黃 強，徐 穩(wěn)，何進田，白凱文，蘇偉鵬，周 樂，張莉莉，王 恬*

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

日糧補充L-亮氨酸對超早期斷奶宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬腸道免疫功能的影響

黃 強，徐 穩(wěn)，何進田，白凱文，蘇偉鵬，周 樂，張莉莉，王 恬*

（南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

目的：研究L-亮氨酸對超早期斷奶宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）仔豬腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法：選取14 日齡斷奶的正常初生體質(zhì)量（normal birth weight，NBW）和IUGR新生仔豬各16 頭，分別飼喂基礎(chǔ)日糧或添加0.35% L-亮氨酸實驗日糧，即4 個處理組，每組8 頭豬。結(jié)果：與NBW仔豬相比，IUGR仔豬血清溶菌酶活力和補體3（complement-3，C3）水平顯著降低（P＜0.05），空腸和回腸中杯狀細胞（goblet cells，GC）和淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes，IEL）數(shù)量顯著減少（P＜0.05），回腸中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量顯著升高（P＜0.05），白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）含量顯著降低（P＜0.05）。另外，IUGR仔豬回腸TNF-α mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），IL-10 mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）。日糧添加0.35% L-亮氨酸后，IUGR仔豬血清溶菌酶活力、C3和C4水平顯著升高（P＜0.05），回腸中GC數(shù)量及十二指腸和空腸中IEL數(shù)量顯著增加（P＜0.05），回腸中IL-10含量顯著升高（P＜0.05），并且IL-2和IL-10 mRNA表達量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論：IUGR會引起超早期斷奶仔豬腸道黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)和腸道生長發(fā)育受限。L-亮氨酸可以有效緩解IUGR引起的腸道黏膜損傷，改善仔豬腸道的免疫功能。

L-亮氨酸；宮內(nèi)發(fā)育遲緩；腸道；免疫功能；早期斷奶仔豬

宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）是指胚胎或胎兒器官在母體懷孕期間生長或發(fā)育不全[1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有15.5%的IUGR新生兒，且在人類醫(yī)學上多胎兒的死亡率較高，迄今為止仍沒有很好的治療方法。同樣，在集約化養(yǎng)殖模式下，IUGR發(fā)生率也很高，例如豬作為一種多胎動物有著較高的 IUGR自然發(fā)病 率和死亡率[2]。流行病學研究表明，IUGR嬰兒和IUGR動物模型的器官發(fā)育及功能不同于正常的嬰兒或者動物，且成年后易出現(xiàn)肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血壓等代謝綜合征[3-5]。IUGR還會顯著影響新生兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能。 Contreras等[6]研究表明IUGR可降低新生兒體內(nèi)免疫細胞的數(shù)量，進而影響其細胞免疫功能。研究也發(fā)現(xiàn)，IUGR會損害小腸發(fā)育和破壞腸道結(jié)構(gòu)，降低腸道免疫功能[7]。小腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收和抗原入侵的重要場所，大量的細胞和生物活性物質(zhì)構(gòu)成了腸道黏膜的屏障，包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和微生物屏障，共同抵御抗原的入侵[8]。

亮氨酸是機體內(nèi)的必需氨基酸，也是功能性氨基酸，近年來被廣泛作為食品添加劑。針對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸能有效緩解高脂肪日糧誘導的線粒體功能紊亂、胰島素抵抗和肥胖等代謝綜合征[9]。日糧中補充亮氨酸能提高斷奶仔豬的生長性能，促進肌肉蛋白質(zhì)合成[10]。適當添加亮氨酸可以提高草魚腸道的免疫狀態(tài)、增強免疫力及相關(guān)基因的表達[11]。這些結(jié)果提示亮氨酸作為食品添加劑具有保護動物健康、保障食品安全和人類健康的研究潛力。豬是一種理想的人類醫(yī)學模型，對IUGR豬的研究不僅有助于解決養(yǎng)豬生產(chǎn)上的問題，也有助于促進人類醫(yī)學的研究。但目前有關(guān)亮氨酸對IUGR嬰兒和動物的研究還較少。因此，本實驗選擇自然發(fā)生IUGR仔豬為研究模型，考察超早期斷奶后補充L-亮氨酸對仔豬腸道免疫功能的影響，為IUGR仔豬的養(yǎng)殖和嬰兒營養(yǎng)的臨床應(yīng)用提供思路，同時也為L-亮氨酸在食品科學領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-亮氨酸（純度≥98.0%） 美國Sigma-Aldrich公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；溶菌酶（lysozyme）、補體3（complement-3，C3）、C4試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）試劑盒、IL-10試劑盒北京北方生物技術(shù)研究所；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 日本TaKaRa生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX5光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Model PRO 200 Double Insulated勻漿機 美國ProScience公司；T-6紫外-可見分光光度計 南京菲勒儀器有限公司；Nano Drop 2000超微量可見光分光光度計 美國Thermo公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設(shè)計

選取品種相同（長白×大白）、胎次和預(yù)產(chǎn)期相近的妊娠母豬16 頭，在其分娩后，選擇16 窩新生仔豬（杜洛克×長白×大白），每窩選擇1 頭正常初生體質(zhì)量（normal birth weight，NBW）仔豬（（1.52±0.06）kg）和1 頭同性別IUGR仔豬（（0.87±0.04）kg）[7]，即16 頭NBW仔豬和16 頭IUGR仔豬。采用2×2因子設(shè)計，所有新生仔L-豬隨母豬哺乳至14 日齡斷奶，然后分別飼喂基礎(chǔ)日糧或L-亮氨酸日糧（基礎(chǔ)日糧＋0.35% L-亮氨酸）并隨機分為4 組，即NC（NBW＋基礎(chǔ)日糧）組、NL（NBW＋L-亮氨酸日糧）組、IC（IUGR＋基礎(chǔ)日糧）組、IL（IUGR＋L-亮氨酸日糧）組，每組8 個重復(fù)，每個重復(fù)1 頭豬。當仔豬飼養(yǎng)至35 日齡時，每組屠宰8 頭仔豬，公母各半。宰前空腹12 h，頸部肌肉注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg，以體質(zhì)量計）麻醉致死，立即采集血樣，并迅速剖開腹腔，取出十二指腸、空腸和回腸，用生理鹽水將食糜沖凈后于4%多聚甲醛緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）中固定，待做組織切片。另外，截取相同部位的回腸一段，刮取腸黏膜，立即放入液氮速凍，－80 ℃保存供后期實驗分析?；A(chǔ)日糧配制參照美國國家研究委員會（National Research Council，NRC）（2012）修訂的豬飼養(yǎng)標準[12]，其組成及營養(yǎng)水平見表1。L-亮氨酸添加量參照本課題組和前人的研究結(jié)果[10,13]。

表 1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風干）Table 1 Ingredients and nutrient contents of diets (on an air-dry basis) %

1.3.2 動物飼養(yǎng)管理

實驗期內(nèi)仔豬每重復(fù)飼養(yǎng)于一欄，每頭豬平均占有圈舍1 m×0.6 m，自由采食和飲水，每天清掃和消毒豬舍，豬舍溫度和相對濕度分別控制在25～28 ℃和50%～ 70%之間。實驗期間斷牙、斷尾、去勢、常規(guī)補鐵與免疫等均按照豬場相關(guān)規(guī)程操作，飼養(yǎng)管理嚴格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度。

1.3.3 血清免疫指標的測定

仔豬屠宰時采集血樣，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，制備血清于－20 ℃冰箱中保存待用。血清中溶菌酶活力、C3和C4水平均嚴格按照試劑盒說明書的方法和步驟進行測定。

1.3.4 小腸黏膜上皮間杯狀細胞和淋巴細胞數(shù)量的檢測

多聚甲醛固定液中的十二指腸、空腸和回腸標本經(jīng)水洗、透明、浸蠟、包埋等處理后，在室溫條件下切成8 μm的切片，HE染色，封片。在顯微鏡下分別詳細觀察和檢測各組腸黏膜上皮柱 狀細胞間杯狀細胞（goblet cells，GC）和淋巴細胞（intraepithelial lymphocytes，IEL）的數(shù)量。具體檢測方法是：取每根腸管橫斷面，統(tǒng)計觀察5 根最長且排列整齊的絨毛，計數(shù)每100 個腸黏膜柱狀上皮細胞 間GC和IEL的數(shù)量[14]。

1.3.5 回腸黏膜細胞因子含量的測定

取200 mg回腸黏膜樣品制備20%組織勻漿液，勻漿液于4 ℃、4 000 r/min離心15 min，分離上清液待測。采用放射免疫試劑盒檢測回腸黏膜中細胞因子TNF-α、IL-2、IL-10的含量。

1.3.6 TNF-α、IL-2、IL-10 mRNA相對表達量的測定

采用Trizol試劑提取回腸黏膜中總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的完整性。使用Nano Drop 2000超微量可見光分光光度計測定總RNA的質(zhì)量濃度和純度，并用0.1%焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水稀釋到相同質(zhì)量濃度500 ng/μL。稀釋后的RNA采用20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法和步驟進行測定，反應(yīng)條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表 2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

基因引物序列見表2，由Invitrogen（上海）公司設(shè)計并合成。采用20 μL反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）體系：SYBR 10 μL、Rox Reference Dye（50×）0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、DEPC水6.8 μL和cDNA模板2 μL。RT-PCR程序為：預(yù)變性，95 ℃，30 s，1 個循環(huán)；變性，95 ℃，5 s，退火溫度60 ℃，31 s，40 個循環(huán)。每個樣品各做3 個平行。目的基因的相對表達含量以β-肌動蛋白作為內(nèi)參基因，以NC組回腸黏膜目的基因的表達為基準，使用ABI（applied biosystems）軟件檢測相關(guān)基因表達，用2－ΔΔCt方法計算各目的基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分 析

使用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型程序，采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）法確定主因素（仔豬類型（piglet）和日糧類型（diet））及其互作效應(yīng)的影響。當互作效應(yīng)P＜0.05時，采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）、鄧肯氏（Duncan）法檢測組間差異，結(jié)果用平均值表示，P＜0.05為差異顯著，0.05＜P＜0.10為有提高或降低的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 L亮氨酸對IUGR仔豬血清溶菌酶活力、C3和C4水平的影響由表3可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬血清溶菌酶活力（仔豬類型P＜0.05）和C3水平（互作效應(yīng)

表 3 L-亮氨酸對IUGR仔豬血清溶菌酶活力、C3和C4水平的影響Table 3 Effect of L-leucine on lysozyme activity and C3 and C4 levels in the serum of IUGR piglets

P＜0.05）顯著降低，而C4水平變化不顯著（互作效應(yīng)

P＜0.05）。在日糧中添加L-亮氨酸后，可使IUGR仔豬血清溶菌酶活力（日糧類型P＜0.05）、C3和C4水平（互作效應(yīng)P＜0.05）均顯著升高。另外，IUGR與L-亮氨酸對仔豬血清C3和C4水平的影響存在交互作用。

2.2 L-亮氨酸對IUGR仔豬小腸上皮間GC和IEL數(shù)量的影響

表 4 L-亮氨酸對IUGR仔豬小腸上皮間GC和IEL數(shù)量的影響Table 4 Effect of L-leucine on the number of GC and IEL in the small intestine of IUGR piglets

由表4可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸（仔豬類型P＜0.05）和回腸（互作效應(yīng)P＜0.05）中GC數(shù)量顯著減少，而十二指腸中GC數(shù)量變化不顯著（仔豬類型P＞0.05）；在日糧中添加L-亮氨酸后，可使IUGR仔豬回腸中GC數(shù)量顯著增加（互作效應(yīng)P＜0.05），而十二指腸和空腸中GC數(shù)量無顯著變化（日糧類型P＞0.05）。與NBW仔豬相比，IUGR仔豬空腸和回腸中IEL數(shù)量顯著減少（仔豬類型P＜0.05），但十二指腸中IEL數(shù)量變化不顯著（仔豬類型P＞0.05）；在日糧中添加L-亮氨酸后，IUGR仔豬十二指腸和回腸中IEL數(shù)量顯著增加（日糧類型P＜0.05），且有增加空腸中IEL數(shù)量的趨勢（日糧類型P=0.097）。另外，IUGR與L-亮氨酸對仔豬回腸中GC數(shù)量的影響存在交互作用。

2.3 L-亮氨酸對仔豬回腸黏膜中細胞因子含量的影響

由表5可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬回腸中TNF-α含量顯著升高（仔豬類型P＜0.05），IL-2含量無顯著變化（仔豬類型P＞0.05），IL-10含量顯著降低（仔豬類型P＜0.05）。日糧添加L-亮氨酸后，IUGR仔豬回腸中TNF-α含量與未添加時有降低趨勢（日糧類型P=0.051），IL-2含量無顯著變化（日糧類型P＞0.05），IL-10含量顯著升高（日糧類型P＜0.05）。另外，IUGR與L-亮氨酸對仔豬回腸黏膜中細胞因子含量的影響不存在交互作用。

表 5 L-亮氨酸對IUGR仔豬回腸黏膜中細胞因子含量的影響Table 5 Effect of L-leucine on the contents of cytokines in the ileal mucosa of IUGR piglets

2.4 L-亮氨酸對IUGR仔豬回腸基因TNF-α、IL-2、IL-10 mRNA相對表達量的影響

表 6 L-亮氨酸對IUGR仔豬回腸TNF-α、IL-2、IL-10 mRNA相對表達量的影響Table 6 Effect of L-leucine on the mRNA expression of TNF-α,IL-2 andIL-10 in the ileum of IUGR piglets

由表6可知，與NBW仔豬相比，IUGR仔豬回腸TNF-α mRNA相對表達量顯著升高（仔豬類型P＜0.05），IL-2 mRNA相對表達量有降低的趨勢（仔豬類型P=0.099），IL-10 mRNA相對表達量顯著降低（仔豬類型P＜0.05）。在日糧中添加L-亮氨酸后，與IC組相比，IUGR仔豬回腸TNF-α mRNA相對表達量有下降的趨勢（日糧類型P=0.073），IL-2和IL-10 mRNA相對表達量顯著升高（日糧類型P＜0.05）。另外，IUGR與L-亮氨酸對仔豬回腸免疫相關(guān)基因mRNA表達量的影響均不存在交互作用。

3 討 論

IUGR可導致新生兒腸道發(fā)育和屏障功能受損，并影響整個機體的免疫狀態(tài)和長期健康，許多研究者認為這種不利影響還會持續(xù)到生后甚至成年，并造成重大經(jīng)濟損失。目前對于IUGR的研究主要集中在IUGR的危害及預(yù)防措施上，通過開發(fā)有效的添加劑來提高食物中營養(yǎng)水平也是改善IUGR個體存活和健康的一條潛在途徑。機體在出生后早期，細胞生長迅速并大量增殖[15]，同時擁有較強的發(fā)育可塑性[16]，亮氨酸作為機體的必需氨基酸，其在體內(nèi)的代謝與蛋白質(zhì)合成、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)[17-18]，但目前有關(guān)亮氨酸作為食品添加劑對IUGR引起的腸道黏膜損傷和免疫功能影響的研究報道仍較少。

溶菌酶是正常機體的一種非特異性抗菌物質(zhì)，能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖。C3和C4是體內(nèi)補體系統(tǒng)的重要組成部分，參與機體的保護性免疫應(yīng)答和自身穩(wěn)定功能，協(xié)助抗體吞噬細胞或殺滅病原微生物，擔負機體非特異性抗感染作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，受IUGR影響，35日齡仔豬血清溶菌酶活力和C3水平顯著降低，這提示IUGR可能抑制了血液中的一些非特異性殺菌物質(zhì)，減弱了清除病原微生物的能力。吳佳捷等[19]研究也發(fā)現(xiàn)IUGR患者血清C3、C4水平顯著降低，這與本實驗結(jié)果一致。由此可見，IUGR能抑制機體非特異性免疫應(yīng)答，降低機體免疫能力。本實驗發(fā)現(xiàn)在日糧補充L-亮氨酸后，IUGR仔豬血清溶菌酶活力、C3和C4水平均顯著升高，說明L-亮氨酸作為食品添加劑可以改善IUGR仔豬的非特異性免疫功能。谷氨酰胺是亮氨酸的轉(zhuǎn)氨基產(chǎn)物，劉婷婷等[20]研究表明，日糧中添加1%谷氨酰胺能顯著提高斷奶仔豬血清溶菌酶活力及免疫球蛋白、C3和C4水平，提示亮氨酸的代謝產(chǎn)物可能參與了免疫球蛋白的合成，并激活非特異性免疫系統(tǒng)，改善腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境，減少體內(nèi)有害物質(zhì)的積累，從而增強機體免疫功能。包國強等[21]發(fā)現(xiàn)給術(shù)后胃腸道腫瘤患者注射支鏈氨基酸及谷氨酰胺，患者血清C3和C4水平顯著提高，機體免疫功能也顯著改善。

腸道黏膜免疫系統(tǒng)是腸道屏障的重要組成部分，與腸道黏膜上皮細胞相互作用，共同抵抗細菌、病毒等微生物的入侵，保護腸道健康[14]。分布在腸道黏膜上皮間的杯狀細胞能合成和分泌糖蛋白，并在黏膜表面形成一層保護膜。腸道黏膜上皮淋巴細胞是病原微生物最先遇到的免疫細胞，其數(shù)量多少與腸道吞噬或殺滅病原微生物的能力有關(guān)[22-24]。本實驗結(jié)果顯示，IUGR仔豬空腸和回腸中GC和IEL數(shù)量均顯著減少，這說明IUGR可導致腸道黏膜上皮免疫細胞凋亡增多，造成腸道黏膜的免疫屏障受損，Dong Li等[7]的研究也得出了類似的結(jié)果。在日糧中補充L-亮氨酸后，IUGR仔豬回腸中GC數(shù)量及十二指腸和空腸中IEL數(shù)量顯著增加，提示亮氨酸能抑制腸道黏膜上皮中杯狀細胞和淋巴細胞的凋亡，促進細胞的增殖，提高IUGR仔豬腸道的免疫功能。Calder[25]報道，支鏈氨基酸可以促進淋巴細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成，并對維持其他免疫細胞的功能也起到重要作用。此外，激活的磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號可促進腸道黏膜細胞的增殖和修復(fù)[26]，本實驗中L-亮氨酸對腸道黏膜上皮免疫細胞的改善作用可能與其激活PI3K信號有關(guān)，但具體機制還有待研究。

在黏膜免疫系統(tǒng)中，細胞因子對體液免疫和細胞免疫都有重要的免疫學功能，其中TNF-α、IL-2、IL-10具有廣泛的生物學活性。TNF-α是一種有效的促炎癥細胞因子，在免疫系統(tǒng)中主要發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用。IL-2可作用于T、B淋巴細胞、NK細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞，對免疫應(yīng)答具有廣泛的上調(diào)作用。IL-10是典型的抗炎癥與免疫抑制性細胞因子，主要生理功能是抑制巨噬細胞的抗原遞呈功能和抑制多種促炎癥細胞因子的產(chǎn)生。IUGR可以導致新生仔豬免疫缺陷，降低仔豬T、B淋巴細胞數(shù)量，阻礙T、B淋巴細胞的增殖及細胞因子的分泌[27]。Lindner等[28]研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)胎兒體內(nèi)細胞因子分泌會出現(xiàn)異常，且多數(shù)細胞因子在其轉(zhuǎn)錄水平會受到嚴格調(diào)控。本實驗結(jié)果表明IUGR導致仔豬回腸中TNF-α含量顯著升高，IL-10含量顯著減少，并且mRNA的表達量發(fā)生相似的變化，這與Amu[29]、Raghupathy[30]等的研究結(jié)果相似。在日糧中添加L-亮氨酸后對IUGR引起的仔豬腸道免疫缺陷起到了一定的緩解作用，回腸中TNF-α含量降低，IL-10含量得到顯著提高，并且mRNA的表達量也發(fā)生相似的變化。Simone等[31]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，高濃度支鏈氨基酸處理的膠質(zhì)細胞IL-10表達量增多，細胞吞噬能力提高。Jiang Weidan等[11]的研究表明亮氨酸主要通過抑制NF-κB，降低腸道TNF-α等促炎癥細胞因子的基因表達，促進IL-10等抗炎癥細胞因子的基因表達，從而緩解腸道炎癥反應(yīng)，這與本實驗結(jié)果較符合。這些結(jié)果提示IUGR可能會從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控仔豬腸道黏膜細胞因子的分泌，而亮氨酸對IUGR仔豬腸道的免疫功能可能有一定的改善作用，具體作用機理有待進一步研究。

4 結(jié) 論

IUGR顯著降低了仔豬血清中溶菌酶活力和C3水平，同時減少了腸道黏膜上皮內(nèi)的免疫細胞數(shù)量，引起回腸中TNF-α含量顯著升高，IL-10含量顯著降低，而且細胞因子的mRNA表達量也發(fā)生相似的變化，對腸道免疫功能造成了一定的損傷。而日糧中添加0.35% L-亮氨酸后，IUGR仔豬上述指標均能得到一定程度的改善，與正常組仔豬相比無顯著差異。結(jié)果表明：L-亮氨酸作為食品添加劑可能具有緩解IUGR引起的腸道黏膜損傷、改善超早期斷奶仔豬腸道免疫功能的重要作用。

[1] WU G, BAZER F W, WALLACE J M, et al. Board-invited review: intrauterine growth retardation: implications for the animal sciences[J]. Journal of Animal Science, 2006, 84(9): 2316-2337. DOI:10.2527/ jas.2006-156.

[2] MICHEL C L, BONNET X. Influence of body condition on reproductive output in the guinea pig[J]. Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology, 2012, 317(1): 24-31. DOI:10.1002/jez.714.

[3] GODFREY K M, BARKER D J. Fetal nutrition and adult disease[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2000, 71(Suppl 5): 224-225.

[4] ROSENBERG A. The IUGR newborn[J]. Seminars in Perinatology, 2008, 32(3): 219-224. DOI:10.1053/j.semperi.2007.11.003.

[5] LONGO S, BORGHESI A, TZIALLA C, et al. IUGR and infections[J]. Early Human Development, 2014, 90(Suppl 1): 42-44. DOI:10.1016/S0378-3782(14)70014-3.

[6] CONTRERAS Y M, XING Y, HALE M A, et al. Intrauterine growth restriction alters T-lymphocyte cell number and dual specificity phosphatase 1 levels in the thymus of newborn and juvenile rats[J]. Pediatric Research, 2011, 70(2): 123-129. DOI:10.1203/ PDR.0b013e31821f6e75.

[7] DONG Li, ZHONG Xiang, AHMAD H, et al. Intrauterine growth restriction impairs small intestinal mucosal immunity in neonatal piglets[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 2014, 62(7): 510-518. DOI:10.1369/0022155414532655.

[8] PITMAN R S, BLUMBERG R S. First line of defense: the role of the intestinal epithelium as an active component of the mucosal immune system[J]. Journal of Gastroenterology, 2000, 35(11): 805-814. DOI:10.1007/s005350070017.

[9] LI H, XU M, LEE J, et al. Leucine supplementation increases SIRT1 expression and prevents mitochondrial dysfunction and metabolic disorders in high-fat diet-induced obese mice[J]. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism, 2012, 303(10): 11-19. DOI:10.1152/ajpendo.00198.2012.

[10] XU Wen, BAI Kaiwen, HE Jintian, et al. Leucine improves growth performance of intrauterine growth retardation piglets by modifying gene and protein expression related to protein synthesis[J]. Nutrition, 2016, 32(1): 114-121. DOI:10.1016/j.nut.2015.07.003.

[11] JIANG Weidan, DENG Yuping, LIU Yang, et al. Dietary leucine regulates the intestinal immune status, immune-related signalling molecules and tight junction transcript abundance in grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Aquaculture, 2015, 444: 134-142. DOI:10.1016/j.aquaculture.2015.04.005.

[12] National Research Council. Nutrient requirement of swine[C]. 11th revised ed. Washington (DC): National Academy Press, 2012: 210-211.

[13] YIN Yulong, YAO Kang, LIU Zhaojin, et al. Supplementing L-leucine to a low-protein diet increases tissue protein synthesis in weanling pigs[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1477-1486. DOI:10.1007/s00726-010-0612-5.

[14] 石玉祥, 閆金坤, 王雪敏. 枸杞多糖對小鼠腸道上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量、分布及對IL-2水平影響[J]. 食品科學, 2011, 32(13): 318-320.

[15] WHITTEMORE C T, TULLIS J B, EMMANS G C. Protein growth in pigs[J]. Animal Production, 1988, 46(3): 462-462. DOI:10.1017/ S0003356100019048.

[16] GODFREY K M, GLUCKMAN P D, HANSON M A. Developmental origins of metabolic disease: life course and intergenerational perspectives[J]. Trends in Endocrinology & Metabolism, 2010, 21(4): 199-205. DOI:10.1016/j.tem.2009.12.008.

[17] PEDROSO J A B, NISHIMURA L S, MATOS-NETO E M D, et al. Leucine improves protein nutritional status and regulates hepatic lipid metabolism in calorie-restricted rats[J]. Cell Biochemistry and Function, 2014, 32(4): 326-332. DOI:10.1002/cbf.3017.

[18] KONASHI S, TAKAHASHI K, AKIBA Y. Effects of dietary essential amino acid defi ciencies on immunologic variables in broiler chickens[J]. British Journal of Nutrition, 2000, 83(4): 449-456.

[19] 吳佳捷, 曾文潔, 陳朝暉, 等. 抗心磷脂抗體與原因不明胎兒宮內(nèi)生長遲緩的關(guān)系[J]. 湖南醫(yī)科大學學報, 1999, 24(1): 65-67. DOI:10.3321/j.issn:1672-7347.1999.01.020.

[20] 劉婷婷, 張帥, 鄧斐月, 等. 谷氨酰胺與丁酸梭菌對斷奶仔豬生長性能、免疫功能、小腸形態(tài)和腸道菌群的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2011, 23(6): 998-1005. DOI:10.3969/j.issn.1006-267X.2011.06.017.

[21] 包國強, 李紅梅, 何顯力, 等. 富含支鏈氨基酸和谷氨酰胺的營養(yǎng)配方對賁門癌術(shù)后早期機體免疫功能的影響[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2007, 15(8): 1158-1161. DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2007.08.044.

[22] 顧憲紅, 佘銳萍, 張宏福, 等. 斷奶對仔豬腸上皮間淋巴細胞、杯狀細胞數(shù)量的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學報, 2003, 34(3): 232-238. DOI:10.3321/j.issn:0366-6964.2003.03.006.

[23] 楊玉榮, 佘銳萍, 張日俊, 等. 大豆生物活性肽對肉雞腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞和IgA+生成細胞的影響[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報, 2006, 28(4): 412-415. DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.2006.04.011.

[24] 張玉仙, 王文利, 陳耀星, 等. 不同濃度的大蒜溶液對小鼠小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞和杯狀細胞數(shù)量的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2009(11): 106-107. DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2009.11.053.

[25] CALDER P C. Branched-chain amino acids and immunity[J]. Journal of Nutrition, 2006, 136(Suppl 1): 288-293.

[26] SHENG H, SHAO J, TOWNSEND C M, et al. Phosphatidylinositol 3-kinase mediates proliferative signals in intestinal epithelial cells[J]. Gut, 2003, 52(10): 1472-1478. DOI:10.1136/gut.52.10.1472.

[27] 鐘翔. Hsp70介導IUGR仔豬早期免疫功能損傷的機理及谷氨酰胺的營養(yǎng)調(diào)控研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2010: 59-61.

[28] LINDNER U, TUTDIBI E, BINOT S, et al. Levels of cytokines in umbilical cord blood in small for gestational age preterm infants[J]. Klinische P?diatrie, 2013, 225(2): 70-74. DOI:10.1055/s-0033-1334879.

[29] AMU S, HAHN-ZORIC M, MALIK A, et al. Cytokines in the placenta of Pakistani newborns with and without intrauterine growth retardation[J]. Pediatric Research, 2006, 59(2): 254-258. DOI:10.1203/01.pdr.0000196332.37565.7d.

[30] RAGHUPATHY R, AL-AZEMI M, AZIZIEH F. Intrauterine growth restriction: cytokine profiles of trophoblast antigen-stimulated maternal lymphocytes[J]. Clinical and Developmental Immunology, 2012, 2012(1): 579-590. DOI:10.1155/2012/734865.

[31] SIMONE R D, VISSICCHIO F, MINGARELLI C, et al. Branchedchain amino acids infi uence the immune properties of microglial cells and their responsiveness to pro-infi ammatory signals[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2013, 1832(5): 650-659. DOI:10.1016/ j.bbadis.2013.02.001.

Effect of Dietary L-Leucine Supplementation on Intestinal Immune Function in Ultra-Early Weaned Piglets with Intrauterine Growth Retardation

HUANG Qiang, XU Wen, HE Jintian, BAI Kaiwen, SU Weipeng, ZHOU Le, ZHANG Lili, WANG Tian*
(College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Objective: To ascertain the effect of dietary leucine supplementation on intestinal immune function in ultra-early weaned piglets suffering from intrauteri ne growth retardation (IUGR). Methods: Sixteen normal birth weight (NBW) piglets weaned at 14 days of age and sixteen IUGR newborn piglets were selected according to their birth weight. All the piglets were randomly divided into four groups with 8 replicates in each group, and fed control diet alone or supplemented with 0.35% L-leucine for 21 days, respectively. Results: Compared with NBW piglets, IUGR piglets showed signifi cantly lower lysozyme activity and complement-3 (C3) level in the serum (P ＜ 0.05), a signifi cant reduction in the number of goblet cells (GC) and intraepithelial lymphocytes (IEL) in the jejunum and ileum (P ＜ 0.05) and interleukin-10 (IL-10) content in the ileum, and a sign ifi cant increase intumor necrosis factor-α (TNF-α) c ontent in the ileum (P ＜ 0.05). In addition, IUGR piglets had signifi cantly increased TNF-α mRNA expression but signifi cantly decreased IL-10 mRNA expression (P ＜ 0.05). Dietary supplementation with 0.35% L-leucine signifi cantly increased lysozyme activity and the levels of C3 and C4 in the serum, the numbers of GC in the ileum and IEL in the duodenum and jejunum, IL-10 content in the ileum, and the mRNA expression of IL-2 and IL-10 in the ileum of IUGR piglets (P ＜ 0.05). Conclusion: IUGR could induce intestinal mucosal infi ammatory response and hinder intestinal growth and development in early weaned piglets. L-Leucine could effectively alleviate intestinal mucosal injury caused by IUGR, and improve intestinal immune function in piglets.

L-leu cine; intrauterine growth retardation (IUGR); intestine; immune function; early weaned piglets

10.7506/spkx1002-6630-201717030

TS202.3

A

1002-6630（2017）17-0184-06

黃強, 徐穩(wěn), 何進田, 等. 日糧補充L-亮氨酸對超早期斷奶宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬腸道免疫功能的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 184-189. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717030. http://www.spkx.net.cn

HUANG Qiang, XU Wen, HE Jintian, et al. Effect of dietary L-leucine su pplementation on intestinal immune function in ultra-early weaned piglets with intrauterine growth retardation[J]. Food Science, 2017, 38(17): 184-189. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717030. http://www.spkx.net.cn

2016-06-20

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（2012CB124703）

黃強（1991—），男，碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail：2014105070@njau.edu.cn *通信作者：王恬（1958—），男，教授，博士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail：twang18@163.com