李 柯，陳 丹，李若存，蔣 波，林凡友，王文天

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013； 2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411102；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023)

·檢驗檢測·

復方益母膠囊質(zhì)量標準提高研究

李 柯1，陳 丹2，李若存1，蔣 波1，林凡友3，王文天3

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013； 2.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學院，湖南 湘潭 411102；3.翔宇藥業(yè)股份有限公司，山東 臨沂 276023)

目的 提高復方益母膠囊質(zhì)量標準。方法 采用薄層色譜（TLC）法對復方益母膠囊中益母草進行定性鑒別；采用高效液相色譜法進行定量分析，色譜柱為Hypersil NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 m)，流動相為磷酸鹽緩沖液（pH＝5.5)－乙腈(20∶80），檢測波長為192 nm。結(jié)果 TLC斑點清晰，分離效果好，陰性對照無干擾；鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度在 0.027～0.162 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系較好(r＝0.999 5)，平均回收率為 97.58%，RSD為 2.82%（n＝9）。結(jié)論 所建立的定性、定量分析方法可用于復方益母膠囊的質(zhì)量控制。

復方益母膠囊；質(zhì)量標準；高效液相色譜法；鹽酸水蘇堿

復方益母膠囊由益母草、當歸、川芎、木香4味中藥 組方，活血行氣，化瘀止痛，臨床用于治療氣滯血瘀證所致痛經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、產(chǎn)后子宮復舊等，療效確切[1－3]。為更好地控制本品質(zhì)量，將現(xiàn)行標準中的薄層色譜（TLC）法測定鹽酸水蘇堿含量改為高效液相色譜（HPLC）法，采用TLC法進行木香、益母草定性鑒別，操作簡單、合理，可作為本品質(zhì)量控制方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent Open LAB色譜數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 試藥

益母草對照藥材(批號為120912－201209)，木香對照藥材（批號為120921－201309），鹽酸水蘇堿對照品（批號為110712－201513），均由中國食品藥品檢定研究院提供；復方益母膠囊（翔宇藥業(yè)股份有限公司，批號分別為160102，160107，160313，150505，150517，150609，150713，160101，160112，160203)；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水（實驗室自制），丙酮、無水乙醇、乙酸乙酯、環(huán)已烷等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 益母草

取3批樣品（批號分別為160102，160107，160313）內(nèi)容物，研細，取1 g，分別加乙醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至5 mL，加到中性氧化鋁柱（上海五四化學試劑，100～200目，5 g，乙醇上柱）上，用50 mL乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至1 mL，作為供試品溶液。另取益母草對照藥材1 g，加乙醇30 mL，同上述方法制成對照藥材溶液。再取缺益母草的陰性樣品細粉1 g，同法制成陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以丙酮－無水乙醇－鹽酸（10∶6∶1）為展開劑，展開，取出，室溫揮干溶劑，100℃加熱約10 min，取出，放置室溫，噴以新配制的稀碘化鉍鉀與1%三氯化鐵無水乙醇溶液（2∶1）的混合溶液，至斑點清晰[5]。供試品溶液色譜中，在與益母草對照藥材溶液色譜相應位置上顯橘黃色斑點，而陰性對照品溶液相應位置無斑點，見圖1 A。

2.1.2 木香

取3批樣品（批號分別為160102，160107，160313）內(nèi)容物研細，取1.6 g，分別置帶塞三角瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液揮干，殘渣用乙醇溶解，定容至2 mL，作為供試品溶液。另取木香對照藥材0.4 g，加20 mL乙酸乙酯，同法制成對照藥材溶液。再取缺木香的陰性樣品細粉1.6 g，同法制成陰性對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》通則0502中薄層色譜法[4]試驗，吸取供試品溶液與陰性對照溶液各4 μL，對照藥材溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，展開，取出，室溫揮干溶劑，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰[5]。供試品溶液色譜中，在與木香對照藥材溶液色譜相應位置上顯藍色斑點，而陰性對照品溶液相應位置上無斑點，見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取0.02 mol／L磷酸二氫鈉用0.02 mol／L磷酸氫二鈉調(diào)pH至5.5)－乙腈(20∶80）；檢測波長：192 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：30℃。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計不低于5 000[2]。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取鹽酸水蘇堿對照品適量，75%乙腈溶解，定容，得0.1 g／L的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液：取樣品膠囊內(nèi)容物1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定總質(zhì)量，靜置1 h，于水浴回流（90～100℃）30 min，放置室溫，復稱總質(zhì)量，加甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液10 mL，加到中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑為1.2 cm）上，用100 mL乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加75%乙腈適量使溶解，定容至10 mL容量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[5]。

陰性對照品溶液：按處方比例和制法制成缺益母草的細粉，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取鹽酸水蘇堿對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣10 μL測定，結(jié)果陰性對照品溶液在供試品溶液色譜圖上無干擾，色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取鹽酸水蘇堿對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.216 g／L）適量，分別加75%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為 0.027，0.054，0.081，0.108，0.162 g／L的溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以峰面積積分值為縱坐標(Y)，以鹽酸水蘇堿對照品進樣量(X，μg)為橫坐標，繪制鹽酸水蘇堿標準曲線，得回歸方程Y＝3 160 X＋7.059，r＝0.999 5（n＝5）。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度在0.027～0.162 g／L范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

加樣回收試驗：取同一批樣品（批號為160107，質(zhì)量濃度為3.95 mg／g），加入高、中、低濃度鹽酸水蘇堿對照品適量，與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1，0.5∶1，依法進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸水蘇堿加樣回收試驗（n＝9）

重復性試驗：取同一批樣品（批號為 160107），按低、中、高不同含量樣品取樣，每份樣品分別制備3份，根據(jù)含量測定結(jié)果進行評價。結(jié)果供試品中鹽酸水蘇堿平均含量為3.95 mg／g，RSD為2.51%（n＝9），表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：取同一批樣品（批號為160107），按低、中、高不同含量樣品取樣，每份樣品分別制備 3份，由實驗室不同的操作人員與不同儀器測定進行評價。結(jié)果供試品中鹽酸水蘇堿平均含量為3.99 mg／g，RSD為0.71%（n＝9），表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取放置0，2，4，8，12 h時的供試品溶液，分別進樣，測定鹽酸水蘇堿的峰面積積分值。結(jié)果的 RSD為1.03%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 樣品含量測定

取10批樣品，依法測定，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，10批樣品中的鹽酸水蘇堿平均含量為每粒1.91 mg，最低為1.69 mg，考慮到益母草藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、工業(yè)化大生產(chǎn)中有效成分轉(zhuǎn)移率、有效成分穩(wěn)定性等因素對成品中鹽酸水蘇堿含量的影響，為保證產(chǎn)品在有效期內(nèi)有效成分含量符合質(zhì)量標準要求，暫訂每粒含益母草以鹽酸水蘇堿（C7H13NO2·HCl）計，不得少于1.0 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別

現(xiàn)行標準無益母草TLC鑒別，本研究中以益母草對照藥材作對照，以硅膠G為吸附劑，建立益母草的TLC鑒別方法。經(jīng)耐用性考察方法穩(wěn)定，缺益母草陰性對照品試驗未見干擾?，F(xiàn)有標準木香的TLC展開劑為苯－醋酸乙酯（19∶1），因苯毒性較大，長期使用，會對周圍環(huán)境及操作人員的身體健康造成傷害。曾選擇不同展開劑、不同濃度香草醛硫酸溶液顯色試驗，確定以環(huán)己烷－乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，以5%香草醛硫酸溶液為顯色劑，較2015年版《中國藥典（一部）》收載的木香TLC鑒別條件[展開劑為環(huán)己烷－甲酸乙酯－甲酸（17∶3∶1）]效果更佳[5]。本研究中建立的木香TLC鑒別方法，經(jīng)耐用性試驗，斑點清晰，缺木香陰性樣品試驗未見干擾?，F(xiàn)有標準經(jīng)改進后，處方中的益母草、當歸、川芎及木香4味藥材都采用對照藥材作對照，全部建立了TLC鑒別方法。

表2 10批樣品含量測定結(jié)果(n＝2，mg)

3.2 檢測方法選擇

益母草為方中君藥，鹽酸水蘇堿是益母草主要活性成分，因此將鹽酸水蘇堿作為本品質(zhì)量控制指標性成分。目前，測定益母草及其制劑中鹽酸水蘇堿含量的方法有薄層掃描（TLCS）法，如婦康寧片、加味益母顆粒[6－7]；高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC－MS）法，如婦寧丸、益母草及其顆粒劑[8－9]；高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELXD）法，如益母草膠囊[10]；高效液相色譜－紫外檢測器（HPLC－UV）法，如益芪顆粒、癃閉舒膠囊、八珍益母片、益母草膏、益母草片、益母草膠囊及益母草顆粒[11－16]。其中HPLC－UV法靈敏度高，重復性好，易于操作，應用廣泛。本品現(xiàn)標準采用TLCS法，在操作過程中因受各種因素影響，可操作性較差，展開劑的比例和展開環(huán)境（溫度、濕度）、薄層板固定相的厚度與緊密度、顯色時所噴顯色劑的量及在薄層板上的均勻度，均會影響最終測定結(jié)果，故確定用HPLC法測定本品中鹽酸水蘇堿的含量。

3.3 色譜柱選擇

2015年版《中國藥典（一部）》收載品種和文獻報道中，用HPLC法測定益母草及其制劑中的鹽酸水蘇堿用強陽離子交換（SCX）色譜柱，本研究中在選擇色譜柱時對氨基鍵合硅膠與強陽離子交換柱進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基柱的分離效果明顯優(yōu)于陽離子交換柱，因此選擇氨基柱作為分離本品的色譜柱。本品益母草采用水提醇沉，當歸、川芎及木香用70%乙醇提取制備而成，利用鹽酸水蘇堿易溶于水和乙醇的特性，供試品直接醇提，上氧化鋁柱純化，去除了脂溶性成分的干擾。與薄層色譜法測定鹽酸水蘇含量比較，本研究中建立的HPLC法具有操作簡單、快速、準確的特點，能更好地控制本品質(zhì)量。

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Improvement of the Quality Standard of Fufang Yimu Capsule

Li Ke1,Chen Dan2,Li Ruocun1,Jiang Bo1,Lin Fanyou3,Wang Wentian3
(1.Hunan Academy of TCM,Changsha,Hunan,China 410013; 2.Xiangtan Medical and Health Vocational and Technical College,Xiangtan,Hunan, China 411102; 3.Xiangyu Pharmaceutical Limited by Share Ltd.,Linyi,Shangdong,China 276023)

Objective To improve the quality control standard of Fufang Yimu Capsule.M ethods TLC was used for identification of LeonuriHerba in Fufang Yimu Capsule.HPLC was used for quantitative analysis.The Hypersil NH2column(250 mm×4.6 mm，5 m) was used with the mobile phase of mixture of phosphate buffer－acetonitrile(pH＝5.5,20∶80),the detection wavelength was 192 nm.Results TLC sports developed were fairy clear,and the blank test showed no interference.The linear relationship of stachydrine hydrochloride was good in the range of 0.027－0.162 g／L(r＝0.999 5).The average recovery rate was 97.58%,RSD＝2.82%（n＝9）.Conclusion The established qualitative and quantitative analysis method is applicable for the quality control of Fufang Yimu Capsule.

Fufang Yimu Capsule;quality standard;HPLC;stachydrine hydrochloride

R284.1

A

1006－4931(2017)15－0016－04

2017－04－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.005

李柯，碩士研究生，工程師，研究方向為中藥新藥工藝與質(zhì)量標準，（電子信箱）17848689＠qq.com。

陳丹，碩士研究生，講師，研究方向為藥物制劑，（電話）0731－88807491（電子信箱）252916321＠qq.com。