電針改善慢性腦低灌注大鼠認知障礙反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞與Aβ代謝的作用研究

張巧玲 胡文盈 殷潔 艾琪 徐雁 劉喆

浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053

電針改善慢性腦低灌注大鼠認知障礙反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞與Aβ代謝的作用研究

張巧玲 胡文盈 殷潔 艾琪 徐雁 劉喆

浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053

[目的]觀察電針對慢性腦低灌注（Chronic Cerebral Hypoperfusion，CCH）大鼠學習記憶能力的影響，并探討其對海馬反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞及淀粉樣β蛋白（β-amyloid protein，Aβ）代謝的影響。[方法]采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法制備慢性腦缺血大鼠模型，設(shè)置假手術(shù)組、模型組、藥物組、電針組進行對照觀察；電針組百會、大椎穴治療30天，用激光多普勒血流儀觀察各組大鼠不同時間點（手術(shù)前、后及治療后）局部腦血流（regional cerebral blood flow，rCBF）變化評價模型制備及電針對腦血流改善情況；采用Morris水迷宮（MWM）觀察各組大鼠空間學習記憶能力變化；用Elisa法檢測海馬促炎細胞因子TNF-α及BACE1濃度變化；免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)Aβ1-42及GFAP陽性細胞數(shù)量變化。[結(jié)果]rCBF檢測顯示，與假手術(shù)組比較，模型組rCBF仍維持低灌注水平（P＜0.01），而藥物組、電針組動物rCBF均較模型組明顯上升（P＜0.01）；MWM觀測顯示，與模型組相比，藥物組、電針組大鼠平均逃避潛伏期逐步縮短（P＜0.05或P＜0.01），目標象限的游泳時間明顯增多（P＜0.01）；Elisa檢測顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、藥物組及電針組大鼠海馬TNF-α及BACE1均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而與模型組相比，藥物組、電針組海馬TNF-α及BACE1均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；免疫組化染色顯示，與模型組相比，藥物組、電針組海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)和Aβ1-42陽性細胞數(shù)減少(P＜0.05或P＜0.01)。[結(jié)論]持續(xù)性腦低灌注致海馬反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增多、促炎細胞因子含量上升，刺激BACE1的表達，進而促進淀粉樣β蛋白產(chǎn)生，可能是CCH導致認知功能障礙的重要發(fā)病機制；電針改善局部腦血流、抑制海馬炎癥反應(yīng)及BACE1的表達，進而減少淀粉樣β蛋白生成，可能是其改善慢性腦低灌注大鼠認知障礙的作用機制之一。

慢性腦低灌注；海馬淀粉樣β蛋白代謝；反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞；電針；認知障礙

慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是指由高血壓、動脈硬化、頸動脈狹窄等多種因素所引起的腦組織血流降低、供血不足的一種病理狀態(tài)，是血管性癡呆（vascular dementia，VD）、阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）等疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]102。近年來隨著我國社會人口老齡化程度的加劇，老年期癡呆成為一個嚴重的醫(yī)學和社會問題，而AD和VD是老年期癡呆的主要類型，其發(fā)病率有逐年上升趨勢。這不僅影響了患者的生活質(zhì)量，還增加了家庭和社會的經(jīng)濟負擔[2]。因此，揭示其發(fā)病機制，探索有效的防治手段是相關(guān)領(lǐng)域亟待解決的重要課題。

AD的主要病理特征是腦組織β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積所形成的老年斑。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）通過蛋白酶β-secretases和 γ-secretases順序水解而成，其中AD大腦與Aβ生成密切相關(guān)的βsecretase是BACE1（beta amyloid converting enzyme 1或β-site APP-cleaving enzyme 1）[3]，其水解APP形成長度為42個氨基酸殘基的片段即Aβ1-42，是AD腦組織老年斑的主要組成成分，腦內(nèi)Aβ過量的產(chǎn)生、聚集和沉淀促發(fā)過氧化應(yīng)激損傷、炎性級聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)纖維纏結(jié)、軸突損傷和突觸丟失，導致神經(jīng)元凋亡和認知功能減退[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)CCH可導致Aβ的產(chǎn)生與沉積[5]，電針可改善多種模型動物認知障礙[6]899，但其對CCH所致Aβ代謝的影響尚未見系統(tǒng)研究報道。本實驗采用CCH大鼠模型，給予電針處理并與米諾環(huán)素腹腔注射干預(yù)進行對照，從反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞、促炎細胞因子（TNF-α）及Aβ生成的限速酶BACE1角度，探討電針對CCH大鼠Aβ代謝及學習記憶能力的影響，為針灸治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及主要試劑儀器 實驗用清潔級三月齡雄性Sprague Dawley大鼠，體質(zhì)量280±30g，共48只，購自浙江省醫(yī)學科學院，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，自由飲食，維持12h/12h明暗周期。將大鼠隨機分為假手術(shù)組12只與手術(shù)組36只，分別進行手術(shù)處理后將造模動物隨機分為模型組、藥物組與電針組各12只進行實驗觀察。試劑儀器：米諾環(huán)素（TCI公司，日本）、兔抗GFAP抗體與兔抗Aβ1-42抗體（Bioss，北京）、BACE1與TNF-α檢測Elisa試劑盒（R&D，美國）、彎剪、手術(shù)刀、縫合線、注

射器、0.3mm×13mm毫針；韓式電針儀、激光多普勒組織血流儀（Peri Flux 5000，Perimed AB，瑞士）、Morris水迷宮系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）、SpectraMax M4酶標儀（Molecular Devices，美國）石蠟切片機（Thermo MICROM，德國）、普通光學顯微鏡（Leica DM2500，德國）。

1.2 模型制備 大鼠稱重后，用10%水合氯醛（3.5ml/ kg體重）腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，固定時充分暴露頸部，用彎剪將頸部正中毛剪去約1.5×3cm2見方，用PV碘消毒后行頸部正中縱向切開（切口約1cm），分離雙側(cè)頸總動脈，4?？p合線分別結(jié)扎近心端和遠心端，縫合切口并用PV碘消毒，施以適量的青霉素鈉抗感染，再將大鼠置于37℃環(huán)境中待其完全蘇醒后分組并予以各項干預(yù)處理[7]。

1.3 治療方法 假手術(shù)組與模型組：不予電針及藥物治療，但造模后第一天始行相應(yīng)劑量生理鹽水腹腔注射，且行相應(yīng)抓取固定，時間及方法同各干預(yù)組，30d后處死取材。藥物組：造模后第一天開始于腹腔注射美滿霉素（minocycline，MC）45mg/kg，每日1次，其余抓取固定方法、時間同電針組，治療30d后處死取材。電針組：造模后第一天行電針治療，參照《實驗動物穴位圖譜》[8]取穴百會（頂骨正中處）、大椎（第七頸椎背側(cè)凹陷處），0.3mm×13mm毫針針刺，接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，輸出電流1mA，頻率15Hz連續(xù)波，時間20min，每日1次，治療30d后處死取材，并行生理鹽水腹腔注射，時間同藥物組。

1.4 局部腦血流檢測 采用激光多普勒血流儀檢測大鼠rCBF變化，記錄手術(shù)前20min、術(shù)后20min及處死前20min腦血流值，比較手術(shù)前后rCBF的變化情況，評價CCH造模成功與否及不同時相二種干預(yù)對其變化的影響。

1.5 神經(jīng)行為學觀察 Morris水迷宮實驗[9]：所有各組大鼠在處死前6天開始Morris水迷宮檢測，連續(xù)進行5天的定位航行試驗訓練并檢測逃避潛伏期，每日4次。第6天進行空間探索實驗：觀察規(guī)定時間內(nèi)大鼠在池中的搜索策略。水迷宮直徑為180cm，高58cm的圓形水池，池壁黑色，池內(nèi)水深約32.5cm，水溫保持25±1℃，按東西、南北方向?qū)⑺氐确譃樗膫€象限，將直徑15cm、高30cm的平臺放置于其中某一象限直至所有實驗完成：⑴定位航行試驗（place navigation test）。訓練時隨機選擇東南西北四個點將大鼠面向池壁輕放入水，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺的游泳路徑及所需時間，如大鼠在60s內(nèi)未找到平臺，需將其引至平臺并停留15s，將其逃避潛伏期計為60s。⑵空間探索試驗（spatial probe test）。在上述實驗結(jié)束后觀測大鼠對平臺空間位置的記憶能力，即在第6天撤除水下平臺，在平臺象限對側(cè)沿池壁將大鼠放入水中，測其60s內(nèi)在目標象限的游泳時間。

1.6 取材處理 每組大鼠隨機選取6只，麻醉下迅速斷頭取腦，置于冰盒上剝?nèi)『ｑR，液氮冷凍置于-80℃冰箱保存；其余動物經(jīng)心灌注4%多聚甲醛灌注后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛灌注4℃后固定24h后切取中段，腦組織常規(guī)脫水后石蠟包埋，用于免疫組織化學染色。

1.7 ELISA檢測方法 將快速冷凍的海馬組織在含有蛋白磷酸酶酶抑制劑混合物的裂解緩沖液（Applgen，北京，中國）中混勻，然后將樣品在4℃下12000g離心15min。檢測方法參考試劑說明書進行，測量上清液中 TNF-α和 BACE1的含量。使用SpectraMax M4酶標儀在450nm的波長下測量顏色的強度。對每個樣品進行一式兩份檢查，并進行平均數(shù)據(jù)分析。每組隨機選擇5只大鼠進行ELISA檢測。

1.8 免疫組化染色方法 石蠟切片（5μm）脫蠟復(fù)水，采用常規(guī)免疫組化法檢測海馬CA1區(qū)Aβ及GFAP陽性細胞。染色步驟簡述如下，切片采用pH6.0檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復(fù)，3%H2O2孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加山羊血清封閉，滴加兔抗Aβ1-42抗體兔抗GFAP抗體（bs-0107R，1:200；bs-0199R，1:400，Boster公司）4℃冰箱濕盒孵育24h后濕盒復(fù)溫2h，滴加生物素化二抗37℃恒溫水浴箱孵育2h，滴加S-A/HRP 37℃孵育1h加DAB顯色；各步驟之間PBS清洗5min×3次。每只大鼠選取3～5張切片染色、每張染色片隨機選取3～5個視野（×40）進行陽性細胞計數(shù)（Leica DM-2500顯微成像系統(tǒng)），求均值作為樣本計數(shù)結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理。統(tǒng)計數(shù)據(jù)描述用均數(shù)±標準差（±S）表示；進行重復(fù)度量方差分析（大鼠動物航行實驗數(shù)據(jù)）及其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），檢驗顯著性水平定于P＜0.05。

2 結(jié)果

手術(shù)組大鼠在術(shù)后均有腦缺血表現(xiàn)，多數(shù)大鼠出現(xiàn)掉毛、毛色黃暗、動作感覺遲緩、活動飲食減少、精神萎靡，少數(shù)大鼠可見單側(cè)眼瞼下垂，但無明顯活動障礙。假手術(shù)組上述癥狀不明顯。

2.1 大鼠局部腦血流的檢測結(jié)果

2.1.1 手術(shù)前后rCBF變化情況 經(jīng)激光多普勒血流儀檢測，造模前假手術(shù)與手術(shù)組、假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前比較rCBF值均無顯著性差異（P＞0.05），手術(shù)組大鼠造模后局部腦血流迅速下降，與術(shù)前比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。檢測結(jié)果顯示，雙頸總動脈結(jié)扎術(shù)可導致實驗大鼠局部腦血流顯著下降，表明手術(shù)造模成功。見表1。

表1 手術(shù)造模前后局部腦血流變化情況（±s，PU）Tab.1 Regional cerebral blood flow changes before and after surgery building（±s，PU）

表1 手術(shù)造模前后局部腦血流變化情況（±s，PU）Tab.1 Regional cerebral blood flow changes before and after surgery building（±s，PU）

注：與同組手術(shù)前20min比較，**P＜0.01；同時間假手術(shù)組比較，☆☆P＜0.01。Note:Compared with the same group 20min before operation，**P＜0.01；compared with the same time control group,☆☆P＜0.01.

144.93±2.31 52.87±3.64☆☆**組別 n 手術(shù)前20min 手術(shù)后20min假手術(shù)組手術(shù)組12 36 151.96±3.19 154.94±12.79

2.1.2 電針治療對局部腦血流變化的影響 各組大鼠rCBF進行檢測結(jié)果顯示：模型組、藥物組、電針組與同時相假手術(shù)組比較rCBF下降顯著，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；缺血30天后(處死前20min)模型組rCBF仍維持低灌注水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示結(jié)扎雙側(cè)頸總會造成實驗大鼠持續(xù)性腦缺血；與同時相模型組相比，藥物組、電針組rCBF上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示藥物（美滿霉素）、電針都能夠明顯改善CCH大鼠局部腦供血。見表2。

2.2 Morris水迷宮實驗

2.2.1 定位航行試驗 定位航行實驗檢測大鼠獲取經(jīng)驗（學習）的能力，以平均逃避潛伏期表示。本實驗顯示：與假手術(shù)組比較，模型組平均逃避潛伏期顯著延長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示腦低灌注可致學習能力障礙；與模型組比較，除day1時點外電針組、藥物組其余各時點平均逃避潛伏期均顯著縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），且兩干預(yù)組動物平均逃避潛伏期隨著訓練時間的延長而縮短，且藥物組與電針組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示藥物、電針治療能改善CCH大鼠的空間學習能力。見表3。

表2 藥物、電針干預(yù)對CCH大鼠局部腦血流的影響（±s，PU）Tab.2 The influence of drugs,electric acupuncture intervention on regional cerebral blood flow in rats（±s，PU）

表2 藥物、電針干預(yù)對CCH大鼠局部腦血流的影響（±s，PU）Tab.2 The influence of drugs,electric acupuncture intervention on regional cerebral blood flow in rats（±s，PU）

注：與同時相假手術(shù)組比較，☆☆P＜0.01；與同時相模型組比較，★★P＜0.01。Note:Compared with the same time control group,☆☆P＜0.01;compared with the same time model group,★★P＜0.01.

組別 n腦缺血時間造模手術(shù)前20min 造模手術(shù)后20min 處死前20min 148.46±7.52 62.84±16.10☆☆90.49±5.12☆☆★★83.77±9.12☆☆★★假手術(shù)組模型組藥物組電針組12 12 12 12 151.96±3.19 150.52±2.05 163.61±7.75 150.68±4.69 144.93±2.31 54.59±4.68☆☆50.15±9.20☆☆53.86±6.91☆☆

表3 在不同時相及藥物、電針干預(yù)后的各組平均逃避潛伏期（±s，秒）Tab.3 Average escape latency time of each group in different phases and drugs,after ele-acupuncture intervention（±s，s）

表3 在不同時相及藥物、電針干預(yù)后的各組平均逃避潛伏期（±s，秒）Tab.3 Average escape latency time of each group in different phases and drugs,after ele-acupuncture intervention（±s，s）

注：與同時點假手術(shù)組比較，☆☆P＜0.01；與同時點模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note:Compared with the same time sham operation group,☆☆P＜0.01;compared with the same time model group,★P＜0.05，★★P＜0.01.

組別 n訓練日期day1 day2 day3 day4 day5假手術(shù)組模型組藥物組電針組5.77±2.40 30.63±4.99☆☆5.90±2.58★★7.81±2.13★★12 12 12 12 39.97±4.97 49.85±8.85☆☆47.10±6.42☆☆50.33±6.46☆☆21.11±2.11 42.38±3.56☆☆28.84±2.27★18.51±9.33★★18.15±4.56 36.72±6.40☆☆16.42±4.62★★17.23±10.26★★13.53±2.09 34.01±8.78☆☆9.91±5.90★★9.96±4.79★★

2.1.2 空間探索試驗 空間探索試驗即規(guī)定時間內(nèi)在目標象限的游泳時間，可以反應(yīng)大鼠的空間記憶能力，該時間越長說明空間記憶能力越強。實驗顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在目標象限游泳時間明顯較縮短，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，藥物組、電針組在目標象限的游泳時間明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；藥物組與電針組在目標象限的停留時間有差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。說明CCH可致空間記憶障礙，而藥物及電針干預(yù)后可以提高CCH模型大鼠的空間記憶能力。見表4。

表4 各組在目標象限的停留時間（?±s，秒）Tab.4 Each group's residence time in the target quadrant（±s，s）

表4 各組在目標象限的停留時間（?±s，秒）Tab.4 Each group's residence time in the target quadrant（±s，s）

注：與假手術(shù)組比較，☆☆P＜0.01；與模型組比較，★★P＜0.01。Note:Compared with sham operation group,☆☆P＜0.01;compared with model group,★★P＜0.01.

25.12±1.91 18.40±1.27☆☆26.22±3.03★★26.79±3.44★★組別 n 目標象限停留時間假手術(shù)組模型組藥物組電針組12 12 12 12

2.3 電針對腦低灌注大鼠海馬CA1區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞及海馬促炎細胞因子TNF-α的影響

造模后GFAP在上述腦區(qū)均有表達，本實驗主要檢測海馬CA1區(qū)域內(nèi)陽性細胞。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，各組大鼠GFAP陽性細胞數(shù)量均有增加，星形膠質(zhì)細胞所分泌的TNF-α濃度均升高，其中模型組GFAP細胞增多顯著，且胞體增大、突起肥厚（P< 0.01）；與模型組相比，藥物組、電針組GFAP陽性細胞數(shù)量減少，胞體減小、突起細長，且其數(shù)量與模型組比較具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），藥物組、電針組TNF-α濃度降低，其差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果提示：電針與藥物干預(yù)均可減少CCH后星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量及其反應(yīng)性。見表5、圖1。

2.4 電針對腦低灌注大鼠海馬BACE1濃度及CA1區(qū)Aβ1-42表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組海馬BACE1濃度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，藥物組與電針組海馬BACE1濃度均降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；電針組BACE1濃度略高于藥物組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。免疫組化染色結(jié)果顯示，造模后Aβ1-42在額葉、顳葉、海馬區(qū)均有表達，本實驗主要檢觀測海馬CA1區(qū)陽性細胞。與BACE1含量的變化趨勢相似，與假手術(shù)組相比，各組大鼠Aβ1-42陽性細胞數(shù)量均有增多，其中模型組陽性細胞增多數(shù)量尤其顯著（P<0.01）；與模型組相比，藥物組、電針組Aβ1-42細胞著色淡、陽性細胞數(shù)量明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果提示：電針與藥物干預(yù)均可減少CCH大鼠海馬BACE1含量及CA1區(qū)Aβ1-42的表達。見表6、圖2。

表5 海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)及海馬促炎細胞因子TNF-α濃度（±s）Tab.5 The number of GFAP positive cells and the concentration of TNF-α in hippocampaus（±s）

表5 海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞數(shù)及海馬促炎細胞因子TNF-α濃度（±s）Tab.5 The number of GFAP positive cells and the concentration of TNF-α in hippocampaus（±s）

注：與假手術(shù)組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note:Compared with sham operation group,☆P＜0.05,☆☆P＜0.01;compared with model group,★P＜0.05，★★P＜0.01.

110.09±2.57 149.67±2.91☆☆129.78±3.23☆★132.12±2.46☆★組別 n GFAP陽性細胞數(shù)(個/視野) TNF-α（ng/L）假手術(shù)組模型組藥物組電針組5 5 5 5 12.52±3.54 26.75±3.68☆☆15.38±4.09★★16.07±3.96★★

圖1 海馬CA1區(qū)GFAP陽性細胞免疫組化染色(400X)Fig.1 Immunohistochemical of GFAP positive cells in the hippocampal CA1(400X)

3 討論

21世紀人口老齡化勢不可擋，老年癡呆癥將成為一個影響人類發(fā)展的至關(guān)重要的世界性衛(wèi)生/健康問題[10]。AD是老齡人群最為常見且危害性極大的神經(jīng)退行性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為進行性記憶損害、認知障礙以及行為改變。AD患者大腦病理變化包括神經(jīng)元外Aβ沉積所形成的老年斑、tau蛋白過度磷酸化所形成的胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）、神經(jīng)元及突觸丟失、膠質(zhì)細胞增生、腦淀粉樣血管病及其他血管病變。盡管支持淀粉蛋白級聯(lián)假說的證據(jù)仍存在問題和爭議[11]，但該假說依然是關(guān)于AD發(fā)病機制影響最廣泛的著名假說[12,13]。

表6 電針對腦低灌注大鼠海馬BACE1濃度及Aβ1-42表達的影響（±s）Tab.6 The effect of EA on the BACE1 concentration and the expression of Aβ1-42 in hippocampus with CCH rats（±s）

表6 電針對腦低灌注大鼠海馬BACE1濃度及Aβ1-42表達的影響（±s）Tab.6 The effect of EA on the BACE1 concentration and the expression of Aβ1-42 in hippocampus with CCH rats（±s）

注：與假手術(shù)組比較，☆☆P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note:Compared with sham operation group,☆☆P＜0.01;compared with model group,★P＜0.05,★★P＜0.01.

9.42±1.78 25.21±3.03☆☆17.48±3.99★13.87±2.46★★組別 n BACE1（pg/ml） Aβ1-42陽性細胞數(shù)(個/視野)假手術(shù)組模型組藥物組電針組5 5 5 5 154.79±3.57 194.21±3.23☆☆174.67±2.98☆☆★★179.27±3.28☆☆★★

圖2 海馬CA1區(qū)Aβ1-42免疫組化染色(400)Fig.2 Immunohistochemical of Aβ1-42 in the hippocampal CA1(400)

研究證實[14]，由遺傳因素所致的AD病例不足5%，而絕大多數(shù)AD患者為散發(fā)性，年齡是其主要的風險因素（60歲以上）。散發(fā)性AD的確切病因依然不明，許多風險因素均可觸發(fā)本病。大量的證據(jù)[15-17]表明腦血管疾病及其風險因素與AD密切相關(guān)；流行病學研究顯示腦缺血可增加AD的發(fā)病率，而且腦缺血風險因素同樣可增加AD的發(fā)病風險；大多數(shù)AD患者在學習記憶出現(xiàn)缺陷之前均經(jīng)歷過血管性腦缺血或卒中打擊。隨著現(xiàn)代神經(jīng)影像學技術(shù)的迅猛發(fā)展，為準確觀測局部微循環(huán)在AD病理進展過程中的變化提供了新機遇[18]，大量相關(guān)研究提示[19-20]，腦血管功能障礙是AD病理機制的早期事件，CBF的降低出現(xiàn)在AD病理發(fā)生的早期甚至更早，且其降低的幅度與癡呆的嚴重程度相關(guān)。因此可以推斷，局部腦缺血是AD發(fā)病機制的重要啟動子（增強劑），而非AD病理改變的結(jié)局。而且，腦缺血可損害認知功能并加劇Aβ誘導的認知缺陷。

腦血流量(CBF)是指動脈血液對腦組織毛細血管床的灌注速率，其衡量指標為血液毫升數(shù)/每100克腦組織/每分鐘[21]。CBF和局部神經(jīng)活動、新陳代謝密切相關(guān)，即所謂神經(jīng)血管耦聯(lián)，因此CBF是反應(yīng)腦功能的替代指標[22]。新近神經(jīng)影像學研究表明，CBF在AD患者相關(guān)腦區(qū)下降且低灌注是AD臨床（癥狀出現(xiàn)）前敏感指標[23]。大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2-vessel occlusion,2-VO)模型被廣泛用于CCH所致的認知功能損害相關(guān)研究，2-VO模型可導致皮質(zhì)總體CBF以及海馬CBF分別下降為對照水平的35%～45%和60%，而空間學習和記憶也隨之受到明顯損害[24]。本實驗采用激光多普勒組織血流儀對各組動物造模前、后及干預(yù)后大腦rCBF分別進行了監(jiān)測，結(jié)果顯示電針與藥物干預(yù)均可顯著改善模型動物rCBF，與此相應(yīng)，模型動物的空間學習、記憶能力也得以顯著地改善。

Aβ是老年斑的主要組成部分，可通過多種途徑產(chǎn)生神經(jīng)毒性誘導神經(jīng)細胞凋亡、損傷；人體內(nèi)Aβ最常見的亞型是 Aβ1-40和 Aβ1-42，其中Aβ1-42的毒性更強，更易聚集，從而形成Aβ沉淀的核心，引發(fā)神經(jīng)毒性作用[25]。研究證實[1]104CCH可導致中樞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激進而影響Aβ的代謝并誘導其在腦組織沉積，而Aβ的沉積又可加重膠質(zhì)細胞反應(yīng)性產(chǎn)生炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，并進一步加重腦低灌注狀態(tài)，這種惡性循環(huán)進而誘導相關(guān)腦區(qū)如海馬神經(jīng)元的損傷，導致大鼠空間學習記憶能力受損。

星形膠質(zhì)細胞[26]主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中數(shù)目最多、極為重要的一類細胞；星型膠質(zhì)細胞參與腦缺血、缺氧的病理損傷過程，并在其中發(fā)揮雙重作用，在生理情況下其能營養(yǎng)保護神經(jīng)元，而在病理情況下其長期、過度活化后可介導神經(jīng)元凋亡和壞死。星形膠質(zhì)細胞對腦缺血、缺氧反應(yīng)敏感，能快速活化，參與免疫與炎癥反應(yīng)，還可促進Aβ的沉積[27]。新近有研究證實[28-29]，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞在AD的病理發(fā)展過程起著關(guān)鍵作用，其通過合成、分泌TNF-α，作用于表達于神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞自身的TNF-α受體（TNFR），激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB啟動APP和BACE1的表達；同時大量分泌、釋放的TNF-α可刺激BACE1的活性，導致最具神經(jīng)毒性肽Aβ1-42的生成。而抑制星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性、降低其TNF-α合成與分泌，可顯著降低APP、BACE1的表達、抑制BACE1的活性，減少Aβ1-42的生成。本實驗證實，伴隨著腦血流的持續(xù)低灌注狀態(tài)，模型大鼠海馬CA1區(qū)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞（GFAP陽性）數(shù)量及海馬TNF-α含量均顯著升高，與之相應(yīng)的Aβ1-42陽性細胞亦較假手術(shù)大鼠顯著增多，同時模型大鼠空間學習與記憶能力出現(xiàn)顯著的下降。

美滿霉素是四環(huán)素的二代衍生物，大量研究證實其具有抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損傷以及降低BACE1表達并抑制其活性進而減少Aβ生成等，發(fā)揮著廣泛的神經(jīng)細胞保護作用[30]。因此，本實驗采用美滿霉素作為陽性對照，探討電針干預(yù)的作用及其可能的作用機制。既往本研究團隊及其他研究者證實[6,31]899，針灸對CCH所致的認知功能障礙及術(shù)后認知功能障礙等方面有良好的干預(yù)效果，可以在多水平、多層次通過多個靶點來改善慢性腦供血不足大鼠學習記憶能力。本實驗結(jié)果表明，電針干預(yù)與美滿霉素作用相仿，可提高CCH大鼠局部腦血流量、抑制星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性及其相關(guān)的TNF-α含量，抑制BACE1的表達與活性，減少Aβ1-42的生成，改善大鼠的空間學習、記憶能力。

本研究結(jié)果提示，電針作用機制可能通過改善局部腦血流，抑制星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性、降低BACE1表達、調(diào)節(jié)Aβ的腦內(nèi)代謝、改善海馬微環(huán)境，從而抑制其對神經(jīng)細胞的損傷作用，增強海馬神經(jīng)的重塑能力，進而改善CCH所致的學習記憶損害而實現(xiàn)的。

References:

[1]Zhao Y,Gong C X.From Chronic Cerebral Hypoperfusion to Alzheimer-Like Brain Pathology and Neurodegeneration[J].Cell Mol Neurobiol,2015，35(1):101-110.

[2]Wang XQ,Chen PJ.Population ageing challenges health care in China[J].Lancet,2014，383(9920):870.

[3]Huang Y,Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies[J].Cell,2012，148(6):1204-1222

[4]Yan R,Vassar R.Targeting the β secretase BACE1 for Alzheimer's disease therapy[J].Lancet Neurol,2014，13(3): 319-329.

[5]Daulatzai MA.Cerebral hypoperfusion and glucose hypometabolism:Key pathophysiological modulators promote neurodegeneration,cognitive impairment,and Alzheimer's disease[J].J Neurosci Res,2017，95(4):943-972.

[6]葉雷,劉喆,馮培培,等.電針對POCD模型中老齡大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸及認知功能的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2014,38(7):894-899.YE Lei,LIU Zhe,FENG Peipei,etal.EffectofElectroacupuncture on Middle-aged and Elderly POCD Rats’HPA Axis and Cognitive Function[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2014,38(7):894-899.

[7]Han D,Liu Z,Wang G,et al.Electroacupuncture Improves Cognitive Deficits through Increasing Regional Cerebral Blood Flow and Alleviating Inflammation in CCI Rats[J].Evid Based Complement Alternat Med,2017，2017:5173168.

[8]李忠仁.實驗針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:327. LI Zhongren.Experiment Acupuncture Science[M].Beijing: China Traditional Medicine Press,2003:327.

[9]Vorhees CV,Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc,2006，10(2):848-858.

[10]Bloom DE,Chatterji S,Kowal P,et al.Macroeconomic implications of population ageing and selected policy responses[J].Lancet,2015，385(9968):649-657.

[11]Robakis NK.Are Abeta and its derivatives causative agents or innocent bystanders in AD[J].Neurodegener Dis, 2010，7(3):32-37.

[12]Marchesi VT.An alternative interpretation of the amyloid Abeta hypothesis with regard to the pathogenesis of Alzheimer's disease[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005，102(26):9093-9098.

[13]Tanzi RE,Bertram L.Twenty years of the Alzheimer's disease amyloid hypothesis:a genetic perspective[J].Cell, 2005，120(4):545-555.

[14]Querfurth HW,LaFerla FM.Alzheimer's disease[J].N Engl J Med,2010，362(4):329-344.

[15]Sagare AP,Bell RD,Zlokovic BV.Neurovascular dysfunction and faulty amyloid β-peptide clearance in Alzheimer disease[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2012，2(10):11452.

[16]Kelleher RJ,Soiza RL.Evidence of endothelial dysfunction in the developmentofAlzheimer's disease:Is Alzheimer's a vascular disorder[J].Am J Cardiovasc Dis, 2013，3(4):197-226.

[17]Di Marco LY,Venneri A,Farkas E,et al.Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles[J].Neurobiol Dis,2015，82（6）:593-606.

[18]Montagne A,Nation DA,Pa J,et al.Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease[J].Acta Neuropathol,2016，131(5):687-707.

[19]Pluta R1,Jab?oński M,Ulamek-Koziol M,et al.Sporadic Alzheimer's disease begins as episodes of brain ischemia and ischemically dysregulated Alzheimer's disease genes[J].Mol Neurobiol,2013，48(3):500-515.

[20]Hays CC,Zlatar ZZ,Wierenga CE.The Utility of Cerebral Blood Flow as a Biomarker of Preclinical Alzheimer's Disease[J].Cell Mol Neurobiol,2016，36(2):167-179.

[21]Zhang N,Gordon ML,Goldberg TE.Cerebral blood flow measured by arterial spin labeling MRI at resting state in normal aging and Alzheimer’s disease[J].Neurosci Biobehav Rev,2017，72:68-175.

[22]Vestergaard MB,Lindberg,Aachmann-Andersen NJ.A-cute hypoxia increases the cerebral metabolic rate-a magnetic resonance imaging study[J].J Cereb Blood Flow Metab,2016，36(6):1046-1058.

[23]Iturria-Medina Y,Sotero RC,Toussaint PJ,et al.Early role of vascular dysregulation on late-onset Alzheimer's disease based on multifactorial data-driven analysis[J].Nat Commun,2016，24（7）:11934.

[24]Farkas E,Luiten PG,Bari F.Permanent,bilateral common carotid arteryocclusion in therat:amodelfor chronic cerebral hypoperfusion-related neurodegenerative diseases[J].Brain Res Rev,2007,54(1):162-180.

[25]Ballard C,Gauthier S,Corbett A,et al.Alzheimer's disease[J].Lancet,2011，377(97):1019-1031.

[26]Sofroniew MV,Vinters HV.Astrocytes:biology and pathology[J].Acta Neuropathol,2010,119(1):7-35.

[27]Osborn LM,Kamphuis W,Wadman WJ,et al.Astrogliosis:An integral player in the pathogenesis of Alzheimer's disease[J].Prog Neurobiol,2016，144:121-41.

[28]Cheng X,Shen Y,Li R.Targeting TNF:a therapeutic strategy for Alzheimer's disease[J].Drug Discov Today,2014，19(11):1822-1827.

[29]Decourt B,Lahiri DK,Sabbagh MN.Targeting Tumor Necrosis Factor Alpha for Alzheimer's Disease[J].Curr Alzheimer Res,2017，14(4):412-425.

[30]Budni J,Garcez ML,de Medeiros J,et al.The Anti-Inflammatory Role of Minocycline in Alzheimer′s Disease[J]. Curr Alzheimer Res,2016，13(12):1319-1329.

[31]Dong WG,Wang F,Chen Y,et al.Electroacupuncture Reduces Aβ Production and BACE1 Expression in SAMP8 Mice[J].Front Aging Neurosci,2015，27（7）:148-149.

Electroacupuncture Improves Cognitive Dysfunction Through Regulating the Reactive Astrocytes and Metabolism of β-amyloid in Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion

ZHANG Qiaoling,HU Wenying,YIN Jie,et al Zhejiang University of Chinese Medicine Third Clinical Medical School, Hangzhou(310053),China

[Objective]To observe the effect of EA on the ability of learning and memory of chronic cerebral hypoperfusion(CCH）rats,and to explore its adjustment on β-amyloid(Aβ）mechanism.[Method]The rats models of CCH induced by ligation of bilateral common carotid arteries(2-V0）were randomly divided into sham operation group,model group,drug group and EA group.Stimulating their acupoints Baihui and Dazhui point with electroacupuncture (EA)treatment for 30 days；Using laser Doppler flowmeter observed differences in each group(before&after surgery and after treatment)time on regional cerebral blood flow(rCBF)changes in the evaluation model and improvement of rCBF due to the EA；Using Morris water maze observed groups of spatial learning and memory ability in rats;A change in the concentration of TNF-α and BACE1 was detected by Elisa method;Using immunohistochemical method to detect Aβ positive cells in the hippocampal CA1 area.[Result]The situation of rCBF improved compared with sham operation group,the rCBF of model group remained low perfusion levels,and the drug group,EA group rose in rCBF(P<0.01);the situation of MWM improved compared with model group,the average evasive latency of the drug group and the EA group was shortened(P＜0.05 or P＜0.01),the target quadrant swimming time was evidently increased also(P<0.01);the situation of Elisa improved compared with sham operation group,the TNF-α and BACE1 of the model group,the drug group,and the EA group were significantly elevated(P＜0.05 or P＜0.01),compared with the model group,the TNF-α and BACE1 of the drug group and the EA group were significantly lower(P＜0.05 or P＜0.01);immunohistochemical stain displayed that compared with the model group,drug group,EA group hippocampal CA1 reduced Aβ-positive cells and GFAP-positive cells(P<0.05 or P＜0.01).[Conclusion]The increase in the number of Hippocampal reactive astrocytes because of persistent low brain perfusion,and the increase in proinflammatory cytokines,stimulating the expression of BACE1,which in turn stimulates the production of amyloid-β,may be a major pathogenesis of CCH for cognitive impairment;The needle improves local cerebral blood flow,inhibits hippocampal inflammation and the expression of BACE1,which in turn reduces the production of amyloid-β,may be one of the mechanisms by which it improves cognitive impairment in rats with chronic low brain perfusion.

chronic cerebral hypoperfusion;Aβ metabolism;reactive astrocytes;electroacupuncture;cognitive dysfunction

R331

A

1005-5509（2017）08-0644-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.08.002

2017-04-12）

浙江省自然科學基金（LY16H270004，LY13H270012，Y205389）；浙江省科技創(chuàng)新團隊項目（2013TD15）；2016年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610344014）；浙江省大學生科技創(chuàng)新項目（2016R410024）Fund projects:Supported by Zhejiang ProvincialNaturalScience Foundation ofChina(LY16H270004，LY13H270012，Y205389）；Key Science and Technology Innovation Team of Zhejiang Province(2013TD15)；College students' innovative entrepreneurial training program of national level in 2016(201610344014)；College students'innovative entrepreneurial training program of Zhejiang Province（2016R410024）

劉喆，E-mail：ssrsliu@163.com