植物乳桿菌YS-1對(duì)活性炭誘導(dǎo)小鼠便秘的預(yù)防作用

易若琨，騫 宇，王 強(qiáng)，母健菲，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067）

植物乳桿菌YS-1對(duì)活性炭誘導(dǎo)小鼠便秘的預(yù)防作用

易若琨，騫 宇，王 強(qiáng)，母健菲，趙 欣*

（重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067）

檢測(cè)植物乳桿菌YS-1（Lactobacillus plantarum YS-1，LP-YS1）對(duì)活性炭誘導(dǎo)便秘昆明小鼠的影響。結(jié)果表明LP-YS1的抗胃酸和膽鹽能力強(qiáng)于保加利亞乳桿菌。LP-YS1能抑制便秘造成的小鼠體質(zhì)量、糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量的下降。同時(shí)LP-YS1可以提高活性炭在小腸中的推進(jìn)率和縮短排出首粒黑便的時(shí)間。LP-YS1還能使便秘小鼠的胃動(dòng)素（motilin，MTL）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、P物質(zhì)（substance P，SP）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）水平提高和生長(zhǎng)抑素（somatostatin，SS）水平下降。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示LP-YS1可以上調(diào)便秘小鼠小腸組織c-Kit（干細(xì)胞因子受體）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cellline-derived neurotrophic factor，GDNF）基因的mRNA表達(dá)和下調(diào)瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因的表達(dá)。高濃度的LP-YS1顯示出更好的作用，且顯著優(yōu)于保加利亞乳桿菌。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明LP-YS1可有效緩解便秘。

植物乳桿菌；活性炭；便秘；胃動(dòng)素；內(nèi)皮素；乙酰膽堿酯酶

易若琨, 騫宇, 王強(qiáng), 等. 植物乳桿菌YS-1對(duì)活性炭誘導(dǎo)小鼠便秘的預(yù)防作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 238-243.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717039. http://www.spkx.net.cn

YI Ruokun, QIAN Yu, WANG Qiang, et al. Preventive effect of Lactobacillus plantarum YS-1 on activated carbon-induced constipation in mice[J]. Food Science, 2017, 38(17): 238-243. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717039. http://www.spkx.net.cn

牦牛酸乳是青藏高原藏族地區(qū)的一種自然發(fā)酵乳制品，牦牛酸乳含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫力的作用[1]。牦牛酸乳由于特殊的自然發(fā)酵過程，其發(fā)酵原料乳、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵器皿，特別是特殊的發(fā)酵微生物均與普通發(fā)酵酸乳有較大差異，造成牦牛酸乳具有特殊風(fēng)味及品質(zhì)[2]。本課題組對(duì)青海玉樹藏族自治州的牦牛酸乳進(jìn)行了研究，對(duì)其微生物進(jìn)行了分離鑒定，將其中一株命名為植物乳桿菌YS-1（Lactobacillus plantarum YS-1，LP-YS1），并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

每周排便次數(shù)低于3 次則被視為處于便秘狀態(tài)，當(dāng)次數(shù)低于1 次則視為嚴(yán)重便秘狀態(tài)，是一種威脅人體健康，特別是對(duì)結(jié)腸健康具有較大影響的復(fù)雜癥狀[3]。便秘通常不被視為疾病，大多數(shù)情況可以通過日常飲食和習(xí)慣的調(diào)節(jié)解除便秘[4]。通過建立動(dòng)物便秘模型可以檢測(cè)食品對(duì)便秘的生理作用，通過給小鼠灌胃活性炭使胃腸道黏膜表面被活性炭附著，導(dǎo)致消化道中含水量下降，消化液減少，引發(fā)胃腸運(yùn)動(dòng)減慢形成便秘[5]。大劑量活性炭在消化道造成排便受阻，本課題組對(duì)乳酸菌對(duì)便秘預(yù)防效果的前期研究中證實(shí)，首粒黑便排便時(shí)間、血清胃動(dòng)素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，Gas）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）、生長(zhǎng)抑素（somatostatin，SS）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、P物質(zhì)（substance P，SP）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）的水平都可作為評(píng)價(jià)乳酸菌便秘預(yù)防作用的指標(biāo)[6]。通過進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸組織中相關(guān)mRNA表達(dá)能更確切地證實(shí)乳酸菌的生理功效。

本研究以LP-YS1為對(duì)象，使用常用的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）為對(duì)照菌株，首先通過體外實(shí)驗(yàn)比較LP-YS1和LB人工胃液和膽鹽耐受性，初步了解LP-YS1對(duì)胃腸的生理活性作用，再進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究LP-YS1對(duì)便秘的活性作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)LP-YS1提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

7 周齡雌性昆明小鼠購(gòu)自于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001）。小鼠飼養(yǎng)于控溫控濕環(huán)境中（溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（50±5）%，保持每12 h調(diào)節(jié)光/暗周期，提供小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

LP-YS1由本課題組從青海玉樹自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC M 2016747）。

保加利亞乳桿菌 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP、VIP 北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTP、MLV（murine leukemia virus）逆轉(zhuǎn)錄酶美國(guó)Invitrogen公司；ROX reference Dye、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物 北京天根生化科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D550數(shù)碼相機(jī) 日本佳能公司；SevenEasy pH計(jì)瑞士梅特勒-托利多公司；iMark酶標(biāo)儀、T100梯度PCR儀 美國(guó)伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 LP-YS1耐受pH 3.0人工胃液檢測(cè)

將NaCl和胃蛋白酶溶于蒸餾水中并用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至3.0，達(dá)到NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，胃蛋白酶為0.35%，然后真空過濾去除細(xì)菌備用。將LP-YS1活化后進(jìn)行培養(yǎng)，取培養(yǎng)液 5 mL，3 000 r/min離心10 min并收集菌體，加入生理鹽水重懸成5 mL的菌懸液，將此液與人工胃液按體積比1∶9混合搖勻后37 ℃培養(yǎng)3 h，測(cè)定0、3 h時(shí)的LP-YS1活菌數(shù)（n），按公式（1）[7]計(jì)算乳酸菌耐受人工胃液的能力。

1.3.2 乳酸菌耐受膽鹽的檢測(cè)

將LP-YS1（2%的接種量）接種于含有0.0%、0.3%、0.5%、1.0%牛膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組），37 ℃培養(yǎng)24 h，以未接種LP-YS1的空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，按公式（2）[7]計(jì)算乳酸菌耐受膽鹽的能力。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

采用動(dòng)物模型建立便秘模型時(shí)由于小鼠的耐受力比大鼠弱，所以本研究采用小鼠建模；選取體質(zhì)量25 g左右昆明小鼠100 只平均分為5 組，分別是正常組、便秘對(duì)照組、LB處理組（1.0×109CFU/ kg）、LP-YS1低濃度處理組（1×108CFU/kg）和LP-YS1高濃度處理組（1×109CFU/kg）。適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后正常組和便秘對(duì)照組正常自由攝入飲食和飲水2 周；LB處理組、LP-YS1低、高濃度處理組在這2 周中除了正常自由攝入飲食和飲水外，對(duì)小鼠每日每只按劑量1×109CFU/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同）分別灌胃2 mL的LB和按劑量1×108、1×109CFU/kg灌胃2 mL的LP-YS1。2 周后除正常組小鼠外，其他4 組小鼠每日灌胃2 mL 10%活性炭溶液（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%將活性炭加入含10%阿拉伯樹膠的溶液中制成懸液），持續(xù)3 d，同時(shí)LB處理組和LP-YS1各處理組繼續(xù)灌胃相應(yīng)濃度的LB和LP-YS1菌懸液[5]。實(shí)驗(yàn)過程中每日上午9：00對(duì)測(cè)定所有小鼠的體質(zhì)量、膳食攝入量、飲水量、糞便質(zhì)量和糞便濕度。

1.3.4 活性炭小腸推進(jìn)率和首粒黑便排出時(shí)間測(cè)定

第17天灌胃活性炭溶液后對(duì)包括正常組在內(nèi)所有小鼠實(shí)施斷食24 h，但仍給予小鼠自由攝入飲水。24 h后對(duì)所有小鼠每只灌胃0.2 mL的冰活性炭溶液，30 min后每組一半小鼠（10 只）實(shí)施斷頸處死，取小鼠血漿備用，同時(shí)取小腸觀察活性炭在小鼠小腸中的推進(jìn)距距離，按公式（3）計(jì)算推進(jìn)率推進(jìn)率。每組剩余10 只小鼠繼續(xù)觀察其排出首粒黑便的時(shí)間。

1.3.5 小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平測(cè)定

將收集的小鼠血漿在4 500 r/min離心15 min，分離到的血清按試劑盒操作測(cè)定小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平。

1.3.6 RT-PCR測(cè)定小鼠小腸組織mRNA表達(dá)

表 1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of reverse transcription PCR primers used in this study

取小鼠的小腸組織粉碎后用RNAzol提取結(jié)腸組織的總RNA，然后將總RNA質(zhì)量濃度稀釋到1 μg/μL。取2 μL稀釋后的總RNA提取液，在其中依次加入1 μL的OligodT18、RNase、dNTP、MLV酶和10 μL的5×buffer，在37 ℃ 120 min、99 ℃ 4min、4℃ 3 min合成cDNA。然后以RT-PCR法擴(kuò)增小腸組織c-Kit（干細(xì)胞因子受體）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial celllinederived neurotrophic factor，GDNF）、瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）基因的mRNA表達(dá)（引物序列見表1），同時(shí)以持家基因GAPDH作為內(nèi)參，按同樣條件進(jìn)行擴(kuò)增。最后用含1%溴化乙錠瓊脂電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[8]，并使用ImageJ 1.44軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行了半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

平行實(shí)驗(yàn)3 次結(jié)果取平均值，然后使用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件采用One-way ANOVA方法分析各組數(shù)據(jù)，檢測(cè)各組間是否具有顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 LP-YS1耐受人工胃液和膽鹽的能力

表 2 乳酸菌的人工胃液和膽鹽耐受能力Table 2 Resistance of lactic acid bacteria to artifi cial gastric juice and bile salt

如表2所示，LP-YS1在pH 3.0人工胃液和膽鹽中耐受能力均高于普通保加利亞乳桿菌，且LP-YS1在pH 3.0人工胃液中耐受能力是LB的約2.5倍，而對(duì)不同含量膽鹽的耐受能力是LB的約10 倍。乳酸菌要發(fā)揮益生菌作用，需要在胃和腸道的強(qiáng)酸性條件下，到達(dá)目的地（通常是大腸）定殖并發(fā)揮其生理功效[9]。因此，為研究乳酸菌的潛在益生菌作用，建立體外虛擬模型，檢測(cè)乳酸菌的抗胃酸能力和膽酸鹽耐受能力是重要的檢測(cè)手段[10]。本研究中LP-YS1具有比LB更強(qiáng)的抗人工胃酸和膽酸鹽耐受能力，具有良好的生理活性。

2.2 LP-YS1對(duì)便秘小鼠體質(zhì)量的影響

圖 1 實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的體質(zhì)量變化Fig. 1 Body weight changes of mice during the experiment

由圖1可以看出，前2 周中各組小鼠的體質(zhì)量都呈現(xiàn)出正常的增長(zhǎng)狀態(tài)，各組之間沒有明顯差異?；钚蕴空T導(dǎo)便秘后，沒有經(jīng)過活性炭處理的正常組小鼠體質(zhì)量繼續(xù)增長(zhǎng)，其余各組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)下降，便秘對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量下降最多，高濃度LP-YS1灌胃小鼠的體質(zhì)量最接近正常組小鼠。體質(zhì)量變化是小鼠發(fā)生便秘的重要指標(biāo)，研究證實(shí)活性炭誘導(dǎo)便秘的小鼠體質(zhì)量低于正常小鼠[11]，本研究也得到相似的結(jié)果；另外，有研究證明，大鼠經(jīng)鹽酸洛派叮胺誘導(dǎo)便秘后體質(zhì)量也出現(xiàn)下降[12]，可見動(dòng)物便秘可導(dǎo)致體質(zhì)量增加緩慢。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可顯示LP-YS1對(duì)便秘造成的小鼠體質(zhì)量下降具有較好的抑制效果。

2.3 LP-YS1對(duì)小鼠排便的影響如表3所示，第1～14天各組小鼠的糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量沒有顯著差異（P＞0.05）；活性炭誘導(dǎo)便秘后，在第15～17天正常組小鼠的糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量最高，便秘對(duì)照組最低，LB和LP-YS1可以顯著緩解便秘造成的糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量下降（P＜0.05），高濃度的LP-YS1使便秘小鼠的糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量最接近正常組，顯著高于同濃度LB灌胃的小鼠（P＜0.05）。排便狀態(tài)可以明顯地體現(xiàn)便秘程度，便秘狀態(tài)中糞便質(zhì)量、糞便顆粒數(shù)和糞便含水量均是重要的糞便狀態(tài)指標(biāo)，這些指數(shù)下降表現(xiàn)出便秘程度的加重[11]。有研究表明，大鼠和小鼠在誘導(dǎo)便秘后灌胃乳酸菌可緩解便秘導(dǎo)致的糞便顆粒數(shù)和含水量減少，抑制便秘對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的影響[12-13]。本研究中乳酸菌

表 3 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的排便狀態(tài)Table 3 Defecation status of mice during the experiment

LP-YS1也可通過增加便秘小鼠的排便質(zhì)量、排便顆粒數(shù)、水分含量，起到緩解便秘的作用。

2.4 LP-YS1對(duì)活性炭推進(jìn)率的影響

activated carbon-induced constipation model mice由表4可以看出，活性炭誘導(dǎo)便秘后，乳酸菌可以增進(jìn)活性炭在小腸中的推進(jìn)距離，高濃度的LP-YS1推進(jìn)距離最大，由此產(chǎn)生的活性炭推進(jìn)率最高，顯著高于低濃度LP-YS1和LB灌胃小鼠（P＜0.05）。便秘造成腸道蠕動(dòng)頻率降低，糞便停留在腸道的時(shí)間延長(zhǎng)，造成有害細(xì)菌以糞便為食物連續(xù)繁殖，從而威脅腸道健康，加重便秘[14]?；钚蕴空T導(dǎo)小鼠便秘后小腸中活性炭推進(jìn)長(zhǎng)度和推進(jìn)率可以作為評(píng)價(jià)小腸活動(dòng)和便秘程度的指標(biāo)[6]。本研究中LP-YS1使活性炭在小鼠小腸中推進(jìn)長(zhǎng)度和推進(jìn)率均高于LB，且高濃度LP-YS1的效果更為明顯。

表 4 乳酸菌對(duì)活性炭誘導(dǎo)便秘模型小鼠胃腸道活性炭推進(jìn)率的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria on gastrointestinal (GI) transit in

2.5 LP-YS1對(duì)首粒黑便排出時(shí)間的影響

圖 2 小鼠首粒黑便排出時(shí)間Fig. 2 Time to the fi rst black stool defecation in mice

根據(jù)中醫(yī)理論中的寒積中阻致腑氣不通使用冰活性炭溶液誘導(dǎo)小鼠便秘將會(huì)導(dǎo)致首粒排便時(shí)間延遲，與臨床上寒積里實(shí)證的癥狀相似[15]。由圖2可以看出，正常組小鼠表現(xiàn)出最短的首粒黑便排出時(shí)間（88±7） min，便秘對(duì)照組的時(shí)間最長(zhǎng)，達(dá)到（231±33） min，LB、低濃度LP-YS1和高濃度LP-YS1灌胃小鼠的首粒黑便排出時(shí)間分別為（175±27）、（163±22） min和（132±16） min。便秘造成腸道運(yùn)動(dòng)減慢，糞便在腸道中滯留時(shí)間延長(zhǎng)，使首粒黑便排出時(shí)間加長(zhǎng)，越短的首粒黑便排出時(shí)間意味腸道運(yùn)動(dòng)越正常[6]。本研究中相對(duì)于便秘對(duì)照組小鼠LP-YS1可以顯著降低首粒黑便排出時(shí)間（P＜0.05），具有良好的便秘緩解作用。

2.6 LP-YS1對(duì)小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平的影響

表5顯示，正常組小鼠血清的MTL、Gas、ET、AChE、SP、VIP含量最高，SS含量最低，便秘對(duì)照組小鼠呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，LB和LP-YS1可以使這些血清指數(shù)接近正常組水平，而高濃度LP-YS1灌胃小鼠的血清水平最為接近正常組。MTL可以刺激胃蛋白酶的產(chǎn)生和促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)[16]，Gas在胃腸中具有顯著作用，能促進(jìn)胃腸分泌和胃腸運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)幽門松弛，起到緩解便秘的作用[6]。ET在血管張力穩(wěn)定性和維持基本心血管系統(tǒng)中起重要作用[17]，SS已用來刺激腸道運(yùn)動(dòng)[18]，這些作用都有助于緩解便秘。AChE可以條件肌肉收縮和黏液分泌，可以使肌肉放松從而推進(jìn)糞便排出[19]。SP也是一種有助于腸道蠕動(dòng)的物質(zhì)[20]，保持VIP在腸壁中的正常含量也是穩(wěn)定腸道功能的重要手段[21]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也體現(xiàn)出LP-YS1可以使這些血清水平盡量保持正常，緩解便秘。

表 5 乳酸菌對(duì)小鼠血清MTL、Gas、ET、SS、AChE、SP和VIP水平影響Table 5 Effect of lactic acid bacteria on serum MTL, Gas, ET, SS, AChE, SP and VIP levels in mice pg/mL

2.7 LP-YS1對(duì)小鼠小腸c-Kit和SCF基因mRNA表達(dá)的影響

圖 3 LP-YS1對(duì)小鼠小腸組織c-Kit和SCF mRNA表達(dá)的影響Fig. 3 Effects of LP-YS1 on c-Kit and SCF mRNA expression in small intestine tissue of mice

表 6 LP-YS1對(duì)小鼠小腸組織c-Kit和SCF基因mRNA表達(dá)的半定量分析Table 6 Semi-quantitative analysis of c-Kit and SCF mRNA expression in small intestine tissue of mice

RT-PCR結(jié)果顯示（圖3、表6），相對(duì)于便秘對(duì)照組LP-YS1可以顯著上調(diào)小鼠小腸中的c-Kit和SCF基因mRNA表達(dá)（P＜0.05），且高濃度的LP-YS1使c-Kit和SCF基因表達(dá)更為接近正常組小鼠。ICC（Cajal間質(zhì)細(xì)胞）是腸道慢波的起搏細(xì)胞，同時(shí)ICC在腸神經(jīng)信號(hào)傳遞中也有重要的作用，確實(shí)ICC將會(huì)影響腸胃功能[22]。研究顯示便秘患者腸道內(nèi)ICC密度比正常狀態(tài)低，將導(dǎo)致ICC與神經(jīng)遞質(zhì)的突觸后反應(yīng)降低，使ICC產(chǎn)生自發(fā)性節(jié)律性活動(dòng)慢波的作用喪失，使結(jié)腸運(yùn)動(dòng)不規(guī)則，影響腸道功能性[22-24]。c-Kit是ICC的特異性標(biāo)志物，是ICC增殖的關(guān)鍵[25]。而SCF濃度對(duì)ICC的生殖非常重要，SCF不存在的環(huán)境下ICC不能生長(zhǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示便秘小鼠結(jié)腸組織中的ICC含量較少，結(jié)腸組織中的c-Kit表達(dá)水平也下降[26]。有研究也表明，乳酸菌可以有效提高便秘小鼠腸道中的c-Kit含量，實(shí)現(xiàn)ICC的含量增加，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，緩解便秘[27]。本實(shí)驗(yàn)中便秘也造成小鼠小腸中c-Kit和SCF表達(dá)下降，LP-YS1可以有效上調(diào)c-Kit和SCF的表達(dá)（P＜0.05），將起到增加便秘小鼠腸道中ICC的作用，從而抑制便秘。

2.8 LP-YS1對(duì)小鼠小腸TRPV1、GDNF和NOS基因mRNA表達(dá)的影響

圖 4 LP-YS1對(duì)小鼠小腸組織TRPV1、GDNF和NOS基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of LP-YS1 on TRPV1, GDNF and NOS mRNA expression in small intestine tissue of mice

表 7 LP-YS1對(duì)小鼠小腸組織TRPV1、GDNF和NOS基因表達(dá)的半定量分析Table 7 Semi-quantitative analysis of TRPV1, GDNF and NOS mRNA in small intestine tissue of mice

圖4、表7顯示正常組小鼠具有最高的GDNF表達(dá)和最低的TRPV1、NOS表達(dá)，而便秘對(duì)照組小鼠的GDNF相對(duì)表達(dá)量最低，TRPV1、NOS相對(duì)表達(dá)量最高，相對(duì)于便秘對(duì)照組LB和LP-YS1均可以上調(diào)GDNF表達(dá)和下調(diào)TRPV1、NOS表達(dá)，高濃度的LP-YS1表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用。TRPV1已經(jīng)被證實(shí)與排便有密切關(guān)系，激活TRPV1可以觸發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致小腸運(yùn)動(dòng)障礙。TRPV1表達(dá)增加是腸損傷的一個(gè)顯著現(xiàn)象，由于腸胃紊亂造成腸道損傷，使便秘患者有更高的TRPV1表達(dá)[28]。GDNF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能，從而有助于修復(fù)受損的腸道，可防止便秘。便秘與腸神經(jīng)系統(tǒng)有一定關(guān)系，NO是腸神經(jīng)系統(tǒng)中一種主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，NO可導(dǎo)致平滑肌松馳，使胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，NOS陽性纖維增多將導(dǎo)致NO含量增加，從而影響腸道功能，導(dǎo)致便秘[29-30]。NOS對(duì)調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)起重要作用[31]。NO的增加能造成更嚴(yán)重的結(jié)腸動(dòng)力障礙，控制NOS可以降低NO的含量，是控制便秘的可行途徑[32]。通過調(diào)控TRPV1、GDNF和NOS表達(dá)，使腸道中的這些表達(dá)恢復(fù)正常，能緩解便秘，是乳酸菌起到便秘抑制作用的機(jī)制之一。

3 結(jié) 論

藏區(qū)牦牛酸乳分離的LP-YS1具有良好的胃酸和膽鹽耐受能力，可以有效緩解便秘造成的小鼠體質(zhì)量下降，糞便質(zhì)量、顆粒數(shù)和含水量下降，同時(shí)提高活性炭在小腸中的推進(jìn)率和縮短排出首粒黑便的時(shí)間。通過試劑盒對(duì)小鼠血清的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)LP-YS1可以使便秘小鼠的MTL、ET、SS、Gas、AChE、SP、VIP含量提高和SS水平下降。RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示LP-YS1可以上調(diào)便秘小鼠c-Kit、SCF、GDNF基因的mRNA表達(dá)和下調(diào)基因TRPV1、NOS表達(dá)。通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明LP-YS1可以有效地緩解便秘，且效果優(yōu)于常用的LB。

[1] 吳春生, 舒暢, 李鍵, 等. 牦牛酸乳中乳酸菌的研究進(jìn)展及前景展望[J].食品工業(yè), 2012, 33(9): 129-133.

[2] 吳春生, 李鍵, 騫宇, 等. 牦牛乳及牦牛酸乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究現(xiàn)狀[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2012, 35(3): 43-46.

[3] UEKI A, OTSUKA M. Life style risks of Parkinson’s disease: association between decreased water intake and constipation[J]. Journal of Neurology, 2004, 251(7): 18-23. DOI:10.1007/s00415-004-1706-3.

[4] QIAN Y, SUO H Y, DU M Y, et al. Preventive effect of Lactobacillus fermentum Lee on activated carbon-induced constipation in mice[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2015, 61(9): 272-278. DOI:10.3177/jnsv.61.131.

[5] ZHAO X, SUO H Y, QIAN Y, et al. Therapeutic effects of Lactobacillus casei Qian treatment in activated carbon-induced constipated mice[J]. Molecular Medicine Reports, 2015, 12(2): 3191-3199. DOI:10.3892/mmr.2015.3737.

[6] SUO H Y, ZHAO X, QIAN Y, et al. Therapeutic effect of activated carbon-induced constipation mice with Lactobacillus fermentum Suo on treatment[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(12): 21875-21895. DOI:10.3390/ijms151221875.

[7] 陳孝勇, 李鍵, 趙欣, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中益生性乳酸菌的體外篩選[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(4): 85-90. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.201604016.

[8] 馮霞, 趙欣. 不同容器發(fā)酵水豆豉預(yù)防CCl4誘導(dǎo)肝損傷的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(7): 338-342. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2016.07.056.

[9] MERCENIER A, PAVAN S, POT B. Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects[J]. Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(2): 175-191. DOI:10.2174/1381612033392224.

[10] 趙維俊, 呂嘉櫪, 馬強(qiáng), 等. 嗜酸乳桿菌的表面疏水性分析[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2011, 39(10): 8-11. DOI:10.3969/j.issn.1001-2230.2011.10.002.

[11] QIAN Y, ZHAO X, KAN J Q. Preventive effect of resistant starch on activated carbon-induced constipation in mice[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2013, 6(1): 228-232. DOI:10.3892/ etm.2013.1096.

[12] 彭芝榕, 劉曉梅, 倪學(xué)勤, 等. 植物乳桿菌F1208對(duì)便秘大鼠胃腸道功能的影響[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(13): 243-246. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201313051.

[13] 周曉丹, 劉愛萍, 張明, 等. 副干酪乳桿菌LC-01對(duì)便秘小鼠的通便作用[J]. 乳業(yè)科學(xué)與技術(shù), 2012, 35(5): 7-11.

[14] GIBSON G R, ROBERFROID M B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics[J]. Nutrition Research Reviews, 2004, 125(2): 1401-1412.

[15] 王嵐, 彭成. 便秘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 24(2): 174-176. DOI:10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2007.02.023.

[16] FEIGHNER S D, TAN C P, MCKEE K K, et al. Receptor for motilin identifi ed in the human gastrointestinal system[J]. Science, 1999, 284: 2184-2188. DOI:10.1126/science.284.5423.2184.

[17] PRESTON D M, ADRIAN T E, CHRISTOFIDES N D, et al. Positive correlation between symptoms and circulating motilin, pancreatic polypeptide and gastrin concentrations in functional bowel disorders[J]. Gut, 1985, 26(10): 1059-1064. DOI:10.1136/gut.26.10.1059.

[18] SOUDAH H C, HASLER W L, OWYANG C. Effect of octreotide on intestinal motility and bacterial overgrowth in scleroderma[J]. New England Journal of Medicine, 1991, 325(21): 1461-1467. DOI:10.1056/NEJM199111213252102.

[19] FURCHGOTT R F, ZAWADZKI J V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine[J]. Nature, 1980, 288: 373-376. DOI:10.1038/288373a0.

[20] TZAVELLA K, RIEPL R L, KLAUSER A G, et al. Decreased substance P levels in rectal biopsies from patients with slow transit constipation[J]. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, 1996, 8(12): 62-63.

[21] MILNER P, CROWE R, KAMM M A, et al. Vasoactive intestinal polypeptide levels in sigmoid colon in idiopathic constipation and diverticular disease[J]. Gastroenterology, 1990, 99(3): 666-675.

[22] 鄭倩, 徐華, 畢淑英. c-kit基因在慢傳輸型便秘大鼠胃腸道的表達(dá)[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2013, 22(6): 570-574. DOI:10.3969/ j.issn.1006-5709.2013.06.023.

[23] LYFORD G L, HE C L, SOFFER E, et al. Pan-colonic decrease in interstitial cells of Cajal in patients with slow transit constipation[J]. Gut, 2002, 51(4): 496-501.

[24] SALMHOFER H, NEUHUBER W L, RUTH P, et al. Pivotal role of the interstitial cells of Cajal in the nitric oxide signaling pathway of rat small intestine[J]. Cell and Tissue Research, 2001, 305(3): 331-340.

[25] FARRUGIA G. Interstitial cells of Cajal in health and disease[J]. Neurogastroenterology and Motility, 2008(Suppl 1): 54-63. DOI:10.1111/j.1365-2982.2008.01109.x.

[26] BRADING A F, MCCLOSKEY K D. Mechanisms of disease: specialized interstitial cells of the urinary tract-an assessment of current knowledge[J]. Nature Clinical Practice Urology, 2005, 2(11): 546-554. DOI:10.1038/ncpuro0340.

[27] 曹永強(qiáng), 張健, 鄭喆, 等. 干酪乳桿菌N1115發(fā)酵乳對(duì)小鼠便秘的療效[C]//乳酸菌健康及產(chǎn)業(yè)化. 第十一屆乳酸菌與健康國(guó)際研討會(huì)摘要匯編. 北京: 中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì), 2016: 67.

[28] GEPPETTI P, TREVISANI M. Activation and sensitisation of the vanilloid receptor: role in gastrointestinal infi ammation and function[J]. British Journal of Pharmacology, 2004, 141(8): 1313-1320. DOI:10.1038/sj.bjp.0705768.

[29] 孟萍, 尹建康, 高曉靜, 等. 白術(shù)對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸黏膜NO及NOS的影響[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2012, 24(2): 61-63. DOI:10.11569/wcjd.v18.i27.2884.

[30] SHAH V, LYFORD G, GORES G, et al. Nitric oxide in gastrointestinal health and disease[J]. Gastroenterology, 2004, 126(3): 903-913.

[31] 徐國(guó)萍, 范一宏, 呂賓. 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子影響腸道的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2010(27): 2884-2888. DOI:10.11569/wcjd.v18. i27.2884.

[32] TOMITA R, IGARASHI S, FUJISAKI S, et al. The effects of neurotensin in the colon of patients with slow transit constipation[J]. Hepatogastroenterology, 2007, 54(78): 1662-1666.

Preventive Effect of Lactobacillus plantarum YS-1 on Activated Carbon-Induced Constipation in Mice

YI Ruokun, QIAN Yu, WANG Qiang, MU Jianfei, ZHAO Xin* (Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,
Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food,
Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, C hina)

The aim of this study was to determine the effect of Lactobacillus plantarum YS-1 (LP-YS1) on activated carboninduced constipation in Kunming mice. The experimental results showed that anti-gastric acid and bile salt activities of LP-YS1 were stronger than that of Lactobacillus bulgaricus. LP-YS1 could inhibit the decrease in body weight, fecal weight, fecal pellet number and fecal moisture content caused by constipation in mice. Meanwhile, LP-YS1 could raise gastrointestinal (GI) transit rate and reduce the time to the fi rst black stool defecation. LP-YS1 also could increase serum motilin (MTL), endothelin (ET), acetylcholinesterase (AChE), substance P (SP), and vasoactive intestinal peptide (VIP) levels and decrease somatostatin (SS) level in constipated mice. reverse transcription polymerase chain reaction experiments revealed that LP-YS1 could raise c-Kit, stem cell factor (SCF) and glial cellline-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression and reduce transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) and nitric oxide synthase (NOS) mRNA expression in the small intestine of constipated mice. High concentration of LP-YS1 had a better effect. Based on these results, LP-YS1 could effectively inhibit constipation.

Lactobacillus plantarum; activated carbon; constipation; motilin; endothelin; acetylcholinesterase

10.7506/spkx1002-6630-201717039

TS201.4

A

1002-6630（2017）17-0238-06引文格式：

2017-01-03

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXTDX201601040）；

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（cstc2016jcyjA0339）；重慶第二師范學(xué)院科研項(xiàng)目（KY2015TBZC）

易若琨（1989—），女，助教，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：yiruokun1214@hotmail.com *通信作者：趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn