胡艷紅，陳 勝，胡 俊，李 穎，李四化，林淑娜，馮春燕，柯發(fā)杰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州350003）

羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜抑制兔后發(fā)性白內(nèi)障的實驗研究

胡艷紅，陳 勝，胡 俊，李 穎，李四化，林淑娜，馮春燕，柯發(fā)杰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州350003）

目的：探討羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜防治后發(fā)性白內(nèi)障的有效性和安全性。方法：將16只（32只眼）新西蘭白兔分別行超聲乳化透明晶狀體吸除術(shù)，并隨機(jī)均分為4組：A組植入人工晶體襻上固定有載藥量為50 μg羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜，B組植入人工晶體襻上固定有不含姜黃素的空白緩釋藥膜，C組植入人工晶體術(shù)畢后前房內(nèi)注入20 mg/L姜黃素溶液，D組植入不含藥膜的人工晶體；術(shù)后行裂隙燈顯微鏡檢查，評價結(jié)膜充血、角膜水腫、前房閃輝、后發(fā)性白內(nèi)障等，術(shù)后12 w對術(shù)眼行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：術(shù)后C組炎癥反應(yīng)最重，A組和B組相當(dāng)，但均較D組稍嚴(yán)重；術(shù)后12 w A、B、C、D組后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率分別為25%（2/8）、75%（6/8）、62.5%（5/8）、100%（8/8）；光鏡下各組角膜、虹膜、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)無明顯差異。結(jié)論：羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜植入兔眼能明顯減少后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生，且對眼內(nèi)角膜、虹膜、視網(wǎng)膜等組織無明顯毒副作用，能安全、有效地防治后發(fā)性白內(nèi)障。

后發(fā)性白內(nèi)障；姜黃素；緩釋系統(tǒng)；羧甲基殼聚糖

姜黃素是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的一種黃色色素，為酸性多酚類物質(zhì)，通常用作肉類食品著色劑和酸堿指示劑，因其安全無毒且同時具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，故在生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域尤其是腫瘤研究方面得到廣泛應(yīng)用［1-3］。課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能抑制晶狀體上皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡，可有效防治后發(fā)性白內(nèi)障［4-5］。為了進(jìn)一步進(jìn)行在體研究，本研究將姜黃素制備成羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜，將其植入兔眼觀察其對后發(fā)性白內(nèi)障的影響及其眼內(nèi)副作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 普通級新西蘭大白兔16只（32只眼），購于上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場［許可證號：SCXK（滬）2012-0011］，體質(zhì)量2.2~2.5 kg，雌雄不限，體毛整潔、光亮，健康狀況良好，雙眼正常，單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后手術(shù)。

1.1.2 實驗試劑 姜黃素粉末（純度≥98.5%，美國Sigma公司產(chǎn)品）；羧甲基殼聚糖（青島弘海生物技術(shù)有限公司）。蘇木素、伊紅均由福建中醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院病理科提供。

1.1.3 實驗儀器 ZEISS眼科手術(shù)顯微鏡（S8，德國蔡司公司）；超聲乳化儀（Signature，美國眼力健公司）；裂隙燈顯微鏡（BQ900，德國蔡司公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜的制備 取羧甲基殼聚糖（10萬分子量），加4 mL超純水完全溶漲。稱取姜黃素5 mg用0.25 g甘油溶解，然后加入羧甲基殼聚糖溶液中，混合均勻，涂布在玻璃板上，面積大小8 cm×8 cm。然后置于40℃烘箱中烘干（約1.5 h），即得橙黃色半透明柔軟薄膜，體外實驗具有一定的緩釋效應(yīng)，能很好地固定于人工晶體表面［6］。

1.2.2 實驗分組及手術(shù)方法 16只新西蘭大白兔32只眼采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組8只眼，每組均行透明晶狀體超聲乳化摘除。A組植入人工晶體襻上固定有載藥量為50 μg羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜，B組植入人工晶體襻上固定有不含姜黃素的空白緩釋藥膜，C組植入人工晶體術(shù)畢后前房內(nèi)注入20 mg/L姜黃素溶液，D組植入不含藥膜的人工晶體。術(shù)后每日術(shù)眼點妥布霉素地塞米松滴眼液，4次/d，復(fù)方托吡卡胺滴眼液，2次/d，妥布霉素地塞米松眼膏每晚1次。

1.2.3 術(shù)后術(shù)眼常規(guī)檢查 分別于術(shù)后1 d、1 w、4 w、12 w行裂隙燈顯微鏡檢查及眼壓檢查，評價結(jié)膜充血、角膜水腫、房水混濁、后囊膜混濁等情況。檢查評價標(biāo)準(zhǔn)如下：①充血分級：無充血為0級，輕度睫狀充血為1級，輕中度睫狀充血為2級，重度睫狀充血為3級。②角膜水腫分級：無角膜水腫為0級，厚度增加1/4 CT為1級，厚度增加1/3 CT為2級，厚度增加1/2 CT或以上為3級。③房水混濁分級：前房無細(xì)胞為0級，可見細(xì)胞為1級，纖維形成為2級，前房積膿為3級。④后囊膜混濁分級：后囊無混濁為0級，后囊輕度混濁能看清眼底為1級，后囊中度混濁眼底部分模糊不清為2級，后囊輕度明顯混濁眼底看不清或周邊環(huán)狀皮質(zhì)增生為3級。

1.2.4 眼內(nèi)組織病理檢查 術(shù)后12 w空氣栓塞處死兔子，取眼球立即放入10%甲醛溶液內(nèi)4℃固定4 h以上，蘇木素染色20 min，充分水洗，0.5%伊紅染色2～3 min，再脫水、透明，中性樹膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察角膜、后囊膜、虹膜、視網(wǎng)膜各組織情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計。術(shù)前術(shù)后各組眼壓的比較采用“重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析”，分析各時間點眼壓值的時間差異性，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；各組結(jié)膜充血、角膜水腫及房水混濁情況采用Kruskal-Wallis H檢驗，各組后發(fā)性白內(nèi)障發(fā)生率采用Fisher分析。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)眼眼壓及術(shù)后炎性反應(yīng)

術(shù)后1 d、1 w、4 w、12 w各組眼壓平均波動在8～17 mmHg之間，與術(shù)前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

術(shù)后第1天A、B、C、D各組兔眼炎癥反應(yīng)均較重，各兔眼均出現(xiàn)不同程度的結(jié)膜充血、角膜水腫，房水混濁，但相比之下C組炎癥反應(yīng)最重，D組最輕，A組和B組相當(dāng)，各組出現(xiàn)前房滲出物的眼數(shù)分別為：4、4、6、3只眼；但術(shù)后1 w各組炎癥反應(yīng)明顯減輕，A、B、C、D各組結(jié)膜充血、角膜水腫，房水混濁分級評定情況見表1，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組兔眼術(shù)后1 w結(jié)膜充血、角膜水腫及房水混濁情況（眼數(shù)）

2.2 術(shù)眼后發(fā)性白內(nèi)障情況結(jié)果見表2。

表2 各組兔眼術(shù)后12 w晶狀體后囊膜混濁情況 （眼）

由表2可見，術(shù)后12 w A、B、C、D各組后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生率分別為25%（2/8）、75%（6/8）、62.5%（5/8）、100%（8/8），D組發(fā)病率最高，A組最低，且D組后囊膜混濁的程度最重，A組最輕（χ2= 13.070，P=0.004）。

2.3 術(shù)眼組織病理學(xué)檢查情況

術(shù)后12 w光鏡下可見D組后囊膜單層或多層成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞排列緊密，A組光鏡下后囊膜幾乎無細(xì)胞以及纖維蛋白黏附，邊緣區(qū)可見前、后囊膜之間成纖維細(xì)胞增殖到一定區(qū)域不再增殖，B、C組可見不同程度的后囊膜上片狀成纖維細(xì)胞增殖；A、B、C、D各組虹膜、睫狀體及視網(wǎng)膜均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，與正常兔眼相比未見明顯病理改變。結(jié)果見圖1。

3 討論

課題組前期大量的體外研究證明姜黃素可作為防治后發(fā)性白內(nèi)障的藥物，但如何安全有效的在體給藥成為下一步研究的重點。如果全身給藥會導(dǎo)致眼部藥物濃度太低；如果采用局部滴眼液的形式給藥，仍然達(dá)不到有效的眼內(nèi)藥物濃度；如果術(shù)中或術(shù)后直接眼內(nèi)給藥，將會因為藥物濃度偏高可能對眼內(nèi)其他組織造成影響。本研究前期將姜黃素粉末制備成一定濃度的羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜，發(fā)現(xiàn)所制備的藥膜呈橙黃色半透明柔軟薄膜，成膜性能良好，膜的可塑性強(qiáng)，可以很好地固定在人工晶體襻上，且不會影響人工晶體襻的形狀［6］。

圖1 羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜植入后眼內(nèi)各組織病理改變

本研究中術(shù)后第1天各組兔眼均出現(xiàn)不同程度炎癥反應(yīng)，但術(shù)后1 w各組炎癥反應(yīng)均明顯減輕，植入姜黃素緩釋藥膜組和空白藥膜組與不含藥膜的D組在結(jié)膜充血、角膜水腫，房水混濁分級上無明顯差異，各組虹膜、睫狀體及視網(wǎng)膜均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，與不含藥膜的D組相比未見明顯病理改變，提示姜黃素緩釋藥膜和空白藥膜均未加重兔眼術(shù)后的眼部炎癥反應(yīng)，亦未出現(xiàn)明顯的眼內(nèi)排斥反應(yīng)，羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜是一種理想的藥物載體。一方面可能與藥物載體羧甲基殼聚糖具有水溶性、膠凝性、促滲透性、生物相容性和可降解性等特點有關(guān)［7］；另一方面也與姜黃素本身安全無毒有關(guān)［8］。而注入姜黃素溶液的C組表現(xiàn)為較重的眼部炎癥反應(yīng)，這可能是短時間內(nèi)前房內(nèi)高濃度藥物注入及房水滲透壓的改變從而發(fā)生嚴(yán)重的無菌性炎癥反應(yīng)，說明前房注射姜黃素的給藥方式可能不適合應(yīng)用于臨床。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)植入人工晶體襻上固定有載藥量為50 μg羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜可以有效抑制兔眼后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生，減輕后發(fā)性白內(nèi)障的嚴(yán)重程度，這可能與姜黃素能有效抑制LEC的增殖和誘導(dǎo)LEC凋亡有關(guān)［4-5］。

本研究結(jié)果顯示，羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜可抑制兔眼后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生，且對眼內(nèi)組織無明顯的毒副作用，術(shù)眼眼壓亦無異常波動，可能成為防治后發(fā)性白內(nèi)障的安全有效的給藥途徑和方法。而羧甲基殼聚糖載姜黃素緩釋藥膜眼內(nèi)的有效劑量、藥代動力學(xué)、遠(yuǎn)期的眼內(nèi)毒副作用等還有待進(jìn)一步研究。

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（編輯：翟春濤）

Experimental study of inhibition after cataract of curcumin-chitosan delivery system in rabbit

Hu Yanhong，Chen Sheng，Hu Jun，Li Ying，Li Sihua，Lin Shuna，F(xiàn)eng Chunyan，Ke Fajie
（The Second Affiliated People′s Hospital of Fujian College of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou Fujian 350003）

Objective：To discussion the carboxymethyl chitosan contained curcumin efficacy and safety on after cataract in rabbit.Methods：The 16（32 eyes）New Zealand white rabbits were performed in suction transparent lens phacoemulsification surgery and were randomly divided into four groups：A group was implanted with the IOL haptics fixed with drug loading 50 μg carboxymethyl chitosan curcumin slow release carrier film，group B implants fixed without curcumin on film with sustained release intraocular lens haptics blank，group C after intraocular lens implantation surgery in the anterior chamber injection 20 mg/L curcumin solution，D group IOL implantation without the membrane in；postoperative slit lamp microscope to evaluate conjunctival hyperemia，corneal edema，anterior chamber flare，after cataract，etc.，12 weeks for eye surgery histopathological examination.Results：Group C after inflammation heaviest，A and B groups are equivalent，but slightly harder than that in group D；12 weeks after the incidence of A，B，C，D group after cataract were 25%，75%，62.5%，100%；light microscope groups cornea，iris，retina structure was no significant difference.Conclusion：Carboxymethyl chitosan sustained-release film with curcumin contained plasticity，easy installation operation，and film with a certain release properties，although the release was faster，but enough to meet cataract extraction and intraocular lens implantation surgery use.Implanted within the eye can significantly reduce the occurrence of after cataract，and no significant side intraocular cornea，iris，retina and other tissues of side effects，safe and effective prevention and treatment of after cataract.

after cataract；curcumin；drug delivery system；carboxymethyl chitosan

R285.5

A

1671-0258（2017）04-0010-04

福建省自然科學(xué)基金項目（2014J01423）；福建省衛(wèi)生廳中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2014-ZQN-JC-31）；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥重點項目（wzhw201301）

胡艷紅，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：12212022@163.com