張子墨+張發(fā)宇+范帆

摘要：以實驗室培養(yǎng)的水華藍藻單種[銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，M.A）、水華微囊藻（Microcystis flos-aquae，M.F）、惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii，M.W）、魚腥藻（Anabaena sp，A.s）]以及野外新鮮水華藍藻為研究對象，通過設置不同細胞破碎方法和提取劑種類，篩選并優(yōu)化藻藍蛋白熒光分析法的前處理技術。結果表明，凍融試驗中，冷凍溫度與提取劑添加順序對藍藻細胞破碎率無顯著影響；以去離子水為提取劑時，凍融2次即可達到最佳破壁條件；在凍干試驗中，藍藻真空抽濾在濾膜上能提高藍藻細胞的破碎率；綜合比較凍融和凍干，后者對藍藻細胞的破碎效率高于前者；對比3種提取劑對藻藍蛋白的提取效率，去離子水對藻藍蛋白的提取效率最高。

關鍵詞：藻藍蛋白；銅綠微囊藻；反復凍融；冷凍干燥

中圖分類號：X835 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2921-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.031

Abstract： The cyanobacteria cultured in the laboratory（Microcystis aeruginosa，Microcystis flos-aquae，Microcystis wesenbergii and Anabaena sp） and fresh blue algae were used as the research object，by intercalating different cell disruption method. The results showed thatin freeze thawing experiments，the freezing temperature and the adding order of the extracting agent had no significant effect on the rate of breaking. Using deionized water as the extraction agent， freezed thawing two times can be used as a selection. In the freeze-drying experiment，cyanobacteria vacuum filtration can improve the crushing rate of the cyanobacteria cells. Comprehensive comparison of freeze thaw and freeze drying， the latter on cyanobacterial cell crushing efficiency was higher than that of the former. Compared with the extraction efficiency of the three extracts， the results showed that the extraction efficiency of the phycocyanin by the water was the highest.

Key words： phycocyanin；Microcystis aeruginosa；repeated freezing and thawing；freeze drying

藻藍蛋白（Phycocyanin，PC）是一種水溶性的藍藻輔助色素，具有熒光特性[1]，是水華藍藻所特有的光合色素，能夠用來表征藍藻的生物量[2]。目前，常用于檢測藻藍蛋白的分光光度法靈敏度不高，當樣品中藻藍蛋白含量為10 μg/L時，難以檢出[3]。高效液相色譜法檢測限低，靈敏度很高，但前處理過程復雜，成本高[4]。而熒光檢測法靈敏度較高，需要的樣品量少，相比較而言更經濟快捷[5]。Kasinak等[6]和Lee等[7]的研究表明用熒光法測得的藻藍蛋白濃度與藍藻生物量之間有很強的相關性。除此之外，關于藍藻活體熒光或藻藍蛋白熒光與藍藻生物量之間定量關系的研究也有較多報道[8-13]。

藻藍蛋白熒光檢測法需要對藍藻細胞進行預處理，包括藻細胞的破碎和藻藍蛋白的提取。目前，關于藍藻的破碎方法有很多，常用的有溶脹法[14]、超聲波法[15，16]、機械研磨法[2，17]和反復凍融法[18，19]等，每種方法都各有優(yōu)缺點。溶脹法操作簡單，但提取周期長；超聲波法處理少量樣品時操作簡便，液量損失少，但是超聲波作用過程中會產生大量的熱量，需結合冰浴才可進行，否則溫度過高會導致藻藍蛋白變性；機械研磨法破碎細胞效率高，但易造成樣品殘留。張靜等[19]比較不同破碎方法后，認為反復凍融法提取藻藍蛋白濃度高于其他方法，凍融法提取野外藍藻的藻藍蛋白濃度可達3.0 mg/L，而超聲波法提取藻藍蛋白濃度僅為1.0 mg/L，并且凍融法較其他方法操作簡單，沒有其他化學試劑的干擾。龐曉宇等[16]對比了Asolctin-CHAPS緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液和Tris試劑對藻藍蛋白的提取效率，得出磷酸鹽緩沖液對藻藍蛋白提取高效、經濟、易保存的結論。對于藻藍蛋白的提取效率研究中多以藻藍蛋白濃度[20，21]、吸光度比值[15，21，22]以及得率[19]來評價。

目前，鮮有關于利用凍干法來破碎藍藻細胞，提取藻藍蛋白的研究。Williams等[23]研究表明，藍藻細胞在冷凍過程中在細胞內形成冰晶，其體積比原來的增大9%～10%。在細胞內、外形成冰晶的瞬間，擠壓細胞膜的薄弱部分并使之破裂，而在真空冷凍干燥機的作用下，細胞內冰晶升華，可完全破壞細胞膜的疏水結構。此方法操作簡單，用時較短。因此，本研究以實驗室培養(yǎng)的水華藍藻和巢湖水華藍藻為研究對象，以單位藍藻細胞中提取藻藍蛋白的含量為評價指標，通過設置不同破碎方法和提取劑種類，篩選并優(yōu)化藻藍蛋白熒光分析法前處理技術，提高方法的檢測靈敏度和操作便捷性。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用藻為巢湖新鮮水華藍藻和實驗室培養(yǎng)的單種：銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，M.A）、水華微囊藻（Microcystis flos-aquae，M.F）、惠氏微囊藻（Microcystis wesenbergii，M.W）、魚腥藻（Anabaena sp，A.s），藻種取自中國科學院武漢水生生物研究所藻種庫。采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照度為2 000 lx，時間設置為12 h晝/12 h夜。

1.2 藍藻細胞破碎

取一定量實驗室培養(yǎng)的藍藻藻液，用顯微鏡計數法測定藻細胞濃度，然后用0.45 μmGF/C膜真空抽濾藻液，把抽濾后的樣品置于15 mL離心管中冷凍。樣品分為兩組，一組在室溫避光條件下解凍，另一組在預冷的冷凍真空干燥機（Biosafer-10）中凍干。為研究凍融次數對藍藻細胞破碎效率的影響，將上述凍融過程分別重復1～7次，每次設3組平行。為研究凍融和凍干對不同種類藍藻細胞的破碎效果，選用了4種實驗室培養(yǎng)的藍藻樣品：銅綠微囊藻、水華微囊藻、惠氏微囊藻和魚腥藻。為研究凍融和凍干對不同藻細胞濃度樣品的破碎效果，將銅綠微囊藻原液稀釋制備成7個濃度梯度的樣品，分別為6×107、2.4×107、1.8×107、1.2×107、6×106、3×106和1.2×106 CFU/L。為研究凍干對經不同方法處理后的藍藻細胞的破碎效果，將藍藻樣品分為兩組，一組將一定體積的藍藻真空抽濾到孔徑為0.45 μmGF/C膜上，將抽濾后的樣品置于15 mL離心管中；另一組則直接取同樣體積的藍藻于15 mL離心管中。為比較研究凍融和凍干對藍藻細胞的破碎效率，凍融或凍干結束后，將離心管中加入與抽濾前藻液等體積的去離子水，顯微鏡下計數，并計算藍藻細胞的破碎效率。研究凍融和凍干對巢湖新鮮水華藍藻破碎效果的方法與實驗室培養(yǎng)藍藻方法相同。

1.3 藻藍蛋白提取

為研究不同提取劑對藍藻蛋白的提取效率的影響，將抽濾后的藍藻分別經凍融破碎和凍干破碎后，分成3組，添加不同的提取劑：去離子水、0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L的Tris試劑；為研究提取劑添加順序對藻藍蛋白提取效率的影響，將真空抽濾后的藍藻分為兩組，一組添加提取劑之后放入冰箱冷凍，另一組按照上述的方法完成凍融后添加磷酸鹽提取劑，4 ℃下避光提取12 h，在4 ℃下、8 000 r/min離心10 min取上清液，用RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津制作所）測定提取液中藻藍蛋白熒光強度。

1.4 藻藍蛋白熒光強度的測定方法

調節(jié)熒光分光光度計的時間進程模式，設置激發(fā)波長為620 nm，發(fā)射波長為647 nm，掃描速度為Medium，采樣間隔1 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，響應時間為2 s。

1.5 藻藍蛋白濃度與提取效率計算方法

通過計算單位藍藻細胞中提取出藻藍蛋白的含量來表示提取效率，通過此方法來探究不同試驗條件下藻藍蛋白的提取效率，計算方法參照季健[24]的研究。

2 結果與分析

2.1 凍融破碎試驗

2.1.1 冷凍溫度和凍融次數對藻藍蛋白提取效率的影響 在不同冷凍溫度下，隨著凍融次數的增加，藻藍蛋白的提取效率總體呈下降趨勢（圖1）。藻藍蛋白在凍融過程中會產生不同程度的損失，2次凍融后，藻藍蛋白的提取效率可達到最大值。在不同溫度下，完成2次凍融后，單位藍藻細胞中提取出來的藻藍蛋白含量基本相同。因此，對于實驗室培養(yǎng)的單種藻，改變冷凍溫度對藻藍蛋白的提取效率沒有明顯影響。

2.1.2 不同藍藻濃度對藻藍蛋白提取效率的影響 藻藍蛋白的提取效率隨藍藻濃度增加呈對數增長趨勢（圖2），藍藻濃度小于1.8×107 CFU/L時，藻藍蛋白提取效率隨著藍藻濃度的增大而迅速增長；藍藻濃度繼續(xù)增加，藻藍蛋白提取效率增長速度下降，值為0.2 ng/cell左右。原因可能是隨著藍藻濃度的增大，濾膜上的藍藻細胞出現破碎不完全的情況，從而影響藻藍蛋白的提取效率。

2.1.3 不同種類水華藍藻和不同提取劑對藻藍蛋白提取效率的影響 圖3為凍融條件下不同種類的水華藍藻（M.A、M.F、M.W、A.s）和采用不同提取劑對藻藍蛋白提取效率的影響。由圖3可知，對于實驗室培養(yǎng)的4種藍藻，去離子水的提取效果均遠高于目前研究[15，17，25，26]中常用的磷酸鹽緩沖溶液、Tris-base試劑和Acolectin-CHAPS緩沖液；其中使用去離子水的銅綠微囊藻的藻藍蛋白提取效率最高，為0.13 ng/cell（9 538.14 μg/L）。Zimba等[25]將Acolectin（大豆磷脂）溶于CHAPS中，制成Acolectin-CHAPS（AC）緩沖液來提取隱藻和紅藻中的藻膽蛋白，提取效率在38%～80%（800～1 000 μg/L）之間。龐曉宇等[16]也提出AC緩沖溶液對藻藍蛋白的提取效率較高，但該緩沖液制備過程復雜且不宜保存，而且緩沖劑本身的顏色對試驗結果有一定影響，不宜大規(guī)模推廣應用。

2.1.4 提取劑添加順序對藻藍蛋白提取效率的影響 對于實驗室培養(yǎng)的單種藻，提取劑在凍融前添加與凍融后添加對藻藍蛋白的提取效率基本相同，兩次試驗結果均無顯著性差異（P<0.05）（圖4）。這與張靜等[20]研究結果一致，即提取劑的添加順序對實驗室培養(yǎng)的藍藻的藻藍蛋白提取效率沒有顯著影響。

2.2 凍干破碎試驗

2.2.1 不同種類的水華藍藻和不同提取劑對藻藍蛋白提取效率的影響 取實驗室培養(yǎng)的4種藍藻，真空抽濾、冷凍干燥后，分成三組，添加不同提取劑0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PB）、0.05 mol/L Tris-base試劑、去離子水。4種藍藻藻藍蛋白的提取結果與凍融試驗結果一致。4種水華藍藻中，銅綠微囊藻的藻藍蛋白提取效率最高；3種提取劑中，去離子水對單位藍藻中藻藍蛋白的提取率最大（圖5）。比較圖5和圖3可知，凍干試驗單位銅綠微囊藻細胞中最多可提取出0.28 ng藻藍蛋白，是凍融法提取效率的2.15倍。由此可推斷，同樣試驗條件下凍干法比反復凍融法對藍藻細胞破碎效率高。endprint

2.2.2 抽濾對藻藍蛋白提取效率的影響 在提取藻藍蛋白時，如何處理試驗用藻對試驗結果極其重要。由圖6可知，采用去離子水作為提取劑，把藍藻抽濾到濾膜上，在實驗室培養(yǎng)的4種水華藍藻中，藻藍蛋白的提取效率比直接取藻液進行冷凍干燥的效率要高；抽濾后，單位銅綠微囊藻細胞中提取出藻藍蛋白的含量是未抽濾的3倍。即在冷凍干燥試驗中，藻漿的含水率對藻藍蛋白提取的效率影響顯著。含水率低的藻液凍干后藍藻細胞破碎效率高于含水率高的藍藻，且凍干所用的時間短，減少了藻藍蛋白在試驗過程中的損失。由此推斷，藻液的含水率對凍干法的細胞破碎效率有一定影響。因此，藻液的最佳含水率成為提高凍干法破碎效率的重要因素。

2.2.3 不同銅綠微囊藻濃度對藻藍蛋白提取效率的影響 根據上述試驗結果可知，利用凍干法破碎藍藻時應將藍藻抽濾到0.45 μm GF/C膜上，因此，取實驗室培養(yǎng)的銅綠微囊藻，顯微鏡下計數后，將藻液稀釋至不同倍數，每組取一定體積的藻液真空抽濾到孔徑為0.45 μm GF/C膜上，冷凍后置于冷凍干燥機中凍干，以去離子水作為提取劑，提取后離心取上清液在熒光分光光度計下測定藻藍蛋白，結果如圖7所示，藻藍蛋白的提取效率隨銅綠微囊藻濃度的增大而呈對數增長趨勢，當銅綠微囊藻濃度大于3×107 CFU/L時，藍藻細胞破碎效率呈降低趨勢，因此藻藍蛋白提取效率的增長速度下降。

2.3 對比凍干與凍融對藻藍蛋白提取效率的影響

對于實驗室培養(yǎng)的藍藻，尤其是銅綠微囊藻，凍干破碎后對藻藍蛋白的提取效率明顯高于凍融；對于惠氏微囊藻和水華微囊藻，凍干和凍融后藻藍蛋白的提取效率基本一致（圖8）。對于不同濃度的銅綠微囊藻，在藍藻濃度小于2×107 CFU/L時，采用凍融破碎藍藻，藻藍蛋白的提取效率稍高于凍干；當藍藻濃度增加時，凍干得到的藻藍蛋白濃度明顯高于凍融。因此，若大規(guī)模提取藻藍蛋白時，凍干破碎干燥法優(yōu)于反復凍融破碎。

2.4 藍藻細胞破碎效率試驗

凍融破碎和凍干破碎后的藻屑在顯微鏡下觀察結果如圖9所示，圖9A是沒有進行破碎處理的原藻液，細胞呈透亮規(guī)則圓形；圖9B是凍融破碎后的藻屑，可以看出還有一部分藍藻細胞沒有破碎；圖9C是凍干破碎后的藍藻，幾乎沒有完整的細胞形態(tài)，由此可知，冷凍干燥對藍藻細胞的破壁效率高于反復凍融法，上述結論得到驗證。

2.5 可行性驗證

上述試驗結果表明，對實驗室培養(yǎng)的單種藻中藻藍蛋白的提取效率來說，去離子水的提取效率最高，凍干破碎比凍融對藍藻細胞破碎效率高。為驗證試驗方法準確性，取巢湖新鮮水華藍藻按上述方法提取野生藍藻中藻藍蛋白，結果如圖10所示。對于不同濃度的水華藍藻，不論是凍融破碎還是凍干破碎，去離子水的提取效率均高于其他兩種提取劑；且以去離子水為提取劑時，凍干的提取效率仍高于凍融。因此，由實驗室培養(yǎng)的單種藻所得出的結論對于野外藍藻來說確實可行。

3 結論

1）通過對藻屑的顯微鏡檢及控制相同試驗條件下藻藍蛋白的提取效率可知，凍干法對藍藻細胞的破碎效率高于反復凍融法。

2）控制破碎方法及其他試驗條件不變，對比去離子水、磷酸鹽溶液和Tris試劑對藻藍蛋白的提取效率發(fā)現，去離子水對藻藍蛋白的提取效率最高。

3）凍融試驗中，冷凍溫度與提取劑添加順序對藍藻細胞破碎率無顯著影響。在凍干試驗中，藍藻真空抽濾在濾膜上能提高藻藍蛋白的破碎率。

綜上所述，采用熒光檢測法測定藻藍蛋白時，高效的前處理技術不僅為在湖泊環(huán)境監(jiān)測中能實現快速準確定量藍藻的生物量提供可能，同時對藍藻水華的預防和控制也起到積極作用。

參考文獻：

[1] BRODY M，EMERSON R. The effect of wavelength intensity of light on the proportion of pigments in porphyridium cruentum[J].American Journal of Botany，1959，46（6）：433-440.

[2] HORV？魣TH H，KOV？魣CS A W，RIDDICK C，et al. Extraction methods for phycocyanin determination in freshwater filamentous cyanobacteria and their application in a shallow lake[J].European Journal of Phycology，2013，48（3）：278-286.

[3] 瞿文川，潘紅璽，蘇晨偉.紫外可見分光光度法對湖泊沉積物中的色素測定[J].分析測試技術與儀器，1995（4）：36-39.

[4] SOMA Y，TANAKA A，SOMA M，et al. Photosynthetic pigments and perylene in the sediments of southern basin of lake Baikal[J].Organic Geochemistry，1996，24（5）：553-561.

[5] 閻 榮，孔繁翔，韓小波.太湖底泥表層越冬藻類群落動態(tài)的熒光分析法初步研究[J].湖泊科學，2004，16（2）：163-168.

[6] KASINAK J-M E，HOLT B M，CHISLOCK M F，et al. Benchtop fluorometry of phycocyanin as a rapid approach for estimating cyanobacterial biovolume[J].Journal of Plankton Research，2015， 37（1）：248-257.endprint

[7] LEE T Y，TSUZUKI M，TAKEUCHI T，et al. Quantitative determination of cyanobacteria in mixed phytoplankton assemblages by an in vivo fluorimetric method[J].Analytica Chimica Acta， 1995，302（1）：81-87.

[8] BASTIEN C，CARDIN R，VEILLEUX，et al. Performance evaluation of phycocyanin probes for the monitoring of cyanobacteria[J].Journal of Environmental Monitoring，2011，13（1）：110-118.

[9] CHANG D-W，HOBSON P，BURCH M，et al. Measurement of cyanobacteria using in-vivo fluoroscopy-effect of cyanobacterial species，pigments，and colonies[J].Water research，2012，46（16）：5037-5048.

[10] 陳緯棟，王 崇，胡曉芳，等.應用熒光分析技術檢測藍藻生物量[J].凈水技術，2010（6）：80-84.

[11] KONG Y，LOU I，ZHANG Y，et al. Using an online phycocyanin fluorescence probe for rapid monitoring of cyanobacteria in Macau freshwater reservoir[J].Hydrobiologia，2014，741（1）：33-49.

[12] LEE T，TSUZUKI M，TAKEUCHI T，et al. In vivo fluorometric method for early detection of cyanobacterial waterblooms[J].Journal of Applied Phycology，1994，6（5-6）：489-495.

[13] IZYDORCZYK K，TARCZYNSKA M，JURCZAK T，et al. Measurement of phycocyanin fluorescenceas an online early warning system for cyanobacteria in reservoir intake water[J].Environmental Toxicology，2005，20（4）：425-430.

[14] AFTARI R V，REZAEI K，MORTAZAVI A，et al. Antioxidant activity optimisation of Spirulina platensis C-phycocyanin obtained from conventional，microwave-assisted and ultrasound-assisted extraction methods[J].Quality Assurance and Safety of Crops & Foods，2015，9（1）：1-9.

[15] VISKARI P J，COLYER C L. Rapid extraction of phycobiliproteins from cultured cyanobacteria samples[J].Analytical biochemistry，2003，319（2）：263-271.

[16] 龐曉宇，段洪濤，張玉超，等.富營養(yǎng)化湖泊水體中藻藍蛋白提取方法的對比[J].湖泊科學，2014，26（5）：799-806.

[17] 趙冰冰，張發(fā)宇，陳 裕，等.不同凍融條件對破壁提取巢湖水華新鮮藍藻中藻藍蛋白的影響[J].安徽農業(yè)科學，2014，42（17）：5345-5347.

[18] 高 瑾.太湖水華藍藻中藻藍蛋白的富集分離[D].江蘇無錫：江南大學，2009.

[19] 張 靜，韋玉春，王國祥，等.太湖藍藻水樣中藻藍蛋白提取方法比較[J].湖泊科學，2013，25（2）：283-288.

[20] 張 靜，韋玉春，王國祥，等.實驗條件對太湖水體中藻藍蛋白提取結果的影響[J].環(huán)境科學與技術，2012（10）：7-11.

[21] LAWRENZ E，FEDEWA E J，RICHARDSON T L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts[J].Journal of Applied Phycology，2011，23（5）：865-871.

[22] PATIL G，CHETHANA S，SRIDEVI A S，et al. Method to obtain C-phycocyanin of high purity[J].Journal of Chromatography A，2006，1127（1-2）：76-81.

[23] WILLIAMS R J，SHAW S K.The relationship between cell injury and osmotic volume reduction：II. Red cell lysis correlates with cell volume rather than intracellular salt concentration[J].Cryobiology，1980，17（6）：530-539.

[24] 季 健，孔繁翔，于 洋.太湖越冬藍藻空間分布的初步研究[J].湖泊科學，2009，21（4）：490-494.

[25] ZIMBA P V.An improved phycobilin extraction method[J].Harmful Algae，2012，17（17）：35-39.

[26] CHETHANA S，NAYAK C A，MADHUSUDHAN M C，et al. Single step aqueous two-phase extraction for downstream processing of C-phycocyanin from Spirulina platensis[J].Journal of Food Science And Technology，2015，52（4）：2415-2421.endprint