I:C)(1 μg/孔)，使其作用12 h。然后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒進(jìn)行酶活性測定，結(jié)果取螢火蟲熒光素酶信號值與海腎熒光素酶活性值的比值，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 nsp1不同表達(dá)劑量對IFN-β啟動(dòng)子活性影響

為探究nsp1表達(dá)量對Ⅰ型干擾素啟動(dòng)子活性的影響，將HEK-293T接種12孔板，待細(xì)胞生長密度達(dá)到 70%左右時(shí)，分別將 0.5 μg/孔、1 μg/孔和2 μg/孔3種劑量的pCAGGS-nsp1質(zhì)粒與等劑量的IFN-β-luc (0.5 μg/孔) 和pRL-TK (0.05 μg/孔)共轉(zhuǎn)染，并且同時(shí)設(shè)立pCAGGS (2 μg/孔) 和報(bào)告質(zhì)粒對照組，poly(I:C)刺激12 h后測定螢火蟲熒光素酶信號值與海腎熒光素酶活性值的比值，每個(gè)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8 ELISA檢測IFN-β的表達(dá)水平

將目的質(zhì)粒 pCAGGS-nsp1和空質(zhì)粒pCAGGS分別轉(zhuǎn)染 HEK-293T細(xì)胞 (各1 μg/孔)，24 h后再轉(zhuǎn)染 poly(I:C) (1 μg/孔)，使其作用12 h，收取細(xì)胞上清，用IFN-β定量ELISA試劑盒于450 nm處測定各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣本中IFN-β含量 (pg/mL)。

1.9 VSV病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)

HEK-293T接種12孔板，等細(xì)胞生長密度達(dá)到70%左右，轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒pCAGGS-nsp1，同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pCAGGS對照。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h 后，轉(zhuǎn)染 poly(I:C) (1 μg/孔)，12 h 后將細(xì)胞及培養(yǎng)液混合物反復(fù)凍融3次收取細(xì)胞上清，然后將細(xì)胞上清以 20、2–1、2–2、2–3、2–4、2–5、2–6稀釋后接種于96孔板上培養(yǎng)的A549細(xì)胞，每孔100 μL，作用24 h后，接種VSV-GFP病毒 (100 TCID50/孔)，接毒后16 h，通過熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上所有數(shù)據(jù)均采用雙尾 T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 nsp1基因克隆與載體構(gòu)建

選取GenBank數(shù)據(jù)庫中24株國內(nèi)外代表性PEDV毒株 (包括22株流行毒株和2株疫苗毒株)，通過生物信息學(xué)預(yù)測這些PEDV nsp1基因的開放閱讀框。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，不同地域的PEDV流行毒株與疫苗毒株的nsp1非常保守，氨基酸序列同源性最低為97.2%，最高為 100% (結(jié)果未顯示)。利用所設(shè)計(jì)的 PEDV nsp1基因引物，通過PCR擴(kuò)增出約330 bp的單一片段，與預(yù)期大小相符。提取 pET-28a-nsp1與pCAGGS-nsp1重組質(zhì)粒，對pET-28a-nsp1進(jìn)行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，對pCAGGS-nsp1進(jìn)行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，均獲得了約330 bp左右的目的條帶 (圖 1)。將酶切鑒定正確的表達(dá)載體進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果說明nsp1基因在兩個(gè)載體中的位置插入正確，核酸序列與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 PEDV nsp1蛋白原核表達(dá)、純化及多克隆抗體效價(jià)的測定

將獲得的重組陽性質(zhì)粒 pET-28a-nsp1轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證表達(dá)，并經(jīng)鎳柱純化后得到帶有His標(biāo)簽的 nsp1融合蛋白，相對分子質(zhì)量大小約為12 kDa (圖2)。用純化的重組nsp1免疫小鼠，三免10 d后采血，采用間接ELISA測定抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，三免后多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶64 000 (表 1)。

圖1 PEDV nsp1的克隆與重組質(zhì)粒的鑒定Fig. 1 Cloning of PEDV nsp1 and identification of recombinant plasmids. M: 15 000 bp ladder DNA marker; 1: pCAGGS-nsp1; 2: pCAGGS-nsp1/EcoRⅠ+XhoⅠ; 3: pET-28a-nsp1; 4: pET-28a-nsp1/NcoⅠ+XhoⅠ.

圖2 重組nsp1的表達(dá)及純化Fig. 2 Expression and purification of recombinant nsp1. M: protein marker; 1: whole cell lysates of pET-28a-nsp1/BL21(DE3) uninduced; 2: whole cell lysates of pET-28a-nsp1/BL21(DE3) induced by IPTG;3: solution supernatant from whole cell lysates of pET-28a-nsp1/BL21 (DE3) induced by IPTG; 4:purified nsp1.

2.3 PEDV nsp1真核表達(dá)鑒定

將質(zhì)粒 pCAGGS-nsp1轉(zhuǎn)染 HEK-293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后通過 Western blotting來驗(yàn)證nsp1的真核表達(dá) (以 GAPDH作為內(nèi)參蛋白對照)。結(jié)果顯示，pCAGGS-nsp1轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞24 h后能成功檢測到nsp1的表達(dá) (圖3)。

2.4 PEDV感染細(xì)胞中nsp1蛋白表達(dá)的鑒定

為證明病毒感染細(xì)胞中存在所預(yù)測的nsp1，將PEDV流行株CH/ZMDZY/11感染Vero細(xì)胞，多聚甲醛固定細(xì)胞后，分別用制備的nsp1多抗作為一抗，以FITC-羊抗兔IgG作為二抗。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，病毒在感染細(xì)胞過程中確實(shí)表達(dá)nsp1 (圖4)。

表1 間接ELISA測定抗nsp1多克隆抗體效價(jià)Table 1 ELISA titer of the polyclonal antiserum against nsp1

圖3 nsp1真核表達(dá)鑒定Fig. 3 Identification of nsp1 eukaryotic expression.

圖4 病毒感染細(xì)胞中nsp1蛋白的表達(dá) (100×)Fig. 4 nsp1 expressed in PEDV-infected cells (100×).Mock stands for cells uninfected with PEDV.

2.5 nsp1對IFN-β啟動(dòng)子活性的影響

為探究nsp1對Ⅰ型干擾素應(yīng)答的影響，將pCAGGS-nsp1、IFN-β-luc和 pRL-TK 共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒對照組，24 h后轉(zhuǎn)染 poly(I:C)刺激細(xì)胞。然后裂解細(xì)胞，測定雙熒光素酶活性，最終取螢火蟲熒光素酶信號值與海腎熒光素酶活性值的比值。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染poly(I:C)組和空載體pCAGGS組相比，nsp1能顯著抑制 IFN-β啟動(dòng)子的活性 (P＜0.01)(圖 5)。

2.6 nsp1不同表達(dá)劑量對IFN-β啟動(dòng)子活性影響

為探究不同 nsp1表達(dá)水平對Ⅰ型干擾素的應(yīng)答是否存在差異，將3種不同劑量的pCAGGS-nsp1與IFN-β-luc和pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，比較雙熒光素酶活性的差異。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染poly(I:C)組和空載體pCAGGS組相比，不同轉(zhuǎn)染劑量的 nsp1真核表達(dá)質(zhì)粒均能顯著抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性 (P＜0.01)，并且存在劑量依賴性，隨著pCAGGS-nsp1轉(zhuǎn)染劑量的增加，對Ⅰ型干擾素啟動(dòng)子活性的影響也逐漸增強(qiáng)(圖 6)。

圖5 報(bào)告基因法評價(jià)nsp1對IFN-β啟動(dòng)子活性的影響Fig. 5 Effect of nsp1 on the promoter activity of IFN-β confirmed by dual luciferase reporter assay.

圖6 nsp1表達(dá)水平對IFN-β啟動(dòng)子活性的影響Fig. 6 Effect of nsp1 expression level on the promoter activity of IFN-β.

2.7 nsp1對IFN-β蛋白表達(dá)水平的影響

將 pCAGGS-nsp1和 pCAGGS分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后再轉(zhuǎn)染poly(I:C)，12 h后收取細(xì)胞上清，使用ELISA試劑盒檢測IFN-β蛋白含量。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染 poly(I:C)組和空載體 pCAGGS組相比，轉(zhuǎn)染 pCAGGS-nsp1組的IFN-β水平明顯降低，即nsp1能顯著抑制poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β蛋白水平的表達(dá) (P＜0.01) (圖7)。

2.8 nsp1對poly(I:C)介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的抗病毒作用的影響

由于VSV對Ⅰ型IFN高度敏感，本研究利用表達(dá)GFP的重組VSV進(jìn)行復(fù)制抑制試驗(yàn)來直觀驗(yàn)證nsp1對細(xì)胞Ⅰ型IFN應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示，在未加 poly(I:C)對照組細(xì)胞裂解上清處理的A549細(xì)胞中，VSV-GFP的復(fù)制不受抑制；單獨(dú)添加 poly(I:C)刺激組和空載體 pCAGGS轉(zhuǎn)染+poly(I:C)刺激組細(xì)胞裂解上清處理的A549細(xì)胞中，VSV-GFP重組病毒的復(fù)制均受到不同程度的抑制，而在pCAGGS-nsp1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞裂解上清處理的A549細(xì)胞中，VSV-GFP重組病毒的復(fù)制受抑制程度大大降低，證明nsp1能明顯抑制poly(I:C)介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生和其抗病毒作用 (圖8)。

圖7 ELISA檢測nsp1對IFN-β表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of nsp1 on IFN-β expression detected by ELISA.

圖8 VSV病毒復(fù)制抑制試驗(yàn)Fig. 8 VSV replication-inhibition bioassay. Mock stands for the group without poly (I:C).

3 討論

干擾素和干擾素誘導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原體侵襲的第一道防線[18]。病毒感染期間，為了抵抗干擾素的抗病毒作用，包括冠狀病毒在內(nèi)的許多病毒都進(jìn)化出了復(fù)雜的機(jī)制來逃避宿主的天然免疫，從而建立持續(xù)的感染。目前，已證實(shí)SARS-CoV編碼至少8種蛋白可以作為干擾素的拮抗劑：nsp1、PLP、nsp7、nsp15、N、M、ORF3b和 ORF6[19-20]。研究表明，同屬于冠狀病毒科的 PEDV感染宿主后也能抑制其天然免疫應(yīng)答[21]。研究發(fā)現(xiàn)PEDV可利用多個(gè)蛋白通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑干擾宿主的Ⅰ型IFN應(yīng)答。目前已證明PEDV的N蛋白能夠與TBK1發(fā)生互作，通過阻斷TBK1與下游IRF3的結(jié)合拮抗細(xì)胞的Ⅰ型 IFN應(yīng)答[22]。另外，在PEDV編碼的16個(gè)nsps中，部分nsps對Ⅰ型IFN的拮抗功能及相關(guān)機(jī)制已得到解析[23]。其中，PEDV nsp3編碼的木瓜樣蛋白酶 (PLP2) 作為去泛素化酶將RIG-I和STING去泛素化后失活，從而阻斷該信號通路[24]。PEDV nsp5編碼的3C樣蛋白酶 (3CLpro)能夠通過蛋白水解切割核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NEMO)，從而拮抗細(xì)胞的Ⅰ型IFN應(yīng)答[25]。

本研究在前期克隆和表達(dá)了 PEDV中國流行株CH/ZMDZY/11的nsp1并制備了高效價(jià)的兔抗nsp1多克隆抗體，為了深入研究PEDV的nsp1對Ⅰ型干擾素的影響，我們構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCAGGS-nsp1，并將該載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。通過Western blotting驗(yàn)證了nsp1能夠在293T細(xì)胞中高效表達(dá)。PEDV流行株 CH/ZMDZY/11感染Vero細(xì)胞的間接免疫熒光結(jié)果顯示，PEDV自然感染狀態(tài)下能夠表達(dá)nsp1蛋白。我們通過雙熒光報(bào)告基因法、ELISA試驗(yàn)以及VSV復(fù)制抑制試驗(yàn)等，證明了nsp1能顯著抑制由poly(I:C)介導(dǎo)的 IFN-β的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制Ⅰ型IFN介導(dǎo)的細(xì)胞抗病毒應(yīng)答。

目前預(yù)防 PEDV的主要手段是免疫母豬而使新生仔豬通過被動(dòng)免疫獲得保護(hù)。PEDV現(xiàn)有的商品化疫苗主要是基于CV777毒株的弱毒活疫苗，雖然該疫苗能在一定程度上減緩該病的發(fā)生與發(fā)展，但其免疫保護(hù)效果仍然存在不足[26]。另外，該疫苗對仔豬具有一定致病性。目前，國內(nèi)外研究者正利用所分離的流行毒株進(jìn)行傳代致弱，以期研制相關(guān)疫苗。疫苗毒株的不穩(wěn)定性使得對病毒致病性和動(dòng)物機(jī)體抗病毒作用的機(jī)理的研究尤為重要。本研究證明，PEDV編碼的nsp1能通過與IFN通路中的相關(guān)接頭分子互作來抑制Ⅰ型 IFN的表達(dá)及其抗病毒效應(yīng)，從而來逃避天然免疫的識別和清除。本研究結(jié)果為PED高效疫苗及抗病毒藥物的研發(fā)提供了具體的作用靶點(diǎn)，nsp1可作為潛在的可修飾毒力因子，為發(fā)現(xiàn)新的抗病毒治療藥物靶標(biāo)提供了重要理論基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect of porcine epidemic diarrhea virus nsp1 on type Ⅰinterferon response

Xiaoxue Wang, Hongjie Li, Yongtao Li, Dongsheng Gao, Lu Chen, Hongtao Chang,Hongying Liu, Chuanqing Wang, and Jun Zhao

College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) inhibits the host typeⅠinterferon and cellular antiviral response, but its inhibition mechanism is unclear, and the roles of PEDV nonstructural proteins in regulating typeⅠinterferon responses have been seldom studied. To study the effect of nsp1 on typeⅠinterferon response, nsp1 gene was cloned into a eukaryotic expression vector pCAGGS. The expression of nsp1 in transfected cells was determined by Western blot and indirect immunofluorescence assay. The effects of nsp1 on the induction of typeⅠinterferon were evaluated by dual luciferase reporter gene assay, ELISA and VSV bioassay. Western blot and indirect immunofluorescence assay showed that nsp1 was highly expressed in transfected cells and PEDV-infected cells. Dual luciferase reporter gene assay results indicated that nsp1 strongly inhibited the IFN-β promoter activity, and the inhibitory effect was nsp1 dose-dependent. ELISA results showed that nsp1 significantly inhibited the expression of IFN-β in protein level. And VSV replication-inhibition bioassay revealed that nsp1 significantly inhibited typeⅠIFN antiviral activities induced by poly(I:C). Our results implied that nsp1 was a highly conserved protein of PEDV and exhibited antagonistic function on interferon promoter activity. The results have laid a foundation for further understanding the immune evasion mechanism of PEDV and for developing new effective vaccine against PEDV.

PEDV, nonstructural protein 1, type I interferon

February 24, 2017; Accepted: May 31, 2017

Jun Zhao. Tel/Fax: +86-371-63558529; E-mail: zhaoj@henau.edu.cn

Supported by: Program for Science ＆ Technology Innovation Team in the Universities of Henan Province (No. 14IRTSTHN015), Key Scientific Research Project of Henan Higher Education (No.16A230002), International Cooperation and Exchange Project for Zhengzhou City (No. 153PGJHZ203).

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃 (No. 14IRTSTHN015)，河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 (No. 16A230002)，鄭州市國際合作交流項(xiàng)目 (No. 153PGJHZ203) 資助。

時(shí)間：2017-07-05

：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170705.1420.005.html