鄭天瑤 宿樹蘭 蔡紅蝶

[摘要]該文對不同齡期烘干前后蠶沙中菌群多樣性進行分析與評價，以期明確其菌群組成及其豐富度差異，闡明烘干處理對中藥材蠶沙中菌群的影響，為其功效科學內涵的揭示提供依據和參考。應用高通量測序技術測定蠶沙細菌的16S rDNAV4 變異區(qū)序列，應用Qiime，Mothur，PICRUSt等軟件整理和統(tǒng)計樣品序列數目和操作分類單元（OTUs）數量，分析蠶沙樣品中菌群的組成、豐度、分布、Alpha多樣性、Beta多樣性，菌群差異性及對群落的代謝功能等進行預測。該研究獲得用于分析的有效序列數為259 250；稀疏曲線表明測序深度充分，OTU 的數量接近于飽和。蠶沙菌群主要由變形菌門（Proteobacteria，893%）、放線菌門（Actinobacteria，50%）、厚壁菌門（Firmicutes，44%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，11%）、藍細菌（Cyanobacteria，02%）組成，其優(yōu)勢菌門為變形菌門。烘干后蠶沙的菌群多樣性及豐富度降低，五齡蠶沙尤為明顯。PICRUSt分析蠶沙菌群對應的基因功能發(fā)現膜轉運、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、核苷酸代謝，細胞過程與信號傳導等基因功能豐度較高。烘干處理可顯著降低蠶沙中致病菌的種類和數目，有利于藥材藥用品質，相比于低齡期蠶沙，五齡蠶沙更適宜入藥。Illumina MiSeq 高通量測序技術為蠶沙菌群的研究提供了更加準確、科學的數據資源。

[關鍵詞]不同齡期； 蠶沙； 菌群多樣性； 16S rDNA高通量測序

Silkworm excrement bacterial communities diversity in different instars

based on 16S rDNA sequence analysis

ZHENG Tianyao1，2， SU Shulan2*， CAI Hongdie2， DAI Xinxin2， OUYANG Zhen1， DUAN Jinao2*

（1 Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China；

2 Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and

Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae

Innovative Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract]This paper investigated the diversity of the silkworm excrement bacterial communities in different ages before and after drying， aiming to clarify the differences of bacterial communities in composition and bacterial abundance and the influences of drying treatment， and provide scientific basis for the efficacy of scientific connotation and utilization of silkworm excrement Highthroughput sequencing technique was used to measure the sequence of 16S rDNAV4 variable region of bacteria in silkworm excrement QIIME， Mothur and PICRUSt software programs were employed to sort and calculate the number of sequences and operational taxonomic units （OTUs） for each sample Thereafter， the abundance， distribution， alpha diversity index of species， beta diversity and bacterial communities diversity among different sample groups and predicted the bacterial gene functions were analyzed In this study， the numbers of effective sequences for six samples were 259 250； the rarefaction curves showed a sufficient sequencing depth， and the number of OTUs was close to saturation The bacteria in silkworm excrement belonged to the following five phylums： Proteobacteria （893%）， Actinobacteria （50%）， Firmicutes （44%）， Bacteroidetes （11%） and Cyanobacteria （02%） The dominant specie was Cyanobacteria of the total bacteria identified， respectively The abundances and diversities of the silkworm excrement bacterial communities have been reduced after drying treatment， especially the silkworm excrement of the fifth instar PICRUSt analysis was performed to show that abundance of the functional genes such as membrane transport， carbohydrate metabolism， amino acid metabolism， lipid metabolism， nucleotide metabolism， cellular processes and signaling were relatively high The result showed that the drying treatment could decreased the species and numbers of pathogenic bacteria in silkworm excrement obviously and improve the quality of medicinal materials Compared with the lower ages， silkworm excrement of fifth instar seems like to be more suitable for use in medicine Illumina MiSeq highthroughput sequencing system provides a more accurate and scientific data resource for the study of bacteria in silkworm excrementendprint

[Key words]different instars； silkworm excrement； bacterial communities diversity； 16SrDNA highthroughput sequencing

蠶沙，即蠶糞，為蠶蛾科昆蟲家蠶Ombyx mori L幼蟲的干燥糞便，是我國的傳統(tǒng)中藥，在《名醫(yī)別錄》和《本草綱目》均有記載，具有祛風除濕、清熱明目、活血定痛的功效。用于主治皮膚不仁、關節(jié)不遂、肢體麻木、風疹瘙癢等癥。隨著近年來研究的不斷深入，關于蠶沙的化學成分、藥理作用、臨床應用的研究日益增多?，F代研究表明，蠶沙具有改善和治療貧血[1]、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌[2]、保肝作用[3]等多種藥理活性，且對糖尿病患者血糖的改善也有一定療效[4]。以蠶沙為原料提取的葉綠素、果膠、葉黃素、類胡蘿卜素、植物醇、葉蛋白等，廣泛用于食品、飲料、化妝品、醫(yī)藥等領域[5]，而關于蠶沙的微生物學研究較少。鐘楊生等[6]研究了蠶沙堆肥過程中微生物群落數量的動態(tài)變化，史才娟等[7]研究了不同齡期蠶沙中細菌、真菌、放線菌的數量變化，但關于蠶沙中菌群的具體組成目前尚不清楚。

隨著分子生物技術的發(fā)展，一些非培養(yǎng)型技術被用于腸道菌群、土壤菌群、植物內生菌等微生物群落結構的研究中，例如以16S rDNA為基礎的DGGE[8]，Real timePCR[9]，FLSH[10]。近年來高通量測序技術已較為廣泛地應用在微生物的研究中，是目前最為先進的檢測技術，具備通量高、測序快、準確度高等特點。

本研究采用Illumina MiSeq第二代測序方法測定6種不同齡期烘干前后的蠶沙中菌群組成及豐富度，比較分析烘干加工前后、不同齡期蠶沙的菌群結構的差異性，同時對其代謝功能進行初步預測，以期為蠶沙藥材品質及功能主治提供科學依據。

1材料與方法

11樣品采集

所有蠶沙樣品均采自鎮(zhèn)江市江蘇科技大學中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所。采樣時，在家蠶排便后，用無菌鑷子收集糞便放入無菌袋中，取部分樣品置于烘箱中50 ℃烘干備用，其余樣品取樣后立即用準備好的冰袋冷藏，并迅速轉移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

12試劑與儀器

RS232G紫外分光光度計；Eppendorf；DYY6C電泳儀；PCR儀2720；凝膠成像系統(tǒng)（BG）；臺式紫外分析儀（BG）；Pico17離心機（Thermo）；Agilent，2100；BioTek，FLx800；Promega，QuantiFluorTBS380；Illumina Miseq高通量測序儀（Illumina）。

Millipore超純水；瓊脂糖（英杰公司，75510019）；EB溴化乙錠清除液（生工，EX328）；PowerSoil DNA提取試劑盒（美國MoBio，12888）；5×反應緩沖液；5×High GC Buffer；脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，10 mmol·L-1）；Axy Prep DNA Gel Extration kit試劑盒（Axygen，APGX500）；TruSeq Nano DNA LT Sample Prep kit試劑盒（FC1214001或FC1214002）；Agencourt AMPure XP Beads kit試劑盒（A63881）；QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒（Invitrogen，P7589）；Agilent High Sensitivity DNA Kit試劑盒（Agilent，50674626）。

13蠶沙樣品DNA的提取

將每種原始糞便樣品解凍、混勻后，各取025 g樣品進行DNA的提取。樣品使用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit（12888）試劑盒提取DNA[11]，用08%的瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小判斷，利用紫外分光光度計對DNA進行定量，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 mg·L-1 [12]。

1416S rDNAV4區(qū)的PCR擴增

以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶標簽的16S rDNAV4 區(qū)特異引物520F （5′標簽+GCACCTAAYTGGGYDTAAAGNG3′）和802R（5′TACNVGGGTATCTAATCC3′），使用高效和高保真酶（Q5高保真DNA聚合酶；5倍反應緩沖液；5倍高GC緩沖液）進行PCR擴增，確保擴增的效率和準確性。

15PCR 產物的混樣和純化

PCR產物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切取目的片段并用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1616S rDNA 文庫構建與測序

161構建文庫利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒進行建庫。首先對基因片段進行末端修復，將DNA 5′端突出的堿基切除，3′端缺失的堿基補齊，同時在5′端加上1個磷酸基團。在修復平整的DNA片段3′端引入單堿基“A”，從而防止DNA片段的自連，同時保證DNA與3′端有1個突出T堿基的測序接頭相連。在連接酶的作用下，孵育含有標簽的接頭與DNA片段，使其相連。通過PCR擴增已經加上接頭的DNA片段，利用BECKMAN AMPure XP beads試劑盒純化PCR體系。利用2%瓊脂糖凝膠電泳來對文庫做最終的片段選擇與純化。構建好的文庫取1 μL，在Agilent Bioanalyzer機器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫做2100質檢，利用QuantiT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量，合格后，使用MiSeq進行上機測序[1316]。endprint

162上機測序將樣品DNA文庫均一化至10 nmol·L-1后等體積混合?；旌玫奈膸熘鸩较♂尪恐?～5 pmol·L-1后用Illumina MiSeq 測序儀測序。

17生物信息學分析

測序得到的原始數據（raw data），存在一定比例的干擾數據（dirty data），為了使信息分析的結果更加準確、可靠，首先對原始數據進行篩查、處理和質量控制，得到高質量的有效數據（effective tags）[17]運用QIIME軟件識別疑問序列。要求序列長度≥150 bp，且不允許存在模糊堿基N，剔除5′端引物錯配堿基數>1的序列和含有連續(xù)相同堿基數>8的序列。利用QIIME軟件調用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列。最后去除barcode及引物序列，使用UCLUST軟件，按照97%相似性進行操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）聚類，挑選出每個OTU的代表序列[18]。利用Greengene 數據庫對代表序列進行物種注釋。通過對OTUs進行豐度，Alphadeversity，Betadeversity，LefSe分析以及物種在各個分類水平上的群落結果統(tǒng)計分析，得到微生物群落結構組成[1920]。利用KEGG數據庫通過PICRUSt軟件對樣品的群落代謝功能進行預測。

2結果

21測序結果的質量分析

蠶沙樣品所測得的有效序列共274 750條，其中高質量序列259 250 條，占序列總數的9436%。長度分布在300～500 bp，長度為450 bp 的序列最多，有20多萬條。從序列長度的分布來看，與16SrDNAV4 區(qū)序列長度吻合（表1）。

22OTU劃分和分類地位鑒定

利用Mothur軟件計算在97%的相似水平上每個樣品的OTU數量，OTU的數量可以代表樣品物種的豐度[21]。結果表明，在所有樣品中，OTU數量最多可達到369，最少為243。這表明蠶沙樣品的菌群豐富度很高，干品與鮮品之間菌群豐富度差異較大，不同齡期鮮品菌群豐富度明顯高于干品，且樣品均不存在未分類OTU（表2）。在門、綱、目水平上OTU幾乎可以全部被檢測，在屬、種水平上被檢測出的OTU的數量明顯減少（圖1）。

23Alpha多樣性分析

231稀疏曲線利用已測得16S rDNA序列中已知的各種OTU的相對比例，模擬輸入序列數目（小于總的樣品序列條數）與OTU個數產出間的相互關系。對基于97%相似度歸類的OTU用 Observed species，Chao1，Shannon 3種方法進行稀疏曲線（rarefaction curve）繪制（圖2）。

從稀疏曲線來看，隨著測序數量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨向平坦但未進入平臺期，說明再增加測序數量也只會產生少量新的OTUs；從Chao1指數稀疏曲線來看（圖2C），Chao1指數在0～2×104的測序數量范圍內增幅最大，在2×104以后曲線斜率下降，且4LX，5LX 的chao1曲線的增幅十分相似，表明2種蠶沙樣品菌群豐富度相似；從Shannon指數稀疏曲線來看（圖2B），6種蠶沙樣品的曲線數值先是直線上升直至趨向平坦，說明測序量足夠大，能覆蓋樣品中絕大多數微生物信息，再增加測序深度蠶沙樣品的菌群多樣性也不會發(fā)生改變。4LG蠶沙的3種曲線均明顯短于其他樣品組，說明測序數量足夠，已達到全部覆蓋。烘干后蠶沙樣品的菌群的豐富度及多樣性均有明顯下降，五齡蠶沙受烘干的影響較大，烘干處理可明顯降低五齡蠶沙的菌群多樣性與豐富度。

232Alpha多樣性指數對OTU豐度矩陣中的全體樣品根據最低測序深度統(tǒng)一進行隨機重抽樣（即“序列量拉平處理”），使用QIIME軟件分別對每個樣品計算chao1，ACE，Shannon指數（表3）。

由表3可知，烘干后蠶沙樣品中chao1，ACE指數隨著齡期的增加而逐漸降低，說明干蠶沙隨著齡期的增加菌群的豐富度逐漸降低；新鮮蠶沙chao1，

ACE指數增長趨勢與其相反，說明隨著齡期的增加新鮮蠶沙的菌群豐富度逐漸升高。Shannon指數在烘干前、后的蠶沙樣品中均隨著齡期的增大而呈下降趨勢，說明齡期增大，蠶沙菌群的多樣性有所下降。

24各分類水平的分類學組成分析

241門水平的群落分類學組成分析蠶沙主要由變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、藍細菌Cyanobacteria組成。其中相對豐度最大的優(yōu)勢菌門為變形菌門Proteobacteria，高達90%。烘干處理前后的放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes豐度差異較大（圖3）。

242屬水平上的各樣品群落構成分析除變形菌門腸桿菌科未分類菌屬（Enterobacteriaceae，759%），蠶沙細菌主要分布于以下10個屬，蒼白桿菌屬（Ochrobactrum，41%）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter，37%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，35%）、腸球菌（Enterococcus，20%）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，16%）、農桿菌屬（Agrobacterium，07%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，06%）、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella，05%）、腸桿菌屬（Enterobacter，04%）、沙雷氏菌屬（Serratia，03%）。3LG蠶沙的節(jié)細菌屬Enterococcus含量明顯高于其他；4LG，4LX，5LX的蒼白桿菌屬Ochrobactrum含量較高；5LG的腸球菌屬Enterococcus含量較高；4LG，3LG的不動桿菌屬Acinetobacter含量較高（圖4）。使用R軟件，對豐度前50位的屬進行聚類分析并繪制熱圖，熱圖中每小格代表所在樣品中某種菌的相對豐度，顏色越紅代表相對豐度越高。在屬水平上，4LX與5LX、3LG與3LX、4LG與5LG的菌群內部結構較相似，可分別聚為一類（圖5）。endprint

25Beta多樣性分析

基于UniFrac[22]距離上對屬水平各樣品之間進行加權（weighted）和非加權（unweighted）的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），同時采用基于UniFrac的非加權組平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）進行樣品聚類。6種樣品微生物群落構成的PcoA圖中，坐標軸括號中的百分比代表了對應的主成分所能解釋的原始數據中差異的比例（圖6），基于UniFrac的加權和非加權的主坐標分析（weighted and unweighted UniFrac principal coordinate analysis）其第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為4423%，1811%和5535%，3204%。說明在加權和非加權主坐標分析中所選主成分均可以充分解釋原始數據中的差異。通過圖中樣品點距離的遠近，可觀察個體或群體間的差異，樣品點越相近說明樣品間微生物群落構成越相似。由基于UniFrac的非加權主坐標分析圖（圖6A）和基于UniFrac的加權主坐標分析圖（圖6B）可知，3LG，3LX始終處于同一象限，說明三齡蠶沙樣品在烘干前后菌群多樣性無明顯改變，烘干處理對其影響較小。這點在UPGMA聚類圖中（圖7）也得到印證。4LX與5LX無法同其他樣品聚為一簇（圖7），這表明二者微生物群落結構相似而與其他樣品相差較大，烘干對四齡、五齡蠶沙樣品有顯著影響。

26LefSe分析

LefSe分析，根據分類學組成對樣品按照不同的分組條件進行線性判別分析，找出對樣品劃分產生顯著性差異影響的群落[2325]。將蠶沙樣品分為2組，烘干處理前與烘干處理后，以P<05，LOD>2為標準，在各分類水平找出具有顯著性差異的群落。柱形圖表示在2組中的差異菌屬信息，紅色表示在烘干處理蠶沙組中高出，綠色表示在新鮮蠶沙組中高出；所有菌在門、綱、目、科、屬，水平的差異信息用餅形圖表示。經LEfSe分析（圖8），干蠶沙中的檸檬酸桿菌屬Citrobacter、愛文氏菌屬Ewingella顯著高于新鮮蠶沙，新鮮蠶沙中的甲基桿菌屬Methylobacterium、甲基桿菌科Methylobacteriaceae、鏈球菌科Streptococcaceae、藍細菌（cyanobacteria）、芽孢桿菌屬Bacillus和0319_6G20科菌（0319_6G20）顯著高于干蠶沙。由分析結果可知，干蠶沙中的條件致病菌要少于新鮮蠶沙，相比于新鮮蠶沙，干蠶沙更適于入藥。另干蠶沙中的檸檬酸桿菌屬可發(fā)酵葡萄糖產酸產氣，艾文氏菌屬可發(fā)酵D阿拉伯糖、D纖維二糖產酸，提示蠶沙的降糖作用可能與蠶沙中的相關菌群的作用有關。

27群落代謝功能分析

通過PICRUSt[26]軟件，根據KEGG數據庫中微生物代謝功能的類別對群落樣本的代謝功能進行預測。統(tǒng)計蠶沙菌群相對豐度大于005的相關代謝功能（表4），蠶沙菌群涉及的代謝功能主要有膜轉運、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、核苷酸

3討論

本文對6種不同齡期、烘干處理前后的蠶沙樣品中菌群多樣性進行分析與評價，對其16S rDNAV4區(qū)進行Illumina MiSeq平臺測序，共得到274 750個有效序列。6種蠶沙樣品的3種稀疏曲線數值先是上升直至趨向平坦，說明測序量足夠大，能覆蓋樣品中絕大多數微生物信息。

蠶沙作為一種動物藥，其本身為家蠶的排泄物，相對與傳統(tǒng)的中藥材，蠶沙中所含有的微生物較多。藥典中關于中藥制劑、生物制品等有相應的微生物限度要求[27]，這也提示對于蠶沙這類微生物含量較多的藥材其菌群鑒定的必要性。本研究以蠶沙中的菌群結構為切入點，首先明確了蠶沙中菌群的組成和相對豐度，并從菌群結構的角度對中藥材蠶沙的烘干處理進行了評價。從蠶沙樣品在不同分類水平上的OTU數量，樣品的chao1指數、ACE指數、shannon指數可明顯的看出烘干處理后的蠶沙樣品中菌群的豐度和多樣性都低于新鮮蠶沙，芽孢桿菌、鏈球菌等一些條件致病菌在干蠶沙中也明顯減少，充分說明烘干處理可有利于蠶沙藥用。

在對蠶沙樣品進行分類學鑒定時發(fā)現蠶沙主要由變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、藍細菌Cyanobacteria組成。其優(yōu)勢菌門為變形菌門。各分類水平的菌群鑒定均顯示3齡蠶沙的菌群多樣性與結構同4齡、5齡蠶沙相差較大，原因是家蠶在1～3齡期為稚蠶，4～5齡期為壯蠶，分屬家蠶生長發(fā)育的不同階段，其腸道菌群本身的差別較大。此外，有報道[28]通過剖取家蠶腸道內容物進行16SrDNA測序，確定了家蠶腸道細菌的優(yōu)勢類群為葡萄球菌屬、陰溝腸桿菌（腸桿菌屬）、蠟樣芽胞桿菌（芽孢桿菌屬）。這與本研究所得的蠶沙菌群的優(yōu)勢類群有所不同，推測家蠶在食用桑葉的過程中體內的微生物系統(tǒng)發(fā)生了改變，可能有新的菌種產生。加之蠶沙中存在消化不完全的桑葉，導致蠶沙的菌群一部分來源于桑葉的內生菌，值得進一步深入研究。

結合對人腸道菌群的相關研究[29]可發(fā)現蠶沙的菌群結構與人體的腸道菌群結構差異較大，若服用不當其含有的條件致病菌極有可能破壞人體的腸道菌群平衡，從而不但達不到治病的效果反而會致病。本研究結果也提示，在蠶沙入藥時要經過適當加工處理，鮮品不適于入藥，三齡蠶沙不適于入藥；同時充分考慮其可能對機體微生物生態(tài)環(huán)境產生改變，從而對機體產生影響。蠶沙菌群優(yōu)勢種屬代謝功能的預測說明蠶沙對機體糖、脂肪、蛋白代謝有一定的影響，表明蠶沙的藥效可能與其菌群的作用有關，尚需進一步深入研究。

本實驗利用Illumina MiSeq 高通量測序技術分析了蠶沙菌群多樣性，全面而準確地分析了蠶沙菌群的種類組成，發(fā)現蠶沙菌群分布相對集中，主要分布于腸桿菌科（Enterobacteriaceae，80%），以下7個種屬為蠶沙菌群的優(yōu)勢種群：變形菌門下的蒼白桿菌屬Ochrobactrum、不動桿菌屬Acinetobacter、節(jié)細菌屬Arthrobacter、甲基桿菌Methylobacterium、腸桿菌屬Enterobacter、克雷白氏桿菌屬Klebsiella及厚壁菌門下的葡萄球菌Staphylococcus，為蠶沙的后續(xù)研究及開發(fā)利用提供了科學依據。endprint

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[責任編輯呂冬梅]endprint