周靜，張娜娜，張一望，邵春奎（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，廣東省肝臟疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510630）

肝移植術(shù)后的慢性排斥反應(yīng)（chronic rejection，CR） 是由細(xì)胞和體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)并且是由多種因素共同參與而引起的一種慢性肝移植物損傷，盡管各種新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用和抗排斥治療方案日臻完善，其發(fā)生率已由20世紀(jì)80年代的15%～20%降至目前的不足2%［1-2］，但CR仍是影響移植肝長(zhǎng)期存活以及導(dǎo)致肝功能喪失的重要因素。因此， 對(duì)肝移植術(shù)后CR及時(shí)并準(zhǔn)確地診斷具有重要的臨床意義，也是肝移植病理學(xué)目前研究的重要內(nèi)容之一。本研究旨在回顧性觀察16例肝移植術(shù)后CR病理組織學(xué)資料，總結(jié)分析其病理特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院2005年1月-2016年12月16例肝移植患者術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)為CR的肝穿刺活檢組織學(xué)資料。全部病例均符合以下條件：① 肝穿刺活檢組織顯微鏡下見(jiàn)到連續(xù)3個(gè)以上匯管區(qū)；② 臨床及實(shí)驗(yàn)室資料完整，其中男性14例，女性2例；年齡35～64歲，平均（44.75±8.98）歲；原發(fā)病的病理診斷：乙型肝炎肝硬化3例；肝惡性腫瘤7例；慢性重型乙型肝炎5例；酒精性肝硬化1例。術(shù)后免疫抑制劑以糖皮質(zhì)激素、他克莫司（或環(huán)抱素A）及硫唑嘌呤為基礎(chǔ)用藥。定期做血生化檢查〔肝功能檢查、乙肝抗原和抗體的血清學(xué)檢查、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）血清學(xué)檢查等〕及影像學(xué)輔助檢查。

1.2 方法

1.2.1 蘇木素-伊紅（HE）染色：移植肝穿刺活檢組織迅速經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。依照國(guó)際統(tǒng)一的Banff標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)CR進(jìn)行分級(jí)及評(píng)分［3］。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：部分病例加做乙型肝炎表面抗原（hepatits B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）、CMV及CK7免疫組化染色，采用Envision兩步法進(jìn)行（具體步驟略）。鼠抗人HBsAg單克隆抗體、兔抗人HBcAg多克隆抗體及鼠抗人CK7單克隆抗體均購(gòu)自DAKO公司，工作濃度分別為1：50、1：900及1：100；鼠抗人CMV單克隆抗體購(gòu)自福建邁新公司，工作濃度為1：50；鼠抗人HCV單克隆抗體購(gòu)自上海長(zhǎng)島公司，工作濃度為1：50；抗體稀釋液及Envision試劑盒均購(gòu)自DAKO公司。

2 結(jié) 果

2.1 穿刺時(shí)間：移植術(shù)后187～3490天，平均穿刺時(shí)間為985天。

2.2 早期組織學(xué)表現(xiàn)（圖1）：早期表現(xiàn)為匯管區(qū)輕度擴(kuò)大，較為單一的少到中等量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞少見(jiàn)，少數(shù)小葉間膽管管腔變形，上皮細(xì)胞空泡變性、核極向紊亂、細(xì)胞固縮或嗜酸性變，小膽管數(shù)量未見(jiàn)明顯減少（圖1a）。小葉間動(dòng)脈管腔狹窄變形、內(nèi)皮細(xì)胞增生腫脹、細(xì)胞核極向紊亂， 小動(dòng)脈數(shù)量無(wú)減少（圖1b）。部分中央靜脈周?chē)馨图?xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴肝細(xì)胞變性、壞死及脫失，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)膽色素沉積及毛細(xì)膽管膽栓形成（圖1c），庫(kù)普弗細(xì)胞增生伴含鐵血黃素顆粒沉積（圖1d）。

圖1 a.門(mén)管區(qū)小葉間膽管管腔變形，上皮細(xì)胞嗜酸性變、核深染、多形，伴少量淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)，周?chē)渭?xì)胞水樣變性伴少量膽色素沉積；b.小動(dòng)脈管腔狹窄，內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫脹變性；c.中央靜脈及周?chē)馨图?xì)胞、轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴周?chē)渭?xì)胞變性、淤膽和肝細(xì)胞脫失,形成小葉中央壞死性炎癥；d.庫(kù)普弗細(xì)胞增生、含鐵血黃素顆粒沉著

2.3 晚期組織學(xué)表現(xiàn)（圖2）：晚期則表現(xiàn)為中央靜脈及周?chē)装Y減輕，纖維組織增生。肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽明顯。匯管區(qū)炎癥細(xì)胞減少， 纖維組織增生， 可見(jiàn)橋接纖維化及纖維間隔形成（圖2a、圖2b）。小葉間膽管及小葉間動(dòng)脈數(shù)量減少或消失（圖2c）。

圖2 a.匯管區(qū)小葉間膽管上皮明顯變性、壞死，膽管周?chē)w維化，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯；b.匯管區(qū)纖維組織增生、橋接纖維化；c.匯管區(qū)小膽管及小動(dòng)脈減少、消失

3 討 論

肝移植是治療各種病因所致終末期肝病的有效手段［4-6］。肝移植術(shù)后CR表現(xiàn)為移植術(shù)后數(shù)月或數(shù)年后逐漸出現(xiàn)的移植肝功能減退甚至衰竭，決定其發(fā)生的因素可能包括高齡供體、長(zhǎng)時(shí)間的冷熱缺血、反復(fù)或持續(xù)存在的急性排斥反應(yīng)（acute rejection， AR）、CMV感染以及免疫抑制劑的應(yīng)用不足等，多數(shù)人認(rèn)為同種抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)在CR的發(fā)病過(guò)程中起最重要的作用［7-8］。

肝移植術(shù)后發(fā)生CR并不具有確定的時(shí)間界限，多數(shù)CR發(fā)生在術(shù)后1年之內(nèi)，術(shù)后的2～6個(gè)月為高峰， 也可發(fā)生于移植術(shù)后數(shù)周內(nèi)或1年以后。因此，有人認(rèn)為CR是一個(gè)形態(tài)學(xué)概念，并非完全依據(jù)時(shí)間而定，慢性排斥反應(yīng)中的“慢性”二字實(shí)際上是指非可逆性病理改變。本組資料顯示最早的CR發(fā)生于移植術(shù)后6個(gè)月，而最遲的則接近10年。

CR的基本組織病理學(xué)改變包括小膽管病變（膽管上皮萎縮老化，累及多數(shù)膽管，伴或不伴至少50%的膽管缺失）和泡沫細(xì)胞阻塞性動(dòng)脈病。由于肝穿刺活檢取材固有的局限性（難以檢見(jiàn)大的肝動(dòng)脈）， 因此，病理檢查只能通過(guò)多次穿刺活檢來(lái)提供漸進(jìn)性的膽管丟失作為主要依據(jù)［3，9］。

本研究顯示小膽管損傷或消失是CR最常見(jiàn)的病理特征，涉及的可能機(jī)制主要有兩個(gè)，包括直接的細(xì)胞毒性免疫損傷以及缺血性損傷，也可能兩者都在特定的情況下具有重要作用［10］。組織學(xué)表現(xiàn)為小膽管的管腔變形，內(nèi)襯上皮細(xì)胞不連續(xù)、間距增大或極向紊亂，細(xì)胞呈現(xiàn)退行性改變，表現(xiàn)為核深染、多形，核漿比增大或固縮、胞漿嗜酸性變或空泡變性等萎縮老化現(xiàn)象。CR早期，小膽管數(shù)量無(wú)明顯減少或僅在少數(shù)匯管區(qū)內(nèi)（＜50%）見(jiàn)到膽管消失， 而絕大多數(shù)匯管區(qū)內(nèi)小膽管可見(jiàn)炎性損害和上皮細(xì)胞的退行性改變，且見(jiàn)不到明顯的細(xì)膽管反應(yīng)及小膽管增生［9］。隨著病程進(jìn)展，小葉間膽管出現(xiàn)丟失，而且是一個(gè)從幾周到數(shù)月的漸進(jìn)性過(guò)程，可累及所有的小葉間膽管，但以直徑＜60 μm的小膽管更易受累。如果超過(guò)50%門(mén)管區(qū)見(jiàn)不到小膽管，提示CR可能已經(jīng)進(jìn)入晚期，且具有診斷意義，很多診斷明確CR有超過(guò)75%的門(mén)管區(qū)出現(xiàn)膽管丟失，即使膽管丟失明顯，大多無(wú)明顯的膽管增生及門(mén)管區(qū)擴(kuò)大，這是與其他膽管丟失性疾病不同之處。有時(shí)損傷的膽管常表現(xiàn)為成群或成束的上皮細(xì)胞聚集，難以辨別，可通過(guò)Masson三色、PAS染色或免疫組化（CK7、CK19）來(lái)幫助鑒別［11］。此外，由于小膽管常與相應(yīng)大小的肝動(dòng)脈分支伴行，膽管丟失也可依據(jù)門(mén)管區(qū)內(nèi)小動(dòng)脈分支有無(wú)相伴隨的膽管加以識(shí)別，即根據(jù)一個(gè)門(mén)管區(qū)內(nèi)動(dòng)脈分支和小膽管的數(shù)量比例進(jìn)行評(píng)估［10］。

門(mén)管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)也是CR的常見(jiàn)病理特征，因?yàn)镃R由細(xì)胞與體液免疫共同參與， 也可出現(xiàn)細(xì)胞免疫所致的病理改變， 且部分CR多由AR引起。在CR早期，門(mén)管區(qū)可見(jiàn)輕至中度淋巴細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，加上膽管損傷性改變，類(lèi)似于AR的病理表現(xiàn)，但CR較少出現(xiàn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，臨床對(duì)額外免疫抑制劑的反應(yīng)欠佳，可資鑒別。隨著病程進(jìn)展，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，這是由于免疫攻擊的主要靶器官即小葉間膽管消失后，炎癥細(xì)胞失去攻擊目標(biāo)而造成。本研究顯示，多數(shù)門(mén)管區(qū)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕微，這種膽管損傷的嚴(yán)重性與炎細(xì)胞浸潤(rùn)的程度不成比例也是CR的病理特征之一。CR特征性的血管病變主要累及大或中等大小的動(dòng)脈，表現(xiàn)為典型的泡沫細(xì)胞性動(dòng)脈病變，即巨噬細(xì)胞及內(nèi)膜細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞在內(nèi)皮下沉積［12］。由于泡沫細(xì)胞性動(dòng)脈病變主要發(fā)生于近肝門(mén)的較大動(dòng)脈支，在肝穿活檢中難以見(jiàn)到，除非是再次移植的全肝標(biāo)本，否則其診斷價(jià)值有限。本研究?jī)H偶見(jiàn)門(mén)管區(qū)小葉間動(dòng)脈損傷，表現(xiàn)為管壁增厚、透明變性或內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，未查見(jiàn)典型泡沫細(xì)胞性動(dòng)脈病變。

由于肝動(dòng)脈病變而導(dǎo)致肝組織缺血、缺氧和膽管損傷后造成淤膽性損害以及免疫損害等多種因素共同作用下，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死及脫失，多發(fā)生在中央靜脈周?chē)ǜ蜗倥茛髤^(qū)），并伴有肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽現(xiàn)象，且淤膽的程度與小葉間膽管損害及減少程度密切相關(guān)，中央靜脈周?chē)霈F(xiàn)膠原纖維沉積、少量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，呈中小葉中央壞死性炎癥的病理改變，發(fā)生上述改變的小葉中央?yún)^(qū)域通常被認(rèn)為是缺血性區(qū)域，其病變程度間接反映了動(dòng)脈、膽管及免疫損傷程度，隨著CR發(fā)生時(shí)間延長(zhǎng)而加重，是提示CR的重要組織學(xué)依據(jù)。本組資料中尚查見(jiàn)肝竇內(nèi)庫(kù)普弗細(xì)胞增生伴含鐵血黃素顆粒沉積，可能對(duì)CR的發(fā)生也起到了一定的效應(yīng)作用［13］。隨著CR的持續(xù)存在， 壞死區(qū)發(fā)生纖維化加上門(mén)管區(qū)小膽管丟失明顯時(shí)常伴有纖維化，繼而可形成橋接纖維化和纖維間隔，此時(shí)門(mén)管區(qū)較少或沒(méi)有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，提示CR已經(jīng)進(jìn)入不可逆的階段。

總之，小葉間膽管上皮退行性改變及數(shù)量進(jìn)行性減少對(duì)CR最具診斷價(jià)值，而小葉中央壞死性炎癥變及匯管區(qū)單一炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)則對(duì)早期CR具有提示作用， 肝組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的纖維化或纖維間隔形成時(shí)則提示CR已經(jīng)進(jìn)入晚期不可逆的階段。CR需要與表現(xiàn)為門(mén)管區(qū)炎癥、膽管損傷及膽管丟失的疾病進(jìn)行鑒別，包括病毒性肝炎復(fù)發(fā)（特別是丙型肝炎）、原發(fā)性硬化性膽管炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎及缺血性膽管炎等，均是CR需要鑒別的對(duì)象，此時(shí)需通過(guò)觀察門(mén)管區(qū)有無(wú)顯著擴(kuò)大、浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞類(lèi)型，有無(wú)小膽管增生或中央靜脈周?chē)装Y等病理特點(diǎn)，結(jié)合臨床表現(xiàn)、免疫抑制劑血藥濃度、血清病毒學(xué)、自身免疫抗體檢查以及影像學(xué)觀察肝內(nèi)外膽管有無(wú)擴(kuò)張等情況進(jìn)行綜合分析。對(duì)CR的診斷需要特別謹(jǐn)慎，以避免假陽(yáng)性的結(jié)果，用多次連續(xù)性的標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，可以提供更為確切的信息并盡可能地減少樣本誤差，因?yàn)殚T(mén)管區(qū)越多就越能代表肝臟的整體情況，也更能與臨床資料密切聯(lián)系，為臨床調(diào)整免疫抑制治療提供幫助［14-15］。