楊 婕，郭金鳳，李寶坤，盧士玲，王慶玲，董 娟，蔣彩虹，姬 華，王騰斌

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

乳酸菌為益生菌，人們常通過食用含該類活菌的制品或者含菌體組分及代謝產(chǎn)物的制品維持人體腸道內(nèi)菌群的平衡[1]，發(fā)酵乳制品因?yàn)榫哂胸S富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與良好益生作用而受到消費(fèi)者的青睞[2]，其中乳酸菌發(fā)酵劑在乳制品發(fā)酵過程中起到至關(guān)重要的作用[3]。而在發(fā)酵劑中乳酸菌的細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞活力則是影響發(fā)酵乳制品質(zhì)量的關(guān)鍵因。目前冷凍干燥技術(shù)被認(rèn)為是最有利于保持菌種活性的方法[4]，盡管使用冷凍干燥的成本較高，但能長(zhǎng)時(shí)間保持菌種的活力，便于貯藏和應(yīng)用。

在冷凍干燥過程中，乳酸菌發(fā)酵劑難以避免冷凍與干燥過程對(duì)其造成的各種損傷。低溫使得菌體內(nèi)酶活性降低以及酶發(fā)揮作用延遲，進(jìn)而可能改變代謝通路；低溫也可能降低一些代謝調(diào)節(jié)過程中的靈敏度，使代謝失衡或生長(zhǎng)停滯[14]。這些損傷使得發(fā)酵劑中菌株的存活率降低，活力下降，造成生產(chǎn)成本增加以及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。近年來(lái)常通過添加合適的保護(hù)劑，調(diào)整冷凍干燥工藝或者各種迫提高乳酸菌的存活率和活力，但是利用交叉保護(hù)提高乳酸菌在冷凍干燥過程中冷凍抗性方面的研究較少，因探究運(yùn)用交叉保護(hù)這一方法對(duì)于乳酸菌冷凍干燥活性的提高具有一定意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）ATm具有滯后時(shí)間短以及酸化速率快的特點(diǎn)[15]， 能夠縮短發(fā)酵時(shí)間、降低能耗，是1 株潛在的適合工業(yè)生產(chǎn)用的菌株，因選用該菌株為研究對(duì)象。通過比較不同迫條件下細(xì)胞的冷凍干燥存活率，研究不同迫條件影響發(fā)酵乳桿菌冷凍干燥后活性的差異性，為高活性乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳由新疆花園乳業(yè)提供；發(fā)酵乳桿菌ATm為石河子大學(xué)畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選分離，NCBI登錄號(hào)為KY310724。

MRS培養(yǎng)基、固體MRS培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博技術(shù)生物有限公司；121 ℃滅菌20 min。

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 索萊寶生物公司；ATP酶試劑盒 南京建成生物公司；LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit L7012 美國(guó)Life生物公司；海藻糖 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F D U-1 2 0 0 冷凍干燥機(jī) 日本E y e l a 公司；NEOFUGE15R/15高速冷凍離心機(jī) 鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；995超低溫冰箱 美國(guó)賽默飛世爾公司；IX71倒置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；DK-8D恒溫水浴鍋 江蘇金壇儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；ZXSD-1160全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱 上海智誠(chéng)儀器有限公司；EON多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek儀器有限公司；VCX750超聲波破碎儀 美國(guó)Sonics公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍干燥

將發(fā)酵乳桿菌ATm以3%的接種量，接種至MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)18 h，將菌液于6 791h g離心10 min，去上清液，將菌泥用生理鹽水洗滌2 次，加入等體積保護(hù)劑（脫脂乳12%海藻糖10%）。將混合有保護(hù)劑的菌懸液分裝在無(wú)菌西林瓶中，每瓶1 mL，蓋上橡膠塞，放入超低溫冰箱中預(yù)凍4 h。將預(yù)凍好的品放入冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥12 h，真空壓蓋，品備用。

1.3.2 冷凍干燥存活率測(cè)定

將冷凍干燥后的菌粉用MRS培養(yǎng)基復(fù)水至冷凍干燥前相同體積，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定冷凍干燥前后活菌數(shù)。重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，每次3 個(gè)平行。存活率計(jì)如式（1）所示：

式中：NA為冷凍干燥后的細(xì)胞數(shù)；NB為冷凍干燥前的細(xì)胞數(shù)。

將活化后的菌種培養(yǎng)液以3%接種量接入MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，將菌種離心并重懸于磷酸鹽緩沖液中。將重懸液在酸迫（pH 3.2、3.8、4.0、4.5、5.0）靜置90 min，冷迫（4、10 ℃）靜置180 min，將迫后的細(xì)胞進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.5 酸化曲線測(cè)定

將冷凍干燥復(fù)水后的菌種以3%接種量接種到新培養(yǎng)基中，每隔1 h取3 支試管測(cè)量其pH值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。以pH值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制酸化曲線。酸化曲線根據(jù)式（2）擬合[16]：

式中：t為培養(yǎng)時(shí)間/h；pH0為t=0時(shí)培養(yǎng)基的pH值；pHf為達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的pH值；c為對(duì)應(yīng)曲線中拐點(diǎn)的時(shí)間/h；p為指數(shù)擬合因子。

滯后時(shí)間為曲線上t=0點(diǎn)切線與t=c點(diǎn)切線的交點(diǎn)，酸化速率為指數(shù)階段切線斜率的模量，按式（3）計(jì)：

式中：tc為滯后時(shí)間；tf為pH值達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間。

1.3.6 相關(guān)酶活性的測(cè)定

1.3.6.1 無(wú)細(xì)胞提取液的制備

將菌體復(fù)水后離心，并用0.85%生理鹽水洗滌2 次。取5 mL于冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎（超聲時(shí)間3 s，間隔時(shí)間9 s），持續(xù)6.5 min。4 ℃、6 791h g離心10 min，取上清液進(jìn)行相關(guān)酶活性測(cè)定。

1.3.6.2 LDH活性測(cè)定

采用索萊寶公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定原理：LDH催化NAD氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步與2,4-硝基苯肼作用生成丙酮酸硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度呈正比。每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為1 個(gè)酶活性單位，LDH活性單位為U/104cell。

1.3.6.3 ATP酶活性測(cè)定

采用南京建成公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。其中蛋白質(zhì)濃度根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法[17]測(cè)定。

1.3.7 細(xì)胞膜完整性測(cè)定

利用LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit L7012試劑盒測(cè)定。將等體積的熒光染料碘化丙啶和免疫熒光染料（SYT09）均勻混合。取1 μL混合染料，加入到300 μL菌懸液中，均勻混合，室溫避光孵育15 min。取5 μL已染色菌液滴加于載玻片并蓋上蓋玻片于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。圖像處理采用Origin 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因迫對(duì)冷凍干燥存活率的影響

圖 1 酸脅迫（A）和冷脅迫（B）對(duì)發(fā)酵乳桿菌ATm 冷凍干燥存活率的影響Fig. 1 Effect of acid stress (A) and cold stress (B) on the survival rate of freeze-dried L. fermentum ATm

2.2 交互迫對(duì)冷凍干燥存活率的影響

圖 2 交互脅迫對(duì)發(fā)酵乳桿菌ATm冷凍干燥存活率的影響Fig. 2 Effect of cross-stress on the survival rate of freeze-dried L. fermentum ATm

2.3 交互迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm酸化曲線的影響

冷凍干燥過程中的脫水會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的結(jié)構(gòu)損傷[25]，但僅通過平板計(jì)數(shù)評(píng)估交互迫對(duì)乳酸菌活性保護(hù)的能力有局限性。因，對(duì)冷凍干燥后的乳酸菌進(jìn)行酸化曲線測(cè)定可提供細(xì)菌修復(fù)損傷的能力和冷凍干燥后活性恢復(fù)的情況[16]。

菌株冷凍干燥并復(fù)水后，每小時(shí)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液pH值變化，選取迫處理菌株、未經(jīng)冷凍干燥原始菌株和未經(jīng)迫處理的冷凍干燥菌株（對(duì)照），得到菌株的酸化曲線（圖3）。

圖 3 交互脅迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm酸化曲線的影響Fig. 3 Effect of cross-stress on acidification curves of freeze-dried L. fermentum ATm

表 1 交互脅迫對(duì)發(fā)酵乳桿菌ATm生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 Table 1 Effect of cross-stress on growth kinetic parameters of freeze-dried L. fermentum ATm

如表1所示，未冷凍干燥的原始菌株滯后時(shí)間最短，酸化速率（每小時(shí)pH值變化量）最快，分別為2.02 h、0.68。相反，未經(jīng)迫處理的冷凍干燥乳酸菌滯后時(shí)間最長(zhǎng)，酸化速率最慢，分別為7.50 h、0.23。任何處理下冷凍干燥后微生物的滯后時(shí)間都有不同程度的延長(zhǎng)，且酸化速率減慢。這可能是因?yàn)槔鋬龈稍锏拿撍^程使得乳酸菌的細(xì)胞膜受到損傷，以及酶活力下降[26]，使得乳酸菌在冷凍干燥后的產(chǎn)酸能力受到影響。經(jīng)過交互迫處理后的乳酸菌滯后時(shí)間和酸化速率與原始菌株相近，分別為 2.73 h、0.53，該處理比其他迫的保護(hù)方式更有效，說明用交互迫的前處理方式保護(hù)冷凍干燥乳酸菌的活性是很有必要的。

2.4 交互迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm LDH活性的影響

圖 4 交互脅迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm LDH活性的影響Fig. 4 Effect of cross-stress on LDH activity of freeze-dried L. fermentum ATm

2.5 交互迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm ATP酶的影響

ATP酶是一種廣泛分布的生物膜酶系統(tǒng)，對(duì)于維持細(xì)胞正常生理功能有至關(guān)重要的作用[20]。Na-KATP酶又稱Na-K泵或者鈉泵，鑲嵌在細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)雙分子層中，能夠催化ATP酶水解供給能量，有載體和酶的活性，在維持膜電位、調(diào)節(jié)滲透壓以及為主動(dòng)運(yùn)輸供能方面起著重要的作用[29]。Ca2-Mg2ATP酶能夠調(diào)節(jié)Ca2和Mg2的濃度，也是重要的膜酶[30]。因ATP酶是冷凍干燥過程中損傷的關(guān)鍵酶之一，本研究測(cè)定冷凍干燥后 Na-KATP酶與Ca2-Mg2ATP酶的活性結(jié)果見圖5。

圖 5 交互脅迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm Na＋ -K＋ATP酶（A）和Ca2＋-Mg2＋ATP酶（B）活性的影響Fig. 5 Effect of cross-stress on Na+-K+ATPase (A) and Ca2+-Mg2+ATPase (B) activities of freeze-dried L. fermentum ATm

2.6 交互迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)外的環(huán)境隔離開，對(duì)于細(xì)胞的生殖，能量傳遞及物質(zhì)代謝等具有重要作用[31]，是細(xì)胞遭受外界環(huán)境迫害的第一道防線，細(xì)胞膜的破壞會(huì)直接導(dǎo)致菌體的死亡，因細(xì)胞膜完整性真實(shí)地反映了菌體生理活性[32]。當(dāng)細(xì)胞膜完整性被破壞時(shí)，碘化丙啶能夠透過生物膜與核酸結(jié)合在綠光的照射下發(fā)出紅色熒光，所以當(dāng)熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞呈紅色，說明細(xì)胞膜完整性被破壞[33]。

圖 6 交互脅迫對(duì)冷凍干燥發(fā)酵乳桿菌ATm細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 6 Effect of cross-stress on cell membrane integrity of freeze-dried L. fermentum ATm

3 結(jié) 論