吳文耀,華若伊,杜麗,蒲清泉,嚴(yán)佳,楊蜜,何云燕,夏云

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016；2.重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

納米金探針液相雜交法檢測核酸序列依賴擴(kuò)增產(chǎn)物診斷侵襲性曲霉病*

吳文耀1,華若伊1,杜麗1,蒲清泉1,嚴(yán)佳1,楊蜜1,何云燕2,夏云1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016；2.重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400016)

目的 建立納米金探針液相雜交法檢測核酸序列依賴擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)產(chǎn)物，用于快速診斷侵襲性曲霉病(IA)。方法 采用NASBA擴(kuò)增曲霉菌屬特異性18S rRNA保守序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與5′端經(jīng)巰基化俢飾的特異性納米金探針進(jìn)行液相雜交，用該法檢測106例臨床血液標(biāo)本(14例確診，32例擬診，60例未感染IA),并與GM試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果 納米金探針只與曲霉菌屬菌株的NASBA產(chǎn)物出現(xiàn)陽性雜交反應(yīng)，而其他非曲霉菌均為陰性。NASBA-納米金液相雜交法檢測106例臨床標(biāo)本的敏感性和特異性分別為82.61%(38/46)、81.67%(49/60),ROC曲線下面積(AUCROC)為0.890。GM試驗(yàn)檢測的敏感性和特異性分別為56.52%(26/46)和83.33%(50/60)，AUCROC為0.723。結(jié)論 NASBA-納米金液相雜交技術(shù)檢測曲霉菌感染具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單的特點(diǎn)，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。

核酸序列依賴擴(kuò)增；侵襲性曲霉?。磺咕?；納米金探針

侵襲性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)是一種嚴(yán)重的系統(tǒng)性真菌感染，特別是近年來臨床上廣泛使用免疫抑制劑、細(xì)胞毒藥物及化療藥物，使其在免疫抑制或者免疫低下患者中的發(fā)病率和病死率明顯上升[1-2]。分子生物學(xué)檢測較傳統(tǒng)的培養(yǎng)和涂片等方法具有更高的準(zhǔn)確性，但因人員和設(shè)備要求等原因臨床應(yīng)用較少。核酸序列依賴擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是基于PCR擴(kuò)增發(fā)展起來的一項(xiàng)新型的恒溫、敏感的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在2 h內(nèi)可將靶基因RNA擴(kuò)增109～1012倍[3]，擴(kuò)增效率高且不易受到DNA的污染。NASBA產(chǎn)物多采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，該法雖然操作簡單，但由于產(chǎn)物是單鏈RNA容易降解[4]，從而影響檢測的敏感性。近年來，納米金粒子用于檢測DNA[5]、RNA[6]、蛋白質(zhì)[7]和金屬離子[8]等已多見報(bào)道，該方法操作簡單，特異性及敏感性高，結(jié)果形成肉眼可見的顏色變化或者在反向色譜盤上可現(xiàn)黑色的凝集顆粒便于觀察，且不需任何儀器設(shè)備，便于臨床開展，達(dá)到早期、快速檢測IA的目的。本研究旨在建立一種NASBA聯(lián)合納米金探針技術(shù)檢測血清標(biāo)本中曲霉菌屬特異性18S rRNA保守序列用以診斷IA。

1 材料和方法

1.1 病例選擇 根據(jù)歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(EORTC/MSG )2008 年修訂的定義為診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，將確診、擬診歸為陽性病例，收集我院自2014年9月至2016年4月共106份臨床血液標(biāo)本，其中46例為IA感染病例(14例為確診，32例為擬診)，其余60例為排除曲霉感染的病例。血液標(biāo)本離心分離血清后,分裝于離心管中，置-80 ℃保存。

1.2 菌株來源 標(biāo)準(zhǔn)菌株煙曲霉CMCC A1a、黃曲霉ATCC 204304、黑曲霉ATCC 16404、構(gòu)巢曲霉ATCC 24919、金黃色葡萄球ATCC 29213、銅綠假單胞菌ATCC 27853、大腸埃希菌ATCC 25922、白色念珠菌ATCC 64548、近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC 6258、肺炎克雷伯菌ATCC 700603均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。新型隱球菌FY 226、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌、熱帶念珠菌、茄病鐮刀菌、尖端賽多孢菌均為臨床分離菌株。

1.3 儀器與試劑 核酸擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司),凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H(RNase H)、核糖核酸酶抑制劑RNasin(Promega公司)，NTP、dNTP、T7 RNA聚合酶(TaKaRa公司)，血液總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物公司)，曲霉菌半乳甘露聚糖檢測試劑盒(Bio-Rad公司)，直徑60 nm膠體金溶液(南京先鋒納米材料公司)，反向色譜盤(青島海浪公司)。

1.4 引物及探針 為提高檢測敏感性，曲霉菌擴(kuò)增的靶序列針對具有屬特異性的多拷貝的18S rRNA 保守序列區(qū)[10]，采用文獻(xiàn)[11]報(bào)道的引物和探針序列，上游引物序列: 5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACA-3′，下劃線部分含有T7啟動(dòng)子序列；下游引物序列:5′-GCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3′; 雜交探針序列：5′-GGTCCGCCTCACCGCGAGTACTG-3′，其5′端經(jīng)巰基化俢飾，由上海生工公司合成。

1.5 NASBA-納米金液相雜交技術(shù)

1.5.1 納米金探針的制備 按參考文獻(xiàn)[12-13]的方法并稍加改進(jìn)，取800 μL納米金溶液，12 000×g離心30 min，棄上清，加46 μL TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA)重懸，同時(shí)加入4 μL 100 μmol/L的巰基探針，充分混勻，室溫避光靜置16 h后加入50 μL磷酸鹽A(0.2 mol/L NaCl 20 mmol/L PBS pH 7.0)室溫避光靜置48 h。12 000×g離心30 min后棄上清，加入100 μL磷酸鹽B(0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L PBS pH 7.0)，12 000×g離心30 min。加入50 μL磷酸鹽B重懸酒紅色油狀物，混勻后置4 ℃保存。

1.5.2 菌株RNA及血清標(biāo)本RNA提取 用接種環(huán)將培養(yǎng)好的曲霉菌刮到研缽(0.1% DEPC處理ddH2O浸泡24 h并高壓滅菌)中，加入液氮研磨，然后用Trizol試劑提取。按血液總RNA提取試劑盒說明書操作提取血清中的游離RNA。提取的RNA樣本置-80 ℃保存。

1.5.3 NASBA納米金探針液相雜交 NASBA擴(kuò)增體系的建立：按參考文獻(xiàn)[14]，將擴(kuò)增后的NASBA產(chǎn)物用75%的無水乙醇(0.1% DEPC處理ddH2O配制)洗滌，12 000×g離心5 min，棄去上清。加入10 μL的雜交緩沖液(1.2 mol/L NaCl,0.02% SDS,20 mmol/L PBS)和10 μL的納米金探針，65 ℃ 5 min,41 ℃ 5 min反應(yīng)后，室溫避光靜置1 h。根據(jù)以下兩種方法檢測雜交產(chǎn)物。方法一：肉眼直接觀察，將反應(yīng)后的EP管置于白色背景下，陽性結(jié)果為反應(yīng)體系顏色由酒紅色變成灰藍(lán)色，陰性則無顏色變化。 方法二：反應(yīng)產(chǎn)物12 000×g離心1 min，吸取管底5 μL反應(yīng)產(chǎn)物滴在反向色譜反應(yīng)盤上觀察。陽性結(jié)果加樣中心點(diǎn)有肉眼可見的黑色顆粒，陰性則無黑色顆粒凝集。

1.5.4 NASBA產(chǎn)物電泳檢測 配制10 g/L的瓊脂糖凝膠和1×TAE電泳緩沖液，每加樣孔加5 μL樣本，130～150 V恒壓電泳20 min，凝膠成像儀掃描并拍照。

1.5.5 NASBA-納米金探針法臨床應(yīng)用評(píng)價(jià) 采用GM 試驗(yàn)進(jìn)行對比分析，按照曲霉菌半乳甘露聚糖檢測試劑盒說明書操作檢測GM。質(zhì)控、對照標(biāo)本的吸光度(A)值通過Tecan酶聯(lián)儀進(jìn)行測定，在450/620 nm波長下讀取A值，根據(jù)樣本檢測值的計(jì)算指數(shù)GMI判定，GMI=樣本A值均值/cut-off 質(zhì)控A值均值，若GMI<0.5，則判為陰性，若GMI≥0.5，則判為陽性。用NASBA-納米金探針法和GM試驗(yàn)分別檢測106例臨床標(biāo)本，比較其特異性、敏感性以及ROC曲線下面積(AUCROC)評(píng)價(jià)兩種方法的診斷效能。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn) 將提取的曲霉菌屬和非曲霉菌屬的細(xì)菌及真菌的總RNA采用NASBA方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和與金納米探針液相雜交，觀察實(shí)驗(yàn)特異性。結(jié)果顯示，只有曲霉菌屬菌株提取的RNA經(jīng)NASBA擴(kuò)增后，電泳分析示在243 bp位置可見明亮的電泳條帶，且NASBA產(chǎn)物與納米金探針液相雜交后出現(xiàn)由酒紅至灰藍(lán)的顏色變化，反向色譜盤出現(xiàn)黑色凝集顆粒，其他非曲霉菌屬的細(xì)菌及真菌均為陰性。見圖1。表明所用的引物和探針具有良好的特異性。

注：A，NASBA產(chǎn)物電泳分析結(jié)果；B，NASBA產(chǎn)物與納米金探針雜交體系顏色變化結(jié)果；C，NASBA產(chǎn)物與納米金探針反向色譜盤上反應(yīng)結(jié)果；1，煙曲霉(CMCC A1a)；2，黑曲霉(ATCC 16404)；3，黃曲霉(ATCC 204304)；4，構(gòu)巢曲霉(ATCC 24919)；5，金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)；6，銅綠假單胞菌(ATCC 27853)；7，大腸埃希菌(ATCC 25922)；8，白色念珠菌(ATCC 64548)；9，新型隱球菌(FY 226)；10，近平滑念珠菌(ATCC 22019)；11，克柔念珠菌(ATCC 6258)；12，肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)；13，鮑曼不動(dòng)桿菌；14，陰溝腸桿菌；15，熱帶念珠菌；16，茄病鐮刀菌；17，尖端賽多孢菌。

圖1 NASBA-納米金探針雜交特異性檢測

2.2 臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果 用NASBA-納米金探針法和GM試驗(yàn)檢測臨床106份標(biāo)本。結(jié)果表明，NASBA-納米金探針法檢測的敏感性和特異性分別為82.61%(38/46)和81.67(49/60)，ROC曲線下面積(AUCROC)為0.890。GM試驗(yàn)檢測的敏感性和特異性分別為56.52%(26/46)和83.33%(50/60)，AUCROC為0.723。見圖2。

圖2 GM試驗(yàn)和NASBA-納米金探針試驗(yàn)ROC曲線分析

3 討論

NASBA是一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增方法，通過單鏈RNA擴(kuò)增可以迅速放大靶基因片段，其敏感性高，特異性好，擴(kuò)增效率高，在以往的研究中通過系列稀釋煙曲霉菌CMCC A1a的孢子，其檢測限可達(dá)1 CFU/mL[14]。但目前其產(chǎn)物RNA單鏈檢測多通過電泳方法，由于RNA易降解故電泳要求條件較高，且電泳時(shí)間過長易導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性，為進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性，本研究采用新型的納米金探針法檢測NASBA產(chǎn)物，將巰基修飾的短鏈寡核苷酸探針固定在納米金顆粒表面，通過堿基互補(bǔ)配對原理從反應(yīng)物中捕獲靶序列，形成RNA-DNA雜化雙鏈結(jié)構(gòu)，從而降低了金顆粒之間電荷互斥作用，使金顆粒相互聚集成網(wǎng)狀交聯(lián)，形成肉眼可見的顏色變化或反向色譜盤檢測檢出黑色凝集顆粒。

從本研究結(jié)果來看，對106例臨床血液標(biāo)本用GM試驗(yàn)進(jìn)行檢測,其敏感性為56.52%，特異性為83.33%，AUCROC為0.723，盡管GM試驗(yàn)已被納入EORTC/MSG的標(biāo)準(zhǔn)，但其敏感性較低(56.52%)，特異性尚可(83.33%)，故至少需要檢測2次以提高診斷的準(zhǔn)確性。而NASBA-納米金探針方法檢測的敏感性及特異性分別為82.61%和81.67%，AUCROC為0.890，表明NASBA-納米金探針方法對于曲霉菌檢測的敏感性較GM試驗(yàn)明顯提高，AUCROC明顯增大。對IA感染的診斷效能明顯優(yōu)于GM試驗(yàn)，具有良好的發(fā)展前景。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠通過特異性引物、熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和鑒定，在IA的診斷中應(yīng)用越來越多。Wang等[15]報(bào)道，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IA的敏感性和特異性分別為67.65%和89.13%，與本研究相比，該方法具有更高的特異性，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR對IA高?；颊叩拇_診具有很高的應(yīng)用價(jià)值，但其敏感性僅為67.65%，比本研究建立的NSABA-納米金探針法的敏感性(82.61%)明顯偏低，可能與血清標(biāo)本中曲霉菌DNA含量低有關(guān)。NASBA-納米金探針法的高敏感性是由于NASBA具有更高的擴(kuò)增效率，且采用粒徑較大的60 nm膠體金顆?？梢蕴岣咂浔砻娣e，包被更多量的巰基探針，更大限度的捕獲反應(yīng)體系中的目的靶序列，雜交產(chǎn)物離心后可使納米金聚合產(chǎn)物迅速沉淀，大大提高檢測的敏感性。同時(shí)本研究對NASBA-納米金探針方法的特異性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)只有模板RNA來自曲霉菌屬時(shí)瓊脂糖凝膠電泳才會(huì)在243 bp附近出現(xiàn)電泳條帶，反應(yīng)體系出現(xiàn)陽性雜交反應(yīng)。而其他非曲霉菌屬均未出現(xiàn)條帶，雜交反應(yīng)亦表現(xiàn)為陰性。說明NASBA-膠體金雜交方法具有良好的特異性，此種特異性是由NASBA擴(kuò)增引物的特異性以及納米金顆粒探針的特異性雙重因素所決定的。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，NASBA-納米金探針液相雜交診斷IA較為敏感，且只有帶T7啟動(dòng)子的引物序列才會(huì)被大量擴(kuò)增，因此不會(huì)受到環(huán)境DNA污染出現(xiàn)假陽性；納米金探針制備容易，檢測快速，反應(yīng)體系結(jié)果便于觀察，不需要專門的儀器設(shè)備，非常適合一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展。因此，采用NASBA和納米金探針聯(lián)合檢測IA的方法頗具臨床應(yīng)用前景，為臨床早期診斷IA提供了一種新的方法。

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(本文編輯：許曉蒙)

Detection of nucleic acid sequence-based amplification products by gold nanoprobe-based solution hybridization for the diagnosis of invasiveaspergillosis

WUWen-yao1,HUARuo-yi1,DULi1,PUQing-quan1,YANJia1,YANGMi1,HEYun-yan2,XIAYun1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongqingPeople′sHospital,Chongqing400016,China)

Objective To establish a method of gold nanoprobe-based solution hybridization (GNBSH) to detect nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) products for the rapid diagnosis of invasiveaspergillosis(IA). Methods The Aspergillus specific 18S rRNA was amplified by NASBA and then the amplified products were hybridized with the gold nanoprobes which were modified with thiol compounds at the 5′ end. Serum samples from 106 patients, including 14 with a definite IA, 32 with suspected IA and 60 without IA, were detected by the established method, and the obtained results were compared with that of galactomannan (GM) test to evaluate its accuracy. Results The gold nanoprobes only hybridized with Aspergillus NASBA products but not other non-Aspergillus strains. The sensitivity, specificity and the area under the ROC curve (AUCROC) of the established GNBSH method for detecting 106 clinical samples were 82.61% (38/46), 81.67% (49/60) and 0.890, respectively. The sensitivity, specificity and AUCROCof GM test were 56.52% (26/46), 83.33% (50/60) and 0.723, respectively. Conclusion The established GNBSH method to detect Aspergillus NASBA products has high sensitivity and specificity and simple operation, which may be used to detect the infection of Aspergillus by clinical laboratories.

nucleic acid sequence-based amplification; invasiveaspergillosis; Aspergillus; gold nanoprobe

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.09

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(20160129)。

吳文耀，1991年生，女，碩士研究生，主要從事微生物方向研究。

夏云，主任技師，E-mail：xiayun12cn@aliyun.com。

R446.5

A

2017-05-28)