黃振華，梁煒，潘磊，張鵬，付敏，錢暉，許文榮，蔣鵬程，張徐

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

·液體活檢與臨床實驗研究·

胃癌患者血清LINC00978表達及其臨床意義*

黃振華1,2，梁煒1，潘磊1,2，張鵬1，付敏2，錢暉1，許文榮1，蔣鵬程2，張徐1

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇省檢驗醫(yī)學重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科，江蘇鎮(zhèn)江 212002)

目的 檢測胃癌患者血清中LINC00978表達水平，評估其表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并探討其臨床診斷價值。方法 實時熒光定量RT-PCR檢測LINC00978在胃癌細胞、體檢健康者、胃良性疾病及胃癌患者血清中的表達水平，分析其與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并用ROC曲線分析其診斷效能。結(jié)果LINC00978在人胃癌細胞系MGC-803中的表達水平(18.88±1.15)明顯高于胃黏膜上皮細胞(1.00±0.03)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-21.926，P<0.05)。LINC00978在胃癌患者血清中的平均含量[3.525(1.385，8.954)]較胃良性疾病患者[0.419(0.258，1.369)]和體檢健康者[0.814(0.351，2.510)]均明顯升高(Z值分別為-4.834和-4.686；P均<0.01)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期相關(guān)(r分別為0.448、0.369和0.383，P均<0.01)；胃癌患者術(shù)后血清中LINC00978的表達水平[0.17(0.15,0.39)]較術(shù)前[0.98(0.59,1.61)]明顯降低(Z=-5.731，P<0.01)。與體檢健康者相比，LINC00978在胃良性疾病患者血清中表達差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.693，P>0.05)。胃癌患者血清LINC00978的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.807，95%可信區(qū)間(CI)為0.723～0.882，當cut-off值為1.806時，其診斷胃癌的敏感性為71.4%，特異性為75.9%。結(jié)論LINC00978在胃癌患者血清中呈高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期相關(guān)，有望成為潛在的胃癌診斷的生物學標志物。

胃癌；LINC00978；血清；生物學標志物

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，無蛋白質(zhì)編碼功能。lncRNA種類繁多，結(jié)構(gòu)各異，在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、表觀遺傳調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用，廣泛參與機體生理和病理過程[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA異常表達與胃癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，有望成為胃癌診斷、預(yù)后和治療的新靶點[3-6]。本研究檢測胃癌患者血清中LINC00978表達水平，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并評估血清LINC00978作為胃癌診斷新指標的潛能。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2015年4月至2017年1月江蘇大學附屬人民醫(yī)院普外科就診的胃癌患者63例，男45例，女18例，年齡35～88歲，中位年齡63歲。納入標準：(1)經(jīng)病理組織學活檢確診為胃癌；(2)術(shù)前未行放化療或全身治療；(3)無嚴重其他系統(tǒng)疾患。排除其他腫瘤病史以及術(shù)前行化療或放療等輔助治療的患者,且均無嚴重的肝腎功能損傷。收集胃癌患者臨床病理參數(shù)，包括性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期等。選取同期就診且年齡和性別匹配的胃良性疾病患者20例，男13例，女7例，年齡33～74歲，中位年齡58歲，均經(jīng)胃鏡明確診斷為胃炎，且不患有其他消化系統(tǒng)疾病史。選取38例同期年齡和性別匹配的體檢健康者作為對照，男26例，女12例，年齡37～76歲，中位年齡61歲。樣本采集經(jīng)江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 血清樣本采集及處理 采集各研究對象治療前(體檢健康者于體檢時)及胃癌患者術(shù)后1周時空腹靜脈血2 mL，4 ℃、3 000×g離心10 min分離血清，4 ℃、12 000×g離心10 min以去除細胞碎片，血清分裝后置-80 ℃保存。

1.3 細胞系、主要試劑和儀器 人胃粘膜上皮細胞系GES-1、人胃癌細胞系MGC-803購自中國科學院上海細胞庫；高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol試劑(美國Gibco公司)，QIAzol裂解液、血清RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix(康為世紀公司)；CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio Rad公司)，NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

1.4 細胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的GES-1細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；取生長狀態(tài)良好的MGC-803細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞均置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用Trizol試劑提取GES-1和MGC-803(1×106個)細胞總RNA，用QIAzol裂解液提取胃癌患者、胃良性疾病患者及體檢健康者血清中總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的RNA樣本，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。

1.6 引物設(shè)計與合成 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計LINC00978(NR_024373.2)和U6(NG_043158.2)引物序列，并由上海英濰捷基公司合成。LINC00978上游引物(F)：5′-AGGCCCCAGGGAATCTTTCA-3′；下游引物序列(R)：5′-GCCTCTCCCTGAATAACTGGG-3′，產(chǎn)物片段大小為158 bp。U6上游引物序列(F)：5′-CTCGCTTTGGCAGCACA-3′；下游引物序列(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物片段大小為94 bp。

1.7 實時熒光定量RT-PCR 采用CFX96實時熒光定量PCR儀進行分析，按照UltraSYBR實時熒光定量RT-PCR Mixture試劑盒說明書配置反應(yīng)體系。PCR總反應(yīng)體積為20 μL，包括2×SYRR Green PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA模板1.5 μL，RNase free ddH2O 7.9 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。LINC00978的相對表達水平用2-△△Ct法計算，公式：△△Ct=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct管家基因)]。

2 結(jié)果

2.1LINC00978在胃癌細胞中的表達 實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與GES-1細胞(1.00±0.03)相比，LINC00978在MGC-803細胞中的表達水平(18.88±1.15)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=-21.926，P<0.05)。

2.2LINC00978在胃癌患者血清中的表達LINC00978在胃癌患者血清中的含量[3.525(1.385，8.954)]較胃良性疾病患者[0.419(0.258，1.369)]和體檢健康者[0.814(0.351，2.510)]均明顯升高(Z值分別為-4.834和-4.686；P均<0.01)，而胃良性疾病患者血清中LINC00978含量與體檢健康者相比差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.693，P>0.05)。此外，在10例胃癌患者術(shù)前術(shù)后血清樣本中的9例胃癌患者術(shù)后血清LINC00978表達水平[0.17(0.15,0.39)]較相應(yīng)的術(shù)前表達水平[0.98(0.59,1.61)]明顯降低(Z=-5.731，P<0.01)。

2.3LINC00978與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，LINC00978的表達水平與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡、分化程度、腫瘤大小及血管或神經(jīng)受累無關(guān)。見表1。

表1 胃癌患者血清LINC00978表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 胃癌患者血清LINC00978的ROC曲線及診斷效能分析 以胃良性疾病患者和體檢健康者作為對照組(58例)，胃癌患者作為疾病組(63例)，繪制ROC曲線分析胃癌患者血清LINC00978的診斷價值。胃癌患者血清LINC00978的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.807，95%可信區(qū)間(CI)為(0.732～0.882)，當cut-off 值為1.806時，敏感性為71.4%，特異性為75.9%，見圖1。

圖1 血清LINC00978診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

LncRNA的功能及作用已成為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點。研究表明，多種lncRNA在胃癌中異常表達，包括AFAP1-AS1[7]、HOXA11-AS[8-9]、CRNDE[10]、ZFAS1[11]和DANCR[12]等，這些lncRNA通過多種機制參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。血漿、血清以及其他體液標本中含有核酸分子。早期研究報道腫瘤患者血清中存在異常表達的DNA，可作為預(yù)后和預(yù)測的生物學標志物[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，一些RNA分子(如miRNA、lncRNA)也可穩(wěn)定地存在于血清中，因此可作為腫瘤早期診斷的潛在標志物[13]。如GACAT2在胃癌患者血漿中表達明顯增加，在術(shù)后患者血漿中表達降低，其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和周圍神經(jīng)侵襲明顯相關(guān)，血漿GACAT2可作為胃癌篩查和療效預(yù)測的分子標志物[14]。H19在胃癌患者血漿中表達上調(diào)，表達水平與TNM分期相關(guān)；研究表明，當cut-off值為0.5時，AUCROC為0.724，敏感性為68.75%，特異性為67.67%。當H19與CEA聯(lián)合應(yīng)用時，AUCROC可達0.804[15]。

LINC00978(又稱AK001796、MIR4435-2HG)位于染色體2q13上。Yang等[16]首次發(fā)現(xiàn)其在肺癌組織中呈過表達。Deng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00978在乳腺癌細胞和乳腺癌組織中表達上調(diào)，生存曲線分析結(jié)果顯示LINC00978高表達提示預(yù)后不良，可作為乳腺癌患者預(yù)后判斷的良好指標。然而，LINC00978在胃癌中的表達情況仍不清楚，到目前為止，國內(nèi)尚未見LINC00978在胃癌中的相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中可檢測出LINC00978，且胃癌患者血清LINC00978表達水平較胃良性疾病患者和體檢健康者明顯增加，表明LINC00978在胃癌中表達上調(diào)，這與Ke等[13]報道的胃癌組織lncRNA表達譜芯片結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清LINC00978高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤和TNM分期相關(guān)，提示LINC00978可能是參與胃癌惡性進展的重要lncRNA分子。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌患者術(shù)后血清LINC00978表達水平較術(shù)前明顯降低，提示LINC00978可作為監(jiān)測手術(shù)治療效果的可靠指標。ROC曲線分析顯示胃癌患者血清LINC00978的AUCROC達0.807。LINC00978能否與其他指標聯(lián)合應(yīng)用以提高診斷效能仍值得深入研究。此外，血清LINC00978的表達水平與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系也有待進一步探討。

LINC00978在腫瘤中的作用機制尚不明確，目前僅有Deng等[17]報道LINC00978敲減導(dǎo)致肺癌細胞增殖能力明顯抑制。抑制LINC00978表達可誘導(dǎo)細胞周期阻滯于G0/G1期，引起細胞周期相關(guān)基因如CDC6和CDK1等表達改變[16]，提示LINC00978可能參與調(diào)控細胞周期進程，促進腫瘤細胞增殖。我們將在今后研究中深入探討LINC00978在胃癌中的生物學作用及分子機制，以進一步明確其在胃癌診斷中的應(yīng)用價值。

[1]Huarte M. The emerging role of lncRNAs in cancer[J]. Nat Med, 2015, 21(11): 1253-1261.

[2]Schmitt AM, Chang HY. Long noncoding RNAs in cancer pathways[J]. Cancer Cell, 2016, 29(4): 452-463.

[3]Gu Y, Chen T, Li G,etal. LncRNAs: emerging biomarkers in gastric cancer[J]. Future Oncol, 2015, 11(17): 2427-2441.

[4]Wang J, Sun J, Wang J,etal. Long noncoding RNAs in gastric cancer: functions and clinical applications[J]. Onco Targets Ther, 2016, 9: 681-697.

[5]Riquelme I, Ili C, Roa JC,etal. Long non-coding RNAs in gastric cancer: mechanisms and potential applications[J]. Oncotarget, 2016. doi: 10.18632/oncotarget.9396.

[6]Zhang K, Shi H, Xi H,etal. Genome-wide lncRNA microarray profiling identifies novel circulating lncRNAs for detection of gastric cancer[J]. Theranostics, 2017, 7(1): 213-227.

[7]Guo JQ, Li SJ, Guo GX. Long noncoding RNA AFAP1-AS1 promotes cell proliferation and apoptosis of gastric cancer cells via PTEN/p-AKT pathway[J]. Dig Dis Sci, 2017. doi: 10.1007/s10620-017-4584-0.

[8]Liu Z, Chen Z, Fan R,etal. Over-expressed long noncoding RNA HOXA11-AS promotes cell cycle progression and metastasis in gastric cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 82.

[9]Sun M, Nie F, Wang Y,etal. LncRNA HOXA11-AS promotes proliferation and invasion of gastric cancer by scaffolding the chromatin modification factors PRC2, LSD1, and DNMT1[J]. Cancer Res, 2016, 76(21): 6299-6310.

[10]Hu CE, Du PZ, Zhang HD,etal. Long Noncoding RNA CRNDE promotes proliferation of gastric cancer cells by targeting miR-145[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 42(1): 13-21.

[11]Pan L, Liang W, Fu M,etal. Exosomes-mediated transfer of long noncoding RNA ZFAS1 promotes gastric cancer progression[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2017,143(6):991-1004.

[12]李陽, 潘磊, 梁煒, 等. 胃癌患者血清外泌體中DANCR表達及其臨床意義[J]. 臨床檢驗雜志, 2017, 35(3): 171-174.

[13]Ke D, Li H, Zhang Y,etal. The combination of circulating long noncoding RNAs AK001058, INHBA-AS1, MIR4435-2HG, and CEBPA-AS1 fragments in plasma serve as diagnostic markers for gastric cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(13): 21516-21525.

[14]Tan L, Yang Y, Shao Y,etal. Plasma lncRNA-GACAT2 is a valuable marker for the screening of gastric cancer[J]. Oncol Lett, 2016, 12(6): 4845-4849.

[15]Hashad D, Elbanna A, Ibrahim A,etal. Evaluation of the role of circulating long non-coding RNA H19 as a promising novel biomarker in plasma of patients with gastric cancer[J]. J Clin Lab Anal, 2016, 30(6): 1100-1105.

[16]Yang Q, Xu E, Dai J,etal. A novel long noncoding RNA AK001796 acts as an oncogene and is involved in cell growth inhibition by resveratrol in lung cancer[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 285(2): 79-88.

[17]Deng LL, Chi YY, Liu L,etal.LINC00978 predicts poor prognosis in breast cancer patients[J]. Sci Rep, 2016, 6: 37936.

(本文編輯：許曉蒙)

Expression of serumLINC00978 in gastric cancer patients and its clinical significance

HUANGZhen-hua1, 2,LIANGWei1,PANLei1, 2,ZHANGPeng1,FUMin1,QIANHui1,XUWen-rong1,JIANGPeng-cheng1,ZHANGXu1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople'sHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212002,Jiangsu,China)

Objective To investigate the expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients and its correlation with clinicopathological characteristics, and evaluate its clinical diagnostic value. Methods The expression levels ofLINC00978 in gastric cancer cells and serum samples from the patients with gastric cancer or gastric benign diseases and healthy controls were detected by real-time qRT-PCR, and its correlations with clinicopathological parameters were analyzed. The diagnostic efficacy of serumLINC00978 was evaluated by the receiver operating characteristic (ROC) curve. Results The expression levels ofLINC00978 in MGC-803 cells were significantly higher than that in GES-1 cells (18.88±1.15 vs 1.00±0.03,t=-21.926,P<0.05). The expression levels (median[P25,P75]) of serumLINC00978 in gastric cancer patients (3.525[1.385, 8.954]) were significantly higher than those in the patients with gastric benign diseases (0.419[0.258, 1.369],Z=-4.834,P<0.01) and healthy controls (0.814[0.351, 2.510],Z=-4.686,P<0.01). The expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients were significantly related to lymphatic metastasis (r=0.448,P<0.01), invasive depth (r=0.369,P<0.01) and TNM stage (r=0.383,P<0.01), and those after operation significantly lower than before operation (0.17[0.15,0.39] vs 0.98[0.59,1.61],Z=-5.731,P<0.01). There was no significant difference in serumLINC00978 levels between the patients with gastric benign diseases and healthy controls (Z=-1.693,P>0.05). The area under the ROC curve (AUCROC) and 95% confidence interval (CI) of serumLINC00978 levels in the diagnosis of gastric cancer were 0.807 and 0.732-0.882, respectively. When the cutoff value was 1.806, the sensitivity and specificity for the diagnosis of gastric cancer were 71.4% and 75.9%, respectively. Conclusion The expression levels of serumLINC00978 in gastric cancer patients increase and are related to lymphatic metastasis, invasive depth and TNM stage, which may be served as a novel biomarker for the diagnosis of gastric cancer.

gastric cancer;LINC00978; serum; biomarker

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.04

國家自然科學基金面上項目(81572075, 81672416)；江蘇省自然科學基金面上項目(BK20141303)；江蘇省重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(BE2015667)；鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(SH2015034)；江蘇省“青藍工程”，江蘇省“333工程”。

黃振華，1992年生，男，碩士研究生，從事胃腸道腫瘤診斷研究。

張徐，副教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：xuzhang@ujs.edu.cn；蔣鵬程，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:jpc18906106623@126.com。

R375.2

A

2017-05-22)