朱紅艷，牛華，符浩，鄭永欽，孟強

(1.昆明理工大學附屬醫(yī)院檢驗科，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 a.檢驗科，b.神經(jīng)內(nèi)科，c.臨床基礎研究所，昆明 650032；3.昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650032)

·研究生園地·

大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞氧糖剝奪/復氧模型中內(nèi)參基因的選擇*

朱紅艷1,2a,3，牛華2a，符浩2b，鄭永欽2c，孟強2b

(1.昆明理工大學附屬醫(yī)院檢驗科，昆明 650032；2.云南省第一人民醫(yī)院 a.檢驗科，b.神經(jīng)內(nèi)科，c.臨床基礎研究所，昆明 650032；3.昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650032)

目的 篩選大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞氧糖剝奪/復氧(OGD/R)模型中合適的內(nèi)參基因。方法 實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測3種常用管家基因：3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白(ACTB)、核糖體蛋白L13A(RPL13A)在大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞中的表達水平；并采用GeNorm程序分析得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果RPL13A、GAPDH、ACTB基因表達穩(wěn)定度的平均值(M值)分別為0.590、0.570、0.397。結(jié)論 在大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞OGD/R模型中表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是RPL13A，最穩(wěn)定內(nèi)參基因是ACTB。

內(nèi)參基因；GeNorm程序；實時熒光定量PCR；氧糖剝奪/復氧模型；腦微血管內(nèi)皮細胞

實時熒光定量PCR技術(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)是分子生物學和細胞生物學中廣泛用來檢測基因表達的一種常用方法。但是在實際研究過程中，由于易受到細胞數(shù)量、標本大小、不同實驗條件的影響，必須使用內(nèi)參基因進行校正才能獲得更為真實可信的結(jié)果。由于管家基因在不同的物種，不同組織和不同實驗條件下的表達也具有特異性，其表達的穩(wěn)定性是相對的。因此，研究者需要根據(jù)自己的樣品類型和實驗條件選擇合適的管家基因作為內(nèi)參基因。氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprive/reoxygenation, OGDR)模型是常用的體外研究腦缺血再灌注模型。本研究旨在篩選最合適的大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelia cells, BMECs )OGD/R模型中內(nèi)參基因。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6只新生SD大鼠乳鼠，日齡3～5 d，購于昆明醫(yī)科大學動物中心，動物試驗遵守國家相關條例規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器 EastepTM總RNA 提取試劑盒(LS1030)，Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A5000)購自上海普洛麥格公司，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(RR820A, 大連寶生物公司);Nanodrop2000分光光度計、梯度PCR儀(美國Thermo scientific公司),LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(德國Roche公司),Forma 3131 三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)和氧糖剝奪/復氧模型 原代腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)實驗步驟參照Burek等[1]的方法并稍作改進：常規(guī)培養(yǎng)并傳代腦微血管內(nèi)皮細胞(消化用酶為0.2% Ⅳ型膠原酶和0.2%中性蛋白酶各3 mL)。取生長狀態(tài)良好的第3～4代細胞，按1×105/mL細胞密度接種至6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞融合度達70%～80%時用于后續(xù)實驗。實驗分別設氧糖剝奪(OGD)組：培養(yǎng)基換成無糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)(94% N2，5% CO2，1% O2)1、2、3、6、24 h；氧糖剝奪/復氧(OGDR)組：先按上述條件低氧培養(yǎng)2 h后恢復正常氧濃度，再用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1、2、3、6、24 h；選取與上兩組一致的同一代細胞按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)后作為正常對照組。每個時間點做3個復孔。

1.2.2 cDNA合成 參照EastepTM總RNA(LS1030)提取試劑盒說明書操作提取細胞總RNA。用Nanodrop2000分光光度計測定RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1間的樣本用于后續(xù)實驗。按照Promega GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，RNA和cDNA樣本均置于-80 ℃保存。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 引物由大連寶生物公司設計并合成。引物序列見表1。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行PCR反應。PCR總反應體系為20 μL,包括SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。循環(huán)參數(shù)： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃，1個循環(huán)； 50 ℃ 30 s。經(jīng)LightCycler 480配套軟件對各管家基因的循環(huán)閾值(Ct值)和熔解曲線進行分析。結(jié)果判讀：先找出某一管家基因Ct值最小者(該樣本基因表達量為1)，求出各樣本該管家基因△Ct，△Ct=各樣本Ct-最小者Ct值，然后求出各樣本該管家基因的相對表達量(2-△Ct值)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析 從GeNorm官網(wǎng)下載GeNorm程序程序，并將這些數(shù)值導入程序，計算每個基因的穩(wěn)定性即平均值(M)(每行代表1個樣品，列是待選內(nèi)參基因， M值越小，表達度越穩(wěn)定)，以M值對管家基因的表達度進行排序，選擇M值最高的管家基因，點擊刪除，軟件重新計算剩下基因的穩(wěn)定性，以此類推，直到在計算陣列中僅剩2個基因，這2個基因就是表達最穩(wěn)定的基因[2]。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量PCR結(jié)果ACTB、RPL13A和GAPDH3種管家基因的Ct值均為10～16，熔解曲線示3種管家基因熔解峰單一，表明PCR擴增出特異性產(chǎn)物。見圖1。

2.2 3種基因表達穩(wěn)定度 GeNorm程序計算得到的RPL13A、GAPDH、ACTB基因的M值分別為0.590、0.570、0.397。ACTB基因M值最小，故而是模型中表達最穩(wěn)定的基因。

3 討論

在qRT-PCR實驗標準化中，內(nèi)參基因的選擇是一個重要的部分。理想狀態(tài)下管家基因的表達應該不受試驗條件或不同的組織、細胞的影響，然而，這樣的基因尚未被發(fā)現(xiàn)[3]。目前尚無適合于所有體系作為內(nèi)參的管家基因，因此，研究者需根據(jù)試驗樣品類型和條件來選擇合適的內(nèi)參基因。

GeNorm是Vandesompele等[2]開發(fā)的基于微軟Excel平臺的VBA宏程序，特別為內(nèi)參基因的選擇而設計，以被廣泛驗證，并成功應用于多項研究[4]。該程序通過計算某一管家基因與其他所有基因間兩兩比值的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均變異度(M)值作為基因穩(wěn)定性的評價指標，M值越小表明其越穩(wěn)定[5]。通過GeNorm計算分析發(fā)現(xiàn)，在本研究中RPL13A最不穩(wěn)定，ACTB是在所分析3個基因中表達最穩(wěn)定的，GAPDH處于兩者之間。ACTB是一種細胞骨架蛋白，存在于所有的真核細胞中且高度保守[6]，有報道稱在大鼠心肌梗死模型中ACTB表達最不穩(wěn)定[5]，結(jié)果與本研究存在較大的差異，分析原因可能是因為選取的組織細胞來源不同所致。GAPDH是糖酵解、糖異生過程中的關鍵酶。Zhong等[7]研究證實在缺氧條件下GAPDHmRNA表達量增加，不適合作為內(nèi)參基因。另有研究發(fā)現(xiàn)，7個管家基因：GAPDH，RPS4X，RPLl3A，RNPSl，EEFlAl，TPTl，SRPl4中GAPDH是表達最不穩(wěn)定的[8]。在本研究中，GAPDH表達穩(wěn)定性處于ACTB和RPL13A之間。不同研究獲得的矛盾結(jié)論可能與樣本和實驗條件的不同有關。因此，在qRT-PCR分析中首先必須根據(jù)實驗條件確定合適的內(nèi)參基因。但因?qū)嶒灄l件所限，本研究所選的內(nèi)參基因數(shù)量略少，一般文獻都推薦同時選5至6個以上管家基因同時篩選得到試驗所選最佳內(nèi)參基因。今后，我們將擴大管家基因的數(shù)量，并進行進一步的研究證實。

注：A,GAPDH擴增曲線;B，GAPDH熔解曲線；C,ACTB擴增曲線;D,ACTB熔解曲線;E,RPL13A擴增曲線;F,RPL13A熔解曲線。

圖1 實時熒光定量PCR儀分析各基因的擴增曲線和熔解曲線

[1]Burek M, Salvador E, Forster CY. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model[J]. J Vis Exp, 2012，66:e4022.

[2]Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F,etal. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biol, 2002,3(7):H34.

[3]Liu DW, Chen ST, Liu HP. Choice of endogenous control for gene expression in nonsmall cell lung cancer[J]. Eur Respir J, 2005,26(6):1002-1008.

[4]Zhang X, Ding L, Sandford AJ. Selection of reference genes for gene expression studies in human neutrophils by real-time PCR[J]. BMC Mol Biol, 2005,6:4.

[5]趙傳艷, 王昕, 張春亮, 等. 大鼠心肌梗死模型中管家基因的選擇[J]. 國際生物醫(yī)學工程雜志, 2013,36(4):216-219.

[6]董恩妮, 梁青, 李利, 等. 實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇[J]. 中國畜牧雜志, 2013,49(11):92-96.

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.08.21

國家自然科學基金(81460188)；云南省應用基礎研究(昆醫(yī)聯(lián)合專項)(2013FB201)；云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才(2012HB028)；云南省衛(wèi)生系統(tǒng)學科帶頭人(D-201235)；王隴德院士工作站。

朱紅艷，1980年生，女，主管技師，博士研究生，主要從事醫(yī)學檢驗工作。

孟強，主任醫(yī)師，博士研究生導師，E-mail:mq301@sina.com.cn。

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2017-05-07)