張利，黃敏，王婷，潘國棟，余楚純，李立群，葉金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

響應面優(yōu)化纖維素酶提取廣陳皮中橙皮苷工藝

張利，黃敏，王婷，潘國棟，余楚純，李立群，葉金玉

（深圳市味奇生物科技有限公司，廣東 深圳 518109）

為優(yōu)化纖維素酶輔助提取廣陳皮中橙皮苷的工藝條件，選定加酶量、pH值、溫度和時間為主要影響因素，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化了纖維素酶的提取條件。結果表明，纖維素酶的最佳作用條件為：加酶量0.8%，pH值3.45，溫度59℃，時間2 h，在此條件下，橙皮苷得率達到了（4.13±0.06）%，較傳統(tǒng)醇提工藝提高了11.32%。

廣陳皮；纖維素酶；橙皮苷；響應面法

陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，陳皮藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”[1]?！皬V陳皮”為茶枝柑的干燥成熟果皮，主產(chǎn)于廣東新會，是廣東十大地道藥材之一。陳皮和廣陳皮的有效成分有揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)（其中以橙皮苷為主），一般通過測定橙皮苷的含量作為評價陳皮的質(zhì)量指標。

橙皮苷屬雙氫黃酮糖苷類化合物，是陳皮的主要成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護心血管系統(tǒng)等多種藥理活性[2]，且作為天然活性物質(zhì)，其無毒副作用，可以用作食品、藥品等的天然添加劑，在食品、醫(yī)藥及日用化工行業(yè)有著廣泛的應用。目前，陳皮中橙皮苷提取常用的方法有水提法和有機溶劑浸提法。然而，陳皮中的橙皮苷幾乎被以纖維素為主構成的細胞壁所包圍，傳統(tǒng)的提取方法無法使細胞壁破裂，存在巨大的傳質(zhì)阻力，致使提取效果不理想，提取率低，資源浪費嚴重。而纖維素酶能夠作用于天然和結晶的纖維素，可將纖維素分解成寡糖或單糖。采用纖維素酶可以破壞植物細胞壁結構，使細胞壁疏松、破裂，減小傳質(zhì)阻力，有利于陳皮中橙皮苷的溶出，從而提高橙皮苷的提取率[3-5]。因此，本研究建立纖維素酶輔助提取法，并采用響應面法優(yōu)化酶解工藝，以期提高橙皮苷提取率，為進一步開發(fā)利用廣陳皮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣陳皮：廣東藥材公司中藥飲片廠；橙皮苷標準品（色譜純，批號110712）：廣州藥品檢驗所；纖維素酶（15 000 U/g）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、冰乙酸（優(yōu)級純）：天津市大茂化學試劑廠；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS-6S電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海虞龍儀器設備有限公司；JJ-1增力電動攪拌器：江蘇城西曉陽電子儀器廠；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；HS6150超聲清洗機：北京康林科技有限公司；LC-20高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 橙皮苷標準曲線的繪制

精確稱取橙皮苷標準品，用甲醇配制成濃度為0.4 mg/mL的標準溶液，作為儲備液。然后取儲備液1、2、4、6、8、10 mL，分別定容至 10 mL，使橙皮苷濃度分 別 為 0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL 的 溶液，采用高效液相色譜，繪制橙皮苷標準曲線。以橙皮苷濃度（Y）對峰面積（X）進行線性回歸，得到回歸方程 Y=5.654 36×10-8X+0，R2=0.999 2，表明橙皮苷濃度在0.04 mg/mL～0.40 mg/mL時與峰面積值的線性關系良好。

色譜條件：色譜柱為安捷倫公司ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶醋酸 ∶水=35∶4 ∶61；檢測波長：283 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.2 纖維素酶輔助提取工藝

取廣陳皮原料置于60℃恒溫干燥箱中干燥4 h，粉碎，過80目篩。準確稱取6.0 g廣陳皮粉末，按一定料液比加入蒸餾水[料液比 1∶10（g/mL）]，調(diào)節(jié)溶液pH值，然后加入纖維素酶在一定溫度下反應一段時間。酶解反應結束后，在本課題組醇提結果的基礎之上，加入乙醇繼續(xù)提取 [提取條件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度65%、溫度83℃、提取時間2 h]，冷卻，抽濾，洗滌濾渣，合并濾液與洗液，采用高效液相色譜儀分析檢測提取液中的橙皮苷。根據(jù)橙皮苷標準曲線得出提取液中橙皮苷的含量，并按下式計算廣陳皮橙皮苷得率：

1.3.3 單因素試驗

根據(jù)試驗設計，按照不同的加酶量、pH值、溫度、時間進行廣陳皮中橙皮苷的纖維素酶法輔助提取，以橙皮苷得率為指標，確定最佳酶解條件。

1.3.4 響應面分析法優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用響應面設計，運用Box-Behnken試驗設計原理，選定加酶量、pH值、溫度、時間為因素，以橙皮苷得率為響應值，設計四因素三水平的響應面分析試驗確定纖維素酶法輔助提取的最佳條件。并使用Design-Expert 7.0.1.0軟件對設計方案中每次試驗獲得的響應值進行多維非線性回歸分析，求出多元二次方程的系數(shù)，方程擬合的質(zhì)量用回歸系數(shù)R2表示，其統(tǒng)計顯著性用F-檢驗法進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 加酶量對橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至4.5，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的纖維素酶在50℃下反應2 h。酶解反應結束后加入乙醇繼續(xù)提取（提取條件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度65%、溫度83℃、提取時間2 h），冷卻，抽濾，測定提取液中的橙皮苷，考察不同加酶量對橙皮苷得率的影響，結果見圖1。

由圖1分析可知，隨著加酶量的增加，橙皮苷得率增加，但當加酶量達到0.8%后，橙皮苷得率隨著加酶量的增加反而下降。這是因為陳皮作為固體底物，不能充分擴散到溶液中，導致酶與底物的接觸面積受到限制。在較低的酶濃度下，酶與底物尚可較充分地結合；隨著酶濃度的升高，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制[6]。因此，對一定的底物濃度均存在一個最佳酶用量，試驗選擇適宜加酶量為0.8%。

圖1 加酶量對橙皮苷得率的影響Fig.1 Influence of enzyme amount on the yield of hesperidin

2.2 pH值對橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值分別為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，加入 0.8%的纖維素酶在50℃下反應2 h。酶解反應結束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測定提取液中的橙皮苷，考察不同pH值對橙皮苷得率的影響，結果見圖2。

圖2 pH值對橙皮苷得率的影響Fig.2 Influence of pH on the yield of hesperidin

由圖2分析可知，當溶液pH值小于3.5時，橙皮苷得率隨著pH值的增大而增大，當pH值達到3.5時橙皮苷得率達到最大值，此后橙皮苷得率逐漸下降。這是因為pH值影響酶的活性中心或與之有關的基團的解離狀態(tài)，酶解反應有著適宜的pH值，在此pH值條件下酶解催化速率最高。pH值在3.5左右時正好處于纖維素酶的最佳作用pH值區(qū)間內(nèi)，能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力，破壞細胞壁，減小傳質(zhì)阻力，促進橙皮苷的溶出[7]。因此，試驗選擇適宜pH值為3.5。

2.3 溫度對橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.5，加入 0.8%的纖維素酶，分別在 45、50、55、60、65、70℃條件下反應2 h。酶解反應結束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測定提取液中的橙皮苷，考察不同溫度對橙皮苷得率的影響，結果見圖3。

圖3 溫度對橙皮苷得率的影響Fig.3 Influence of temperature on the yield of hesperidin

由圖3分析可知，在溫度低于60℃時，橙皮苷得率隨著溫度的升高而增大；溫度超過60℃時，橙皮苷得率逐漸下降。酶解反應有著適宜的反應溫度，溫度過低，酶活力也較低，不能充分發(fā)揮酶解作用效果；升高溫度增加了包括酶和底物分子在內(nèi)的溶液體系的熱能，既可使胞內(nèi)活性物質(zhì)分子運動速度加快，又能提供酶促反應所需的能量，使酶解破壁作用加強，提高橙皮苷得率；但溫度升高將使酶部分甚至全部變性，酶解反應受到抑制，導致橙皮苷得率下降。因此，試驗選擇適宜溫度為60℃。

2.4 時間對橙皮苷得率的影響

稱取6 g廣陳皮置于帶蓋的250 mL三角瓶中，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.5，加入0.8%的纖維素酶，在60℃條件下分別反應1.0、1.5、2.0、2.5、3 h。酶解反應結束后加入乙醇繼續(xù)提取2 h，冷卻，抽濾，測定提取液中的橙皮苷，考察不同提取時間對橙皮苷得率的影響，結果見圖4。

圖4 時間對橙皮苷得率的影響Fig.4 Influence of time on the yield of hesperidin

由圖4分析可知，隨著反應時間的增加，橙皮苷得率逐漸增大。隨著酶解反應的進行，廣陳皮細胞壁及細胞間層的纖維素和果膠形成的阻擋層被有效降解，橙皮苷逐漸從細胞內(nèi)擴散出來。但隨著反應的進行，細胞內(nèi)外的橙皮苷濃度達到了一種動態(tài)平衡，繼續(xù)延長提取時間對提高提取液中橙皮苷濃度的作用有限，且酶解反應產(chǎn)物濃度的積累也將抑制酶解反應的進行[8]，此外時間過長將延長生產(chǎn)周期，增加能耗，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此試驗選擇適宜時間為2 h。

2.5 響應面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取條件

為了進一步優(yōu)化纖維素酶輔助提取條件，以橙皮苷得率為響應值，應用Design-Expert 7.0.1.0軟件中的Box-Behnken設計四因素三水平的響應面分析試驗，共設計27個處理組，其中3個零水平處理組，試驗因素和水平見表1，響應面分析試驗結果見表2。

表1 試驗因素和水平Table 1 Test factors and levels

表2 試驗設計及結果Table 2 Design of experiments and results

運用Design-Expert 7.0.1.0軟件進行二次多元回歸擬合，得到橙皮苷得率（Y）對加酶量（A）、pH（B）、溫度（C）、時間（D）的回歸模型為：

Y=4.12-0.022A-0.055B-0.15C+0.12D+0.025AB+0.015AC-0.020AD-0.008BC-0.008BD+0.047CD-0.26A2-0.26B2-0.38C2-0.21D2

對該模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model

由方差分析可知，模型的F=54.37，P＜0.000 1，回歸模型達到極顯著，二次多元回歸模型成立，應用此方程可以預測橙皮苷得率及優(yōu)化酶解提取工藝。失擬分析表明，失擬項P=0.525 8＞0.05，模型失擬度不顯著，因而該模型擬合程度比較好，試驗誤差小，可以用此模型對橙皮苷提取進行分析和預測。

回歸方程的擬合程度可通過決定系數(shù)R2和R2校正值R2adj來驗證，模型的預測值與試驗真實值之間的相關性達98.45%，R2adj為0.966 4，表明在橙皮苷提取工藝研究中，該模型能解釋96.64%響應值的變化，因而該模型擬合程度良好。

一次項 C、D 和二次項 A2、B2、C2、D2的 P＜0.000 1，表明 C、D 和 A2、B2、C2、D2對橙皮苷得率的影響是極顯著的；一次項B的P＜0.05，表明B對橙皮苷得率有顯著影響。而一次項 A、交互項 AB、AC、AD、BC、BD、CD的P＞0.05，表明其對橙皮苷得率沒有顯著性影響。在試驗考察范圍內(nèi)，各因素對橙皮苷得率的影響主次順序為：溫度＞時間＞pH值＞加酶量。

運用Design-Expert 7.0.1.0軟件對表4數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線見圖5～圖10。

圖5 加酶量和pH值的交互作用Fig.5 Interactions of enzyme amount and pH

圖6 加酶量和溫度的交互作用Fig.6 Interactions of enzyme amount and temperature

圖7 加酶量和時間的交互作用Fig.7 Interactions of enzyme amount and time

從以上6組圖可以看出，橙皮苷得率隨著各因素的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但時間的減小趨勢不明顯，加酶量的變化趨勢不及pH值、溫度和時間，加酶量的影響最小。pH值、溫度和時間對橙皮苷得率的影響均很顯著，這與響應面分析結果一致。

圖8 pH值和溫度的交互作用Fig.8 Interactions of pH and temperature

圖9 pH值和時間的交互作用Fig.9 Interactions of pH and time

圖10 溫度和時間的交互作用Fig.10 Interactions of temperature and time

利用Design-Expert 7.0.1.0軟件，根據(jù)響應面試驗數(shù)據(jù)得出橙皮苷得率最高時的最佳工藝條件為：加酶量0.79%、pH3.45、溫度59.07℃、時間2.13 h。此時，響應面預測橙皮苷得率為4.15%。但考慮到實際生產(chǎn)情況，可將加酶量0.8%、pH3.45、溫度59℃、時間2 h作為最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)。在橙皮苷得率最高時對應的最佳提取條件下進行驗證試驗，得到廣陳皮中橙皮苷得率為（4.13±0.06）%（n=3），與模型的預測值基本一致。此外，采用纖維素酶輔助提取所得橙皮苷得率比傳統(tǒng)的乙醇提取工藝（橙皮苷得率為3.71%）提高了11.32%。

3 結論

為提高廣陳皮中橙皮苷的提取效率，優(yōu)化纖維素酶酶解工藝條件，以加酶量、pH值、溫度和時間為主要影響因素，以橙皮苷得率為評價指標，在單因素試驗的基礎之上，采用四因素三水平的響應面分析試驗對纖維素酶輔助提取廣陳皮中橙皮苷的工藝進行了優(yōu)化。結果表明：最佳酶解工藝條件為加酶量0.8%、pH3.45、溫度59℃、時間2 h，在此條件下測得橙皮苷得率為（4.13±0.06）%，較傳統(tǒng)醇提工藝提高了11.32%。采用響應面法確定的纖維素酶提取工藝合理，該工藝可以用于廣陳皮中橙皮苷的提取。

[1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典2015年版一部[M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191

[2] 錢俊臻,王伯初．橙皮苷的藥理作用研究進展[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(1):176-180

[3] 肖更生,萬利秀,陳于隴,等．纖維素酶-甲醇協(xié)同提取柑橘皮總黃酮的條件優(yōu)化[J]．廣東農(nóng)業(yè)科學,2012(24):97-100

[4] 曾柏全,周小芹,解西玉．纖維素酶-微波法提取臍橙皮橙皮苷工藝優(yōu)化[J]．食品科學,2010,31(4):85-89

[5] 賈亞偉,丁玉,朱紅菊．橙皮苷提取工藝研究進展[J]．中國科技論文在線,2011,6(3):211-214

[6] 蘇東林,單楊,李高陽,等．酶法輔助提取柑桔皮總黃酮的工藝優(yōu)化研究[J]．農(nóng)業(yè)工程學報,2008,24(4):240-245

[7] 吳梅林,周春山,陳龍勝,等．酶法提取銀杏黃酮類化合物研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(6):557-560

[8] 張衛(wèi)紅,張效林．復合酶法提取茶多酚工藝條件研究[J]．食品研究與開發(fā),2006,27(11):5-7

Optimization of Extraction Technology of Hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by Cellulose Using Response Surface Methodology

ZHANG Li，HUANG Min，WANG Ting，PAN Guo-dong，YU Chu-chun，LI Li-qun，YE Jin-yu
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

In order to optimize the extraction technology of hesperidin from Citri Reticulatae Pericarpium by cellulose.Enzyme amount，pH，temperature and time were selected as the main influencing factors.The extraction condition of hesperidin by cellulose was optimized by response surface methodology on the basis of single factor experiment.The result showed that the optimum extraction technology were enzyme amount of 0.8%，pH of 3.45，temperature of 59 ℃，time of 2 h.Under these conditions，yield of hesperidin reached（4.13±0.06）%，which increased by 11.32%compared with traditional alcohol extraction technology.

Citri Reticulatae Pericarpium；cellulose；hesperidin；response surface methodology

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.012

深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金（CXZZ201406251617 34122）

張利（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品、保健食品的研究與開發(fā)。