李煥，于童，馬洋洋，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)系 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

層粘連蛋白基因家族在豬多能干細(xì)胞中的表達(dá)譜分析

李煥，于童，馬洋洋，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)系 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100

李煥, 于童, 馬洋洋, 等. 層粘連蛋白基因家族在豬多能干細(xì)胞中的表達(dá)譜分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(8): 1304–1314.

Li H, Yu T, Ma YY, et al. Expression of Laminin gene family in porcine pluripotent stem cells. Chin J Biotech, 2017, 33(8):1304–1314.

層粘連蛋白 (Laminin) 是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、運(yùn)動(dòng)、組織修復(fù)和再生等發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12個(gè)編碼基因，以不同的表達(dá)模式發(fā)揮功能。其中Laminin A5作為可以支持多能細(xì)胞生長(zhǎng)的重要基因，得到廣泛研究。但是，在所有豬相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中，均未能查到Laminin A5的信息。文中通過(guò)生物信息學(xué)分析，首次確認(rèn)了豬Laminin A5的存在，并進(jìn)行了克隆和測(cè)序驗(yàn)證。為揭示Laminin基因家族在豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSCs) 中的表達(dá)特性，檢測(cè)了Laminin在豬各組織、體細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的不同表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)Laminin B1基因在豬多能干細(xì)胞中存在特異性可變剪接體 (LAMB1-a)，且該可變剪切體的表達(dá)量與豬多能干細(xì)胞的重編程程度呈正相關(guān)。為進(jìn)一步揭示和利用Laminin作為細(xì)胞外基質(zhì)，用于豬多能干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

豬多能干細(xì)胞，層粘連蛋白，LAMA5，表達(dá)模式分析

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells，iPSCs，iPS細(xì)胞) 可以分化為體內(nèi)各種成體細(xì)胞，進(jìn)而形成機(jī)體各種組織和器官[1]。因此，iPS細(xì)胞的研究不僅具有重要的理論意義，而且在組織再生、修復(fù)和疾病治療方面具有廣泛的價(jià)值。細(xì)胞外基質(zhì) (Extracellular matrix，ECM)是由細(xì)胞合成和分泌的生物大分子，具有支持和連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)等功能[2-3]。有研究表明，特定 ECM 形成的微環(huán)境可以支持iPS細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)體系中添加這類(lèi)ECM對(duì)iPS細(xì)胞的生長(zhǎng)和多能性維持具有關(guān)鍵作用[4]。此外，采用無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，可以避免飼養(yǎng)層細(xì)胞帶來(lái)的外源因素的干擾[2,5]。目前，商品化的ECM包括Matrigel、層粘連蛋白、纖粘連蛋白、膠原等已經(jīng)廣泛應(yīng)用到無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中[6]，部分已被驗(yàn)證有利于人和小鼠iPS細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)[7-8]。豬和人在生理和代謝上具有極高的相似性，是理想的可應(yīng)用于疾病和再生醫(yī)學(xué)研究的模式動(dòng)物[9]，因此，獲得真正的豬iPS細(xì)胞將具有十分重要的意義。豬iPS細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)多參考人和小鼠相關(guān)體系，但獲得的豬 iPS細(xì)胞無(wú)法達(dá)到原始態(tài)(Na?ve state)。因此，探索并發(fā)現(xiàn)適宜的培養(yǎng)體系對(duì)于獲得完全重編程的豬iPSCs有重要意義。

層粘連蛋白家族 (Laminin，LN) 是一類(lèi)參與形成組織細(xì)胞基底膜的重要大分子非膠原性糖蛋白，是 ECM 的重要組成部分[10]。完整的LN蛋白由3種肽鏈 (α、β、γ) 形成十字架樣結(jié)構(gòu)的異源三聚體，其中α鏈有5種亞型，β鏈有4種亞型，γ鏈有3種亞型，分別由不同的基因編碼，發(fā)揮不同的功能。目前，通過(guò)對(duì)小鼠和人層粘連蛋白的研究已確定存在 18種不同的LN組合[11-12]。LN蛋白可以改變細(xì)胞的表型，引導(dǎo)細(xì)胞向不同的方向分化[13]，對(duì)于早期胚胎發(fā)生、各種組織的形成和功能的完善發(fā)揮重要作用[14-15]。其中，LAMA5作為在小鼠和人各組織中廣泛表達(dá)的基因，與其他亞基的特定組合，如 Laminin-511 (由 LAMA5、LAMB1和 LAMC1組成)，可以作為支持人iPS細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵基質(zhì)[16-17]，并且維持其不分化狀態(tài)[18-19]。因此我們推測(cè)，恰當(dāng)?shù)腖N組合也可以對(duì)豬iPS細(xì)胞的分離和建系發(fā)揮作用。然而，豬LAMA5的研究仍未見(jiàn)報(bào)道，甚至在 NCBI和 UCSC相關(guān)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有相關(guān)序列的注釋。

為明確豬iPS細(xì)胞中LN的表達(dá)情況，我們對(duì)豬組織、細(xì)胞和建系iPS細(xì)胞中的LN表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，展示了 LN的時(shí)空表達(dá)情況。通過(guò)生物信息學(xué)分析和同源序列比對(duì)，確認(rèn)了豬 LAMA5基因的存在，克隆了豬LAMA5基因部分序列，并進(jìn)行了測(cè)序鑒定。此外，我們還發(fā)現(xiàn)豬 iPS特異表達(dá)的LAMB1基因存在可變剪接體 (LAMB1-a)。本文初步揭示了豬 LN基因表達(dá)特性，為優(yōu)化豬iPS細(xì)胞培養(yǎng)體系和鑒定方法提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體和組織樣品

大腸桿菌 Stellar感受態(tài)細(xì)胞由陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保存。pGEM-T Easy載體購(gòu)自 Promega公司。豬各組織樣品采自動(dòng)物試驗(yàn)站飼養(yǎng)的八眉黑豬30日齡保育豬。

1.2 試劑和耗材

限制性?xún)?nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA連接酶、2×Taq MasterMix (Dye) 購(gòu)自CWBIO公司；總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA marker購(gòu)自天根公司 (北京)；細(xì)胞培養(yǎng)基 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、非必需氨基酸、谷氨酰胺購(gòu)自Invitrogen (美國(guó))；胎牛血清 (FBS) 購(gòu)自Hyclone；PCR引物 (表1)由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3 反轉(zhuǎn)錄 PCR檢測(cè)豬組織和細(xì)胞中 Laminin的表達(dá)

引物設(shè)計(jì)利用Primer Blast在線軟件進(jìn)行，以已知豬Laminin的RNA參考序列為模板 (表1)，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組比對(duì)后得到的目標(biāo)基因特異性引物序列。為方便擴(kuò)增，引物的設(shè)計(jì)盡量使 Tm值在60 ℃左右，引物序列長(zhǎng)度設(shè)定為20 bp，最終通過(guò)試驗(yàn)篩選確認(rèn)各基因引物。從成年豬睪丸、腦、肝、胃、心、肺組織、卵巢顆粒細(xì)胞，以及原代分離的脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、豬iPS細(xì)胞和不同培養(yǎng)條件下的DOX-iPS細(xì)胞中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR方法 (94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min ；35 個(gè)循環(huán)) 檢測(cè)LN的表達(dá)情況。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)分析

豬iPS細(xì)胞系piPS-g和豬胎兒成纖維細(xì)胞PEF的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室[20]，豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自韓建永課題組之前發(fā)表的文章[21]。數(shù)據(jù)使用 RPKM+1，并利用 Excel制作柱狀圖呈現(xiàn)。為了確定豬LAMA5基因，選取人、牛和羊的已知LAMA5基因組序列作為預(yù)測(cè)模板，通過(guò)分析LAMA5上下游基因的排列順序，將豬LAMA5基因定位于RPS21與CABLES2之間的序列區(qū)域。最終，通過(guò)GeneWise基因在線預(yù)測(cè)工具 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/genewise/) 利用已知的人和牛的蛋白序列與豬 RPS21和CABLES2基因之間的DNA序列進(jìn)行逆向比對(duì)，從而對(duì)豬 RPS21和 CABLES2之間是否存在LAMA5基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 豬LAMA5和LAMB1基因的克隆和鑒定

根據(jù)預(yù)測(cè)到的兩種豬LAMA5蛋白序列進(jìn)行差異比對(duì)，跨差異區(qū)域進(jìn)行豬LAMA5基因的引物設(shè)計(jì)，并分別命名為 pc-LAMA5-1和 pc-LAMA5-2(表1)。隨后，以豬iPS細(xì)胞總RNA制備的cDNA為模板，利用引物pc-LAMA5-1、pc-LAMA5-2和pc-LAMB1進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。將獲得的目的片段克隆到 pGME-T Easy載體并經(jīng)酶切鑒定，確認(rèn)酶切產(chǎn)物片段大小符合預(yù)期后，將質(zhì)粒送往西安擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.6 細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

豬成纖維細(xì)胞 (PEF) 來(lái)源于新生仔豬耳部組織，用高糖 DMEM培養(yǎng)基添加 15% FBS進(jìn)行培養(yǎng)；豬脂肪細(xì)胞來(lái)源于仔豬皮下脂肪組織，用DME/F12培養(yǎng)基添加10% FBS培養(yǎng)；豬肝臟細(xì)胞來(lái)源于仔豬肝臟組織，用高糖DMEM培養(yǎng)基添加10% FBS培養(yǎng)。豬iPS細(xì)胞系DOX-iPS細(xì)胞由本室誘導(dǎo)獲得[22]，使用高糖DMEM添加15% FBS培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、10 ng/mL BMP4、3 μmol 的CHIR99021、2 μmol的 SB431542、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇，每天換液后以 4 μg/mL添加新鮮配制的Doxycycline，3-4 d后進(jìn)行胰酶消化傳代。DOX-iPS分化細(xì)胞和二代DOX-iPS細(xì)胞的獲得見(jiàn)之前研究[22]。豬多能干細(xì)胞系piPS (PS11) 由本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得[23]，使用 KnockOut-DMEM添加 20% FBS、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巰基乙醇，每天換液，每隔2-3 d胰酶消化傳代。

圖1 豬LN基因在iPS細(xì)胞和早期胚胎的表達(dá)譜 (A：豬LN基因在PEF和iPS細(xì)胞中的表達(dá)；B：LN基因在胚胎不同時(shí)期的表達(dá))Fig. 1 Porcine LN gene expression in the iPS cells and early embryos. (A) Porcine LN gene expression in PEF and piPS. (B) LN gene expression in different stages of embryos.

2 結(jié)果與分析

2.1 LN基因在豬iPS細(xì)胞和早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄情況

通過(guò)分析豬iPS和PEF細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[1]，我們發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果中缺少LAMA5和LAMC1的信息 (圖1A)。對(duì)豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析也發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)中缺少LAMA1、LAMA5和LAMB4的信息 (圖1B)，其原因是豬LN基因家族的注釋尚不完全。對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄較為活躍的LAMA4基因，在細(xì)胞重編程完成后有所下調(diào)；LAMB1和LAMB2在豬iPS細(xì)胞中也有所下調(diào)，但LAMB1在豬iPS細(xì)胞中仍占有主要地位，與人多能干細(xì)胞中LAMB1高表達(dá)的情況類(lèi)似 (圖 1A)。對(duì)胚胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，豬LN的表達(dá)在桑葚胚期前后存在明顯的界限。在卵母細(xì)胞至 8細(xì)胞時(shí)期，LAMB1、LAMC1和LAMC3呈現(xiàn)高表達(dá)，且隨著發(fā)育過(guò)程逐漸減少，表明這 3個(gè)基因可能為母源基因，在豬胚胎阻滯期之前發(fā)揮重要的發(fā)育調(diào)控作用。在桑葚胚時(shí)期，所有LN均呈現(xiàn)低表達(dá)情況，說(shuō)明阻滯期過(guò)后，母源RNA利用殆盡。之后的囊胚期，LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3重新上調(diào)，預(yù)示這些基因作為早期合子激活基因，對(duì)胚胎進(jìn)一步分化和發(fā)育發(fā)揮重要調(diào)控作用 (圖1B)。

2.2 豬 LAMA5基因序列的預(yù)測(cè)、鑒定和同源分析

LAMA5基因在大多數(shù)物種中都有報(bào)道或注釋?zhuān)?，UCSC和NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有豬LAMA5相關(guān)序列和注釋。以人 (NM_005560.4)、牛 (XM_019972687.1)、羊 (XM_018057585.1) 的LAMA5基因RNA區(qū)段序列為模板，利用BLAST和BLAT對(duì)豬基因組整合序列 (Sscrofa10.2) 進(jìn)行比對(duì)，也未找到相似的序列 (圖2A)。我們推測(cè)，豬LAMA5基因序列無(wú)法查找可能有兩個(gè)原因：1) 豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (Sscrofa10.2) 的內(nèi)容不夠完整，而LAMA5的信息恰好位于缺失的序列當(dāng)中；2) 豬在進(jìn)化中發(fā)生了 LAMA5基因的丟失。因此，我們選擇牛第13號(hào)染色體上LAMA5基因組上游的SS18L1/LSM14B和下游的RPS21/CANLES2兩對(duì)基因?yàn)槲恢脜⒄眨c豬基因組序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果表明，豬17號(hào)染色體上有上述基因的相鄰分布，且在SS18L1和RPS21之間有一段80 kb的序列中存在序列缺口(Gap)。

2016年12月6日，最新的豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Sscrofa11.1) 更新并上傳至NCBI網(wǎng)站的Assembly數(shù)據(jù)庫(kù)。在豬17號(hào)染色體SS18L1和RPS21之間的序列增加至 168 kb，且新序列中不再有序列缺口 (圖2A)。利用GeneWise在線預(yù)測(cè)軟件，將人 LAMA5蛋白序列 (XP_006723859.1) 與186 kb豬基因組序列進(jìn)行逆向比對(duì) (GeneWise軟件提供的逆翻譯算法，可將蛋白序列逆翻譯為可變RNA序列，并與提供的基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì))，預(yù)測(cè)到一段 11 363 bp的同源mRNA序列，并將之命名為 P1；與牛 LAMA5蛋白序列 (XP_014333141.1) 比對(duì)預(yù)測(cè)到一段11 750 bp的同源mRNA序列，將之命名為P2。將P1和P2序列進(jìn)行同源性比對(duì)，兩者之間存在3個(gè)差異區(qū)段。將跨P1、P2間最大的差異區(qū)段進(jìn)行引物設(shè)計(jì) (圖2B)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增并進(jìn)行電泳檢測(cè)，獲得了731 bp的F-1和839 bp的F-2條帶(圖2C)?？寺-1片段進(jìn)行DNA測(cè)序，與預(yù)測(cè)序列P2相符。據(jù)此，將獲得的LAMA5基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù) (Accession No. KY622023)。

2.3 豬LN在組織和細(xì)胞中表達(dá)情況分析

采用RT-PCR檢測(cè)LN在豬各種組織 (圖3A)中的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，LN在不同組織細(xì)胞中具有不同的表達(dá)水平，其中LAMA5和LAMC1在各組織中廣泛表達(dá)，LAMA1在腦、卵巢和睪丸中高表達(dá)；LAMA2在肝組織中未見(jiàn)表達(dá)；LAMA3在肺、腦中高表達(dá)。LAMA4在卵巢顆粒細(xì)胞組織未見(jiàn)表達(dá)。LAMB1在心臟未見(jiàn)表達(dá)。LAMC2僅在腦和卵巢顆粒細(xì)胞有表達(dá)。LAMC3在腦和睪丸中有表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LN的表達(dá)和細(xì)胞 (圖3B–C)。相較于組織，細(xì)胞LN的表達(dá)更加特異，在肝細(xì)胞中只有 LAMA5、LAMB3和LAMC1表達(dá)。脂肪細(xì)胞和 PEF中 LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2和 LAMC1高表達(dá)。檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn)LAMB1只在多能細(xì)胞豬iPS中出現(xiàn)兩條特異性條帶。

圖2 豬LAMA5基因的預(yù)測(cè)和分子克隆 (A：人、牛、羊和豬LAMA5基因的定位；B：豬LAMA5基因預(yù)測(cè)；C：豬LAMA5基因RT-PCR產(chǎn)物F-1 (720 bp) 和F-2 (839 bp)；D：豬LAMA5克隆產(chǎn)物EcoRⅠ酶切結(jié)果)Fig. 2 Porcine LAMA5 gene prediction and molecular cloning. (A) Alignment of LAMA5 and related gene clusters among human, cattle, goat and porcine. (B) Prediction of porcineLAMA5 gene cluster. (C) RT-PCR amplification of porcineLAMA5 F-1 (720 bp) and F-2 (839 bp). (D) Plasmid of porcineLAMA5 clone was digested byEcoR I. M:marker DL2000.

圖3 豬LN的組織和細(xì)胞表達(dá)譜分析 (A：用RT-PCR檢測(cè)豬不同組織中LN的表達(dá)；B：實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞圖片；C：用RT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞中LN的表達(dá). 內(nèi)參選用β-Actin (簡(jiǎn)寫(xiě)為ACTB))Fig. 3 Expression profile of porcine LN. (A) RT-PCR analysis of porcine LN expression in different tissues. (B) Images of cells used in the experiment. (C) RT-PCR analysis of porcine LN expression in different cells. β-Actin: ACTB.

2.4 LAMB1-a的克隆和在多能干細(xì)胞中特異性表達(dá)

在對(duì)LAMB1的檢測(cè)中，使用引物pc-LAMB1在除心、胃組織外均檢測(cè)到符合預(yù)期的單一條帶(圖3A)。然而在豬iPS細(xì)胞中，則檢測(cè)到兩個(gè)條帶(圖3C)。分別回收兩個(gè)條帶，并經(jīng)克隆測(cè)序和同源比對(duì)驗(yàn)證，505 bp條帶與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的LAMB1-X1 (XM_003130269.4) 序列只有1個(gè)堿基差異。新條帶為639 bp，但與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的LAMB1-X1和LAMB1-X2 (XM_005667736.2)均不相同但具備較高的同源性，因此確認(rèn)639 bp的產(chǎn)物為L(zhǎng)AMB1一個(gè)新的可變剪切體，并將其命名為L(zhǎng)AMB1-a (圖4A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證LAMB1-a表達(dá)的特異性，對(duì)豬PEF、DOX-iPS細(xì)胞，以及分化 3 d (-DOX/3D)、5 d (-DOX/5D) 和二代DOX-iPS (2nd+DOX) 等細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè) (圖4B)。結(jié)果表明，PEF細(xì)胞中只表達(dá)LAMB1，而對(duì)豬iPS細(xì)胞中LAMB1的擴(kuò)增則能同時(shí)檢測(cè)到LAMB1和LAMB1-a (圖4C)。在對(duì)分化過(guò)程中的DOX-iPS細(xì)胞進(jìn)行LAMB1表達(dá)檢測(cè)中，我們還發(fā)現(xiàn)，隨著豬iPS的分化，克隆形態(tài)逐漸消失，LAMB1-a的表達(dá)也逐漸降低直至檢測(cè)不到 (圖4B–C)。對(duì)分化的DOX-iPS細(xì)胞恢復(fù)DOX-iPS培養(yǎng)條件，并添加Doxycycline進(jìn)行連續(xù)傳代后，DOX-iPS的克隆形態(tài)逐漸恢復(fù)，同時(shí)LAMB1-a再度表達(dá)(圖4B–C)。這表明，LAMB1-a與豬iPS細(xì)胞的重編程程度存在明確的相關(guān)性。

3 討論

在對(duì)小鼠的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)隨著機(jī)體的發(fā)育，不同的組織和細(xì)胞中LN基因的表達(dá)具有不同的時(shí)空特性，從而產(chǎn)生不同的LN蛋白組合來(lái)行使不同的作用[24]。本研究通過(guò)檢測(cè)豬組織和細(xì)胞中LN的表達(dá)情況證明，在不同組織和細(xì)胞中LN的表達(dá)均有各自的特征。這些結(jié)果表明，LN作為重要的細(xì)胞外基質(zhì)存在于豬的整個(gè)生命周期和各種組織當(dāng)中，并有可能參與不同的信號(hào)調(diào)控，對(duì)豬的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不同的影響。

圖4 豬LAMB1在多能干細(xì)胞中的特異表達(dá)分析 (A：LAMB1、LAMB1-a和已經(jīng)注釋的LAMB1-X1 (XM_003130269.4)和LAMB1-X2 (XM_005667736.2) 序列同源分析；B：DOX-iPS細(xì)胞圖片添加DOX (+DOX, 2nd+DOX) 和撤去DOX 3 d (–DOX/3D)、5 d (–DOX/5D)；C：RT-PCR檢測(cè)LAMB1和LAMB1-a在PEF和豬iPS細(xì)胞中的表達(dá))Fig. 4 Specific expression of LAMB1 in porcine pluripotent stem cells. (A) Alignment of DNA sequences of LAMB1 and LAMB1-a with published LAMB1-X1 (XM_003130269.4) and LAMB1-X2 (XM_005667736.2). (B) Images of DOX-iPSCs that were treated with (+DOX, 2nd+DOX) and without DOX in 3-day (–DOX/3D) and 5-day (–DOX/5D).(C) RT-PCR analysis of LAMB1 and LAMB1-a in PEF and piPS cells.

卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，母源 mRNA的積累和編碼的蛋白不僅可以支持卵母細(xì)胞到胚胎的發(fā)育，還在合子基因的激活中發(fā)揮重要作用，促使胚胎進(jìn)一步發(fā)育[25-26]。Elis等[25]發(fā)現(xiàn)，LAMB1和 LAMC1在小鼠早期胚胎發(fā)育階段就可以檢測(cè)到，這與豬早期胚胎中LAMB1和LAMC1的表達(dá)譜相一致。這些基因隨著胚胎的發(fā)育表達(dá)量逐漸減少，到桑葚胚期出現(xiàn)表達(dá)量極低的現(xiàn)象。這些基因表達(dá)量的下降可能與合子基因未被激活，母源mRNA的消耗、稀釋和降解有關(guān)。到囊胚階段LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3表達(dá)量再次升高，則說(shuō)明其可能作為早期的合子激活基因，在隨后的胚胎發(fā)育中具有重要作用。

Domogatskaya等報(bào)道，Laminin-511可以使鼠胚胎干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層條件下保持不分化狀態(tài)達(dá)169 d以上[27]。此外Rodin等通過(guò)將Laminin-511添加到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)人ES和人iPS細(xì)胞，其多能性維持良好，并呈單層分布生長(zhǎng)[16,28]?？梢?jiàn)Laminin-511對(duì)人和小鼠多能干細(xì)胞多能性的維持具有促進(jìn)作用。然而，在本文發(fā)表之前，NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中并沒(méi)有豬LAMA5基因相關(guān)信息，本研究通過(guò)分析最新豬基因組序列數(shù)據(jù)包 (Assembly:Sscrofa11.1)，確認(rèn)了豬LAMA5基因的存在。同時(shí)在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，豬 iPS細(xì)胞中也高水平地表達(dá)Laminin-511組合，為后續(xù)研究豬Laminin-511是否有利于豬多能性的維持提供了基本條件。

本研究在對(duì)豬iPS細(xì)胞LN表達(dá)情況的檢測(cè)過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)LAMB1基因在豬多能細(xì)胞中出現(xiàn)兩條特異性條帶，經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析，認(rèn)定長(zhǎng)度為639 bp的條帶是LMAB1的可變剪接體LAMB1-a形式，該剪接體的表達(dá)水平與豬iPS細(xì)胞的多能性以及重編程程度呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)在小鼠、人和其他物種中均未見(jiàn)報(bào)道，因此，這可能是豬多能干細(xì)胞與其他物種多能干細(xì)胞的一個(gè)重要區(qū)別，為豬多能干細(xì)胞的研究提供了新的研究方向。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression of Laminin gene family in porcine pluripotent stem cells

Huan Li, Tong Yu, Yangyang Ma, and Huayan Wang

Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology, College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100,Shaanxi, China

Laminin (LN) proteins are important components of extracellular matrix. These proteins regulate cell proliferation, differentiation, migration, and tissue repair. The LN family has 12 genes that encode 5 α, 4 β, and 3 γ proteins. LamininA5 (LAMA5) as an important gene can support pluripotent cell growth and have been widely studied.However, porcine LAMA5 is absent in all tested porcine genomic databases so far. In this study, we confirmed for the first time the existence of porcine LAMA5 through bioinformatics analysis, and verified this result by cDNA cloning and sequencing. To reveal the expression pattern of Laminin gene family, we detected the expression of Laminin genes in porcine tissues, somatic cells, and porcine induced pluripotent stem cells (piPSCs). The results showed that an alternative splicing variant of Laminin B1 (LAMB1-a) was found exclusively in all tested piPSCs. The expression of this alternative splicing variant is positively correlated with the pluripotent state of piPSCs. The above findings provide evidences and foundations for the father use of LN as extracellular matrix to facilitate the derivation and culture of porcine pluripotent stem cells.

porcine pluripotent stem cells, Laminin, LAMA5, expression pattern

March 12, 2017; Accepted: June 12, 2017

HuayanWang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31571521, 31371505).

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31571521, 31371505) 資助。