褚 浩，王勤章，錢 成，王議鶴，吳 雙，錢 彪

Mirco-CT在大鼠腎結(jié)石研究中的應(yīng)用價(jià)值探討

褚 浩1，王勤章2，錢 成2，王議鶴2，吳 雙2，錢 彪2

腎結(jié)石；動(dòng)物模型；HE染色；Micro-CT

腎結(jié)石是泌尿外科常見(jiàn)疾病，發(fā)病率較高。圍繞腎結(jié)石病因?qū)W研究所建立的動(dòng)物模型已經(jīng)較為成熟，以往腎結(jié)石動(dòng)物模型的研究多是從生化、病理甚至蛋白角度出發(fā)，臨床多采用X線、CT等影像學(xué)技術(shù)對(duì)泌尿系結(jié)石進(jìn)行診斷，而微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(micro computed tomography, Mirco-CT)是一種采用了與普通臨床CT不同的微焦點(diǎn)X線球管，對(duì)活體小動(dòng)物或多種硬組織進(jìn)行掃描成像分析的技術(shù)，該技術(shù)在一些基礎(chǔ)研究領(lǐng)域已有所建樹(shù)[1-2]，本實(shí)驗(yàn)首次采用Mirco-CT對(duì)腎結(jié)石大鼠模型進(jìn)行掃描，并與HE染色的病理結(jié)果進(jìn)行比較，探討這種新方法的可行性，希望能為以后腎結(jié)石的相關(guān)研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與器材 選取6周齡左右SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體重(200±20) g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(新) 2013-0001]。各組大鼠均先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成對(duì)照組(A組20只)和結(jié)石組(B組20只)。氯化銨(天津永晟公司)，乙二醇(天津福晨公司)，基本飼料(石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(BX40，日本Olympus)、Mirco-CT(skyscan1176，比利時(shí)Antwerpen)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腎結(jié)石模型建立及實(shí)驗(yàn)取材 參照李笑然等[3]提供的造模方法建立動(dòng)物模型，B組給予1%乙二醇飲水+2%氯化銨2 mL每天，A組正常飲水+飲用水2 mL每天，各組灌胃15天，8周后將大鼠全部處死，收集雙側(cè)腎臟標(biāo)本，觀察腎臟大體情況，用10%中性福爾馬林固定。

1.2.2 記錄大鼠一般情況 于第8周觀察各組大鼠的飲食飲水、精神狀態(tài)、行為活動(dòng)等。

1.2.3 Mirco-CT掃描 將腎臟標(biāo)本固定在放射源和照相機(jī)之間，沿垂直長(zhǎng)軸作0.9°～180°旋轉(zhuǎn)，使用Mirco-CT進(jìn)行掃描，掃描條件：功率8 W、電壓30 kV，電流300 μA，分辨率35 μm 2 000×1 336，F(xiàn)ilter=0.5 mmAL，以確定是否存在高密度結(jié)石樣物質(zhì)，并進(jìn)行拍照及三維重建。

1.2.4 病理組織學(xué)檢查 將腎臟標(biāo)本石蠟包埋制片后固定于載玻片上，HE染色，光鏡下觀察結(jié)晶的形成情況，參考文獻(xiàn)提供的腎臟結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[4]，結(jié)晶分級(jí)：0度為陰性，Ⅰ～Ⅳ度為陽(yáng)性，以HE染色為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Mirco-CT對(duì)結(jié)石診斷的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 8周時(shí)A組大鼠進(jìn)食飲水良好、活躍好動(dòng)；同時(shí)B組大鼠進(jìn)食偏少，活動(dòng)減少，精神萎靡，個(gè)別大鼠出現(xiàn)血尿，實(shí)驗(yàn)期間2只死亡。

2.2 Mirco-CT掃描檢查 A組大鼠腎臟Mirco-CT初步掃描顯示腎臟輪廓清晰，邊緣無(wú)毛糙，重建后三視圖圖像腎盂、腎皮質(zhì)及腎髓質(zhì)均未見(jiàn)高密度影；B組大鼠腎臟掃描可見(jiàn)顆粒樣高密度影分布于各腎盞中，重建后三視圖可見(jiàn)高亮片狀影隨機(jī)分布于各平面的腎髓質(zhì)結(jié)構(gòu)中，結(jié)石最大體積見(jiàn)圖1。B組36例腎臟中檢出7例，檢出率為19.4%，A組40例腎臟均未檢出，B組的檢出率較A組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠腎臟結(jié)晶的形成情況及腎臟病理改變

2.3.1 眼觀 與A組相比，B組腎臟出現(xiàn)不同程度腫大，顏色變淺或發(fā)白，部分腎臟可見(jiàn)少數(shù)顆粒斑點(diǎn)分布于腎臟表面。

2.3.2 鏡檢 A組大鼠腎臟內(nèi)無(wú)草酸鈣結(jié)晶沉積，未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變。B組較A組腎小管有不同程度的擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死，腎皮質(zhì)可見(jiàn)草酸鈣結(jié)晶形成(圖2)，B組36例腎臟中結(jié)晶0級(jí)10例，Ⅰ級(jí)10例，Ⅱ級(jí)8例，Ⅲ級(jí)6例，Ⅳ級(jí)2例，陽(yáng)性率為72.2%，A組40例腎臟均為陰性，B組成石率較A組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HE染色相比，Mirco-CT的結(jié)石診斷靈敏度為23.1%、特異度為90%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.7%、陰性預(yù)測(cè)值為31.0%、準(zhǔn)確率為41.7%，根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.083(95%CI：-0.078～0.256)，表明Mirco-CT與HE染色對(duì)結(jié)石檢出率一致性較差(表1)。

圖1 兩組大鼠腎臟Mirco-CT掃描圖

ab

圖2 兩組腎臟石蠟切片：a. A組大鼠腎臟內(nèi)無(wú)草酸鈣結(jié)晶沉積，未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變；b. B組腎小管有不同程度的擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死，腎皮質(zhì)可見(jiàn)草酸鈣結(jié)晶形成

表1 HE染色和Mirco-CT檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3 討論

經(jīng)典的動(dòng)物腎結(jié)石模型研究方法采用HE染色病理切片等方法研究尿中晶體黏附、生長(zhǎng)和聚集于腎小管上皮細(xì)胞，并在腎內(nèi)或腎乳頭表面形成結(jié)石斑，并經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最終生成腎結(jié)石的動(dòng)態(tài)過(guò)程[3,5]。從微觀的細(xì)胞損傷發(fā)展到結(jié)晶聚集生成進(jìn)而形成宏觀的腎結(jié)石，上述病理方法雖然能夠較好的發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石形成中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，但缺乏對(duì)后期結(jié)石形成后宏觀整體意義上的描述，因此，尋求一種更直觀的檢查方法來(lái)觀察腎結(jié)石形成部位、數(shù)量等情況，評(píng)價(jià)動(dòng)物模型建立效果。

Mirco-CT是近年來(lái)發(fā)展較快的一種高分辨率三維定量分析技術(shù)，其觀察和測(cè)量骨組織相對(duì)于傳統(tǒng)的組織切片技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)[6]，因此在分析研究骨骼等高密度標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域得到一定應(yīng)用[7-9]。鑒于結(jié)石具有高密度物理特性，因此在以往相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型[10-11]，嘗試?yán)肕irco-CT技術(shù)，定性分析腎結(jié)石大鼠腎臟成石情況，同時(shí)與HE染色結(jié)果進(jìn)行橫向?qū)Ρ?，探討Mirco-CT的應(yīng)用價(jià)值。

由于氯化銨具有腎毒性，8周時(shí)B組大鼠體質(zhì)較A組明顯下降，實(shí)驗(yàn)期間B組2只大鼠死亡，但不影響腎臟樣本量的可信度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B組大鼠腎臟的HE染色病理切片腎小管內(nèi)出現(xiàn)了結(jié)石結(jié)晶，結(jié)晶形成率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明造模成功，同時(shí)B組大鼠腎臟Mirco-CT平掃及重建均顯示出高密度影，且檢出率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明Mirco-CT用來(lái)驗(yàn)證腎結(jié)石造模效果具有一定意義，實(shí)驗(yàn)中有1例出現(xiàn)腎臟Mirco-CT陽(yáng)性而病理陰性，考慮切片部位誤差引起，也說(shuō)明即便是HE染色，也可能存在假陰性。以HE染色為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Mirco-CT對(duì)結(jié)石診斷的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確率，得出Kappa值為0.083，表明Mirco-CT與HE染色對(duì)結(jié)石檢出率一致性較差，分析其原因：一方面考慮到兩種檢測(cè)手段關(guān)注的是結(jié)石形成的不同時(shí)期，HE染色著重描述前期結(jié)晶形成時(shí)的腎臟細(xì)胞損傷，Mirco-CT觀測(cè)的是后期結(jié)晶大量堆積后轉(zhuǎn)化為結(jié)石的腎臟整體，甚至在早期結(jié)石顆粒形成較少時(shí)，Mirco-CT也可能存在一定的漏診，此外，8周的造模時(shí)間對(duì)于較明顯的結(jié)石形成也可能稍顯倉(cāng)促，另一方面因?qū)irco-CT的使用經(jīng)驗(yàn)不足、操作水平有待提高，參數(shù)設(shè)置可進(jìn)一步調(diào)整，這些均有待于進(jìn)一步探討分析。

這正如臨床上病理檢查能發(fā)現(xiàn)許多CT及X線不能發(fā)現(xiàn)的病變，而CT及X線仍然有自己擅長(zhǎng)的領(lǐng)域一樣，Mirco-CT在顯示結(jié)石部位、形態(tài)、數(shù)量，多角度還原腎臟結(jié)石三維空間物理性質(zhì)，建立高質(zhì)量病灶整體影像等方面具有后者不可比擬的優(yōu)勢(shì)。值得注意的是Mirco-CT掃描過(guò)程中活體動(dòng)物的輕微活動(dòng)均可造成相當(dāng)程度的偽影，同時(shí)大鼠的毗鄰腹腔臟器存在干擾因素，斟酌之下，作者初步采用離體腎臟觀測(cè)方式，取得了一定的效果，但也說(shuō)明該項(xiàng)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)技能和思路要求較高。必須指出Mirco-CT不能完全取代組織病理與生物學(xué)檢測(cè)，它只能提供腎臟及結(jié)石的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)成信息，而不如組織病理學(xué)與生物學(xué)檢測(cè)那樣可以描述細(xì)胞損傷與結(jié)晶形成的相互過(guò)程，即不能描述結(jié)石發(fā)生的機(jī)制。所以，在腎結(jié)石以致泌尿系結(jié)石的研究中，可充分利用Mirco-CT在物理形態(tài)測(cè)量方而的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合組織功能與形態(tài)測(cè)量的結(jié)果，綜合判斷腎臟功能和結(jié)石結(jié)構(gòu)變化的成因。

參考de Oliveira等[12-13]的研究，作者將研究采用增加樣本量、延長(zhǎng)造模時(shí)間、造影劑標(biāo)記等方法，進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)石的密度、體積、三維立體圖像等結(jié)果，與以往平面的組織病理切片測(cè)量相比，Mirco-CT所得三維體視學(xué)參數(shù)更能真實(shí)反映腎臟及結(jié)石的真實(shí)性狀，可以為結(jié)石疾病的發(fā)病機(jī)制提供更為詳實(shí)的物理數(shù)據(jù)，為動(dòng)物腎結(jié)石模型及疾病的診斷、測(cè)量、手術(shù)路徑的設(shè)計(jì)、模型分析等方面提供更直接、更準(zhǔn)確的信息。

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國(guó)家自然科學(xué)基金(81460140)

1湖北省武漢市第三醫(yī)院(武漢市同仁醫(yī)院)，武漢 4300602石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，石河子 832000

褚 浩，男，碩士研究生。E-mail: 251784865@qq.com 錢 彪，男，碩士，副教授，通訊作者。E-mail: qb2003_2000@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.026.html

R 319； R 692.4

B

1001-7399(2017)08-0929-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.026

接受日期：2017-03-21