于志鵬，郭輝，趙文竹，*，陳月皎，丁龍，劉靜波，勵建榮，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

食源性糖蛋白富集及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

于志鵬1，郭輝1，趙文竹1，*，陳月皎1，丁龍2，劉靜波2，勵建榮1，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

糖蛋白種類繁多，存在形式復(fù)雜多樣，但糖蛋白含量較低，因此高選擇性的分離純化富集是食源性糖蛋白深入研究的基礎(chǔ)。就食源性糖蛋白分離富集方法及其應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為糖蛋白或糖肽的富集的研究提供參考。

糖蛋白；分離；純化；富集

糖蛋白對生長發(fā)育、信息傳遞、免疫調(diào)節(jié)等多種生命活動起著重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白具有調(diào)節(jié)免疫力[2-3]、抗氧化、防衰老、抗炎癥、降低血糖和降血脂等生物活性功能[4-5]。隨著糖生物學(xué)和現(xiàn)代分離純化技術(shù)的發(fā)展，糖蛋白的提取、純化、分離富集等研究已成為諸多科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前已證實(shí)多種海洋軟體動物的糖蛋白具有明顯的抑制腫瘤、抗癌等活性[6-7]，糖蛋白更多的生物活性逐漸被發(fā)現(xiàn)。糖蛋白是由長度較短、帶分支的寡糖與多肽鏈共價(jià)連接而形成，其連接方式為N-連接的糖鏈、O-連接的糖鏈、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白及C-連接的糖鏈，其中以O(shè)型糖蛋白和N型糖蛋白最為常見。糖蛋白的結(jié)構(gòu)及糖鏈的解析均需要較高純度的糖蛋白，因此糖蛋白的分離純化研究成為后續(xù)深入研究糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，也成為當(dāng)前糖蛋白研究關(guān)注的焦點(diǎn)。因此，本文對糖蛋白分離純化方面的研究進(jìn)行綜述。

1 層析法

1.1 凝集素親和技術(shù)

凝集素是一種對糖蛋白上的糖類具有高度特異性的結(jié)合蛋白，能夠?qū)Ｒ坏淖R別某一種特殊結(jié)構(gòu)的單糖或聚糖中的特定糖基序列并與之結(jié)合，并與糖鏈的結(jié)合是非共價(jià)且可逆的，糖蛋白或糖肽被凝集素捕獲后，通常用特定的單糖通過競爭結(jié)合凝集素將糖蛋白或糖肽洗脫下來。時照梅等[8]制備了兩種以氧化石墨烯（GO）為載體的新型固定化凝集素，利用GO比面積較大等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高負(fù)載的凝聚素固定。Goncalves等[9]研究了4種不同材料的超大孔致冷劑凝集素純化方法，其中一種將制冷的戊二醛改性的方法應(yīng)用于伴刀豆球蛋白凝集素吸附過程中，它的吸附能力和穩(wěn)定性都有不同的提升。Liu等[10]利用氧化葡聚糖促進(jìn)合成的硅基材料伴刀豆球蛋白凝集素親和富集糖蛋白/糖肽。“糖捕獲法（glycol-catch）”的凝集素親和技術(shù)逐漸用于糖蛋白/糖肽的分離富集，該方法已被成功地用于牛胎球蛋白、雞卵清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和人血清等復(fù)雜樣品的處理[11]。李鳳等[12]利用一種新型納米材料與凝集素結(jié)合的方法富集人血清中特異性糖蛋白。凝集素技術(shù)相對成熟、操作簡單、重復(fù)性好，但凝集素成本較高而且本身特異性的結(jié)合限制了富集樣品的選擇性，同時由于基質(zhì)材料的比面積較小，導(dǎo)致凝集素負(fù)載量偏低，影響了富集效率。

凝集素親和技術(shù)還可分為單種凝集素親和法、多種凝集素親和法、連續(xù)凝集素親和法（SLAC法）、凝集素固定技術(shù)以及凝集素微柱和質(zhì)譜聯(lián)用。單種凝集素法只能富集樣品中特定的糖蛋白/糖肽，多種凝集素法進(jìn)一步提升了富集的效率，富集的蛋白質(zhì)較為復(fù)雜時，使用連續(xù)凝集素法可以得到可信度更高的糖蛋白/糖肽，凝集素固定技術(shù)使凝集素固定在具有親和性的多種材料上，從而提供了不同的富集途徑和方法。凝集素微柱和質(zhì)譜聯(lián)用能夠檢測含量稀少、蛋白質(zhì)動態(tài)范圍大的一些低豐度糖蛋白，和LC-MS/MS在線聯(lián)用，可進(jìn)一步提高自動化程度。凝集素親和技術(shù)是目前糖蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的分離富集方法。

1.2 硼酸親和技術(shù)

硼酸親和技術(shù)是利用硼酸基團(tuán)可以和糖肽中的糖鏈上的順式鄰位或間位羥基發(fā)生可逆反應(yīng)生成環(huán)狀二脂，堿性條件下共價(jià)結(jié)合，酸性條件下分解的原理對糖蛋白/糖肽進(jìn)行分離富集。硼酸親和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)只需改變pH值且操作簡便，通過優(yōu)化富集分離可以將非特異性吸附作用力抑制或消除，該方法具有分子目標(biāo)高專一性[13]，普適性強(qiáng)。近年來，利用硼酸類親和材料對帶有順式二醇基團(tuán)物質(zhì)的富集方法迅速出現(xiàn)，例如磁性納米顆粒[14]、中孔硅膠、瓊脂糖、固相萃取材料等。

1.3 親水相互作用色譜法

糖鏈因其多羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的親水性，所以很多親水性的層析介質(zhì)都可以用來分離富集糖蛋白/糖肽。優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，能非選擇性的富集不同類型的糖肽。缺點(diǎn)主要有：該方法屬于非特異性吸附，對糖蛋白/糖肽分離富集可能會存在相當(dāng)大的非特異性吸附，未能徹底除去少量非糖基化蛋白，對后續(xù)研究的準(zhǔn)確性有很大的影響[15]。

1.4 分子篩法富集糖肽

分子篩是一種包含有精確和單一的微小孔洞的材料，可用于吸附氣體或液體，只有分子直徑小于孔穴直徑的物質(zhì)才可能進(jìn)入分子篩的晶穴內(nèi)部，通過吸附的優(yōu)先順序和尺寸大小來區(qū)分不同物質(zhì)的分子，所以被形象的稱為“分子篩”。Alvarez-Manilla等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心）中人類蛋白酶經(jīng)胰酶理論酶切后，有90%以上的肽段分子質(zhì)量小于2 000 u，即使是最小的N型糖鏈的分子質(zhì)量也要超過1 200 u，從二者的分子質(zhì)量中可以看出，糖鏈對于糖基化肽分子質(zhì)量是有較大影響的。他們利用分子篩的方法非選擇性的對糖肽與非糖基化肽進(jìn)行分離，得到了顯著的效果。其優(yōu)點(diǎn)在于該方法操作難度低，能非選擇性的富集糖肽。缺點(diǎn)主要有：若酶切不完全，未完全酶切的高分子質(zhì)量片段將會影響糖肽的富集。

1.5 抗體親和層析

對于生物大分子的富集，抗體親和層析法是一種較好的方法，它通過抗原抗體結(jié)合的穩(wěn)定性和專一性來進(jìn)行富集。這些抗體一般具有位點(diǎn)依賴性，且往往需要結(jié)合多個單糖才表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力。目前最常用的兩種O-GlcNAc抗體是RL2和CTD110.6[16]?？贵w親和法主要應(yīng)用于O-GlcNAc糖基化的糖蛋白/糖肽的富集[17]，可以利用β-O-GlcNAc糖基化具有特異性的單克隆抗體進(jìn)一步分析，高靈敏、精確的確定β-OGlcNAc的糖基化位點(diǎn)。Andre[18]等利用CD（免疫細(xì)胞表面的一種受體）9 partner-1（CD9P-1）的抗體從全蛋白中富集純化出CD9P-1，通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定得到了CD9P-1的9個糖基化位點(diǎn)。它的優(yōu)點(diǎn)在于特異性好、富集效率高，但目前相對應(yīng)糖蛋白/糖肽的抗體較少，限制了它的使用。

1.6 強(qiáng)陽離子交換色譜法（Strongcationexchange，SCX）

自Beausoleil等[19]將SCX成功應(yīng)用到磷酸化肽段的富集后，SCX已成為大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組聯(lián)合富集路線中最常用的一維分離技術(shù)。隋少卉等[20]研究表明SCX分離磷酸化肽段策略是基于磷酸化肽段與非磷酸化肽段在酸性溶液中所帶電荷的不同達(dá)到分離目的。曹晶等[21]在糖蛋白/糖肽的分離富集的研究中發(fā)現(xiàn)，含有較少電荷的唾液酸殘基的糖肽會較普通的糖肽先行流出，從而得到分離。在強(qiáng)陽離子交換色譜中，單電荷肽段比多電荷肽段流出時間早。

目前，針對復(fù)雜的生物樣本，主要采用的是多維分離分析系統(tǒng)，如多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，即采用強(qiáng)陽離子交換色譜和反相液相色譜兩種分離原理正交的分離方法構(gòu)成多維分離，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜組成的一種多維分離鑒定技術(shù)。

1.7 對角線色譜法

對角線色譜法是將兩個相同的、連續(xù)的肽在酶或化學(xué)選擇肽的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)之間的改變來進(jìn)行分離的，這種選擇和改變的肽能得到不同的色譜性能，從而可以分離肽列中未發(fā)生改變的肽段。

Gevaert等[22]將組合分離對角色譜（COFRADIC）應(yīng)用在N型糖基化肽段的分離上，通過兩次相同條件的反向液相色譜來分離某些特定的肽段。他們通過比較使用唾液酸苷酶在相同的條件下得到的相對應(yīng)色譜中峰的移動鑒定了血清中93個唾液酸的糖基化位點(diǎn)及相應(yīng)的53個糖蛋白。

2 化學(xué)修飾法

糖蛋白/糖肽化學(xué)修飾是通過特異性地修飾糖蛋白/糖肽上的糖鏈而使糖基化蛋白/多肽被選擇性的分離富集，從而實(shí)現(xiàn)降低待研究樣品的復(fù)雜程度。

2.1 肼化學(xué)富集法

肼化學(xué)法是利用糖蛋白/糖肽上的鄰二醇結(jié)構(gòu)來進(jìn)行富集，其方法包括以下幾個步驟：①氧化，利用高碘酸鹽將糖鏈上的順式鄰二醇氧化成醛；②偶聯(lián)，醛基與樹脂上的酰肼基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)形成腙鍵，從而被捕獲；③糖基化蛋白或肽的釋放。優(yōu)點(diǎn)在于肼化學(xué)法的反應(yīng)專一性高且無位點(diǎn)偏向性，有助于糖基化位點(diǎn)的確認(rèn)，清洗過程中損失的蛋白較少。缺點(diǎn)是反應(yīng)步驟多，條件較難控制，且操作復(fù)雜。

天冬胺酰亞胺是一種在酸性條件下形成的蛋白質(zhì)藥物，在Klaene等[23]的研究中，提出一個方法來檢測和定量在完整蛋白質(zhì)，通過肼捕獲和化學(xué)衍生化琥珀酰亞胺，他們的獨(dú)特優(yōu)勢是變種含琥珀亞酰胺衍生化后，可以很容易的通過親和富集和色譜分離。異天冬氨酸的形成是普遍存在的翻譯后修飾所產(chǎn)生的天冬酰胺脫酰胺或天門冬氨酸異構(gòu)化，Alfaro等[24]在研究中使用肼捕獲法來檢測異天冬氨酸蛋白。

2.2 β-消除米氏加成反應(yīng)

β-消除米氏加成反應(yīng)廣泛應(yīng)用于O-糖肽的分離富集中（見圖1）。Wells等[25]利用O-糖蛋白在堿性條件下發(fā)生β-消除反應(yīng)，產(chǎn)生不飽和雙鍵，再加入二硫蘇糖醇（DTT）或生物素戊胺（BAP）進(jìn)行米氏加成的方法使O-糖肽的糖基化位點(diǎn)被標(biāo)記，標(biāo)記后的多肽可通過親和的方法富集。

圖1 β-消除米氏加成法分離富集糖蛋白/糖肽[16]Fig.1 Isolation and enrichment of glycoproteins by using beta-elimination/Michael addition method

3 展望

約有超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化，數(shù)據(jù)庫中僅有10%左右注釋為糖蛋白，糖蛋白/糖肽的特殊結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)的不同使其分離富集的方法多種多樣，其中硼酸法應(yīng)用最為廣泛，普適性強(qiáng)；β-消除米氏加成法的反應(yīng)條件易與磷酸化蛋白等產(chǎn)生干擾；肼化學(xué)法操作復(fù)雜等。因此，在研究過程中結(jié)合不同方法的優(yōu)勢，使用多種富集方法對糖蛋白/糖肽進(jìn)行更高效、更全面的分離富集，如凝集素法與肼化學(xué)法的結(jié)合，親水介質(zhì)纖維素與連續(xù)凝集素親和法的集合等。

糖蛋白組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)快速發(fā)展，分離富集和分析技術(shù)的成熟，糖蛋白質(zhì)組學(xué)將會在完善表達(dá)蛋白質(zhì)組、疾病蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及藥物靶點(diǎn)等臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用。為了更深入的研究糖蛋白/糖肽，還需鑒定、分析和分離富集等技術(shù)上的改革創(chuàng)新以及多種方法的結(jié)合。蛋白質(zhì)翻譯后修飾對于生物體內(nèi)的新陳代謝和信號傳導(dǎo)等過程扮演著重要的角色。糖鏈轉(zhuǎn)移酶和代謝酶的基因芯片研究以及與糖鏈有關(guān)的計(jì)算機(jī)處理軟件也正日益受到關(guān)注，通過基因手段改變病原體的糖蛋白的結(jié)構(gòu)并阻止其與細(xì)胞結(jié)合，也成為分子水平上研究糖蛋白調(diào)控以及開展基因治療的的重要靶標(biāo)。

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Progress on the Enrichment of the Food-derived Glycoproteins and Its Application

YU Zhi-peng1，GUO Hui1，ZHAO Wen-zhu1，*，CHEN Yue-jiao1，DING Long2，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

There are many kinds of glycoproteins with complex and varied forms.Because of the low content of glycoproteins，the separation of high selectivity is the basis of in-depth study of purification and enrichment of glycoproteins.The method and application for enrichment of the foodborne glycoproteins were reviewed in this paper，aimed to provide a reference for the research of enrichment of glycoproteins or glycopeptides.

glycoprotein；isolation；purification；enrichment

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.046

2016-12-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601479）；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目（2016004004）；渤海大學(xué)博士啟動項(xiàng)目（0515bs079）

于志鵬（1984—），男（漢），講師，博士，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā)。

*通信作者