楊長(zhǎng)紹，杜亞茜，丁曉潔，楊延龍，李 權(quán)，郭銀金，劉俊熙，周永春

云南地區(qū)非小細(xì)胞肺癌患者外周血EGFR基因突變與臨床病理特征的關(guān)系

楊長(zhǎng)紹，杜亞茜，丁曉潔，楊延龍，李 權(quán)，郭銀金，劉俊熙，周永春

目的 探討云南地區(qū)非小細(xì)胞肺癌外周血中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變及與臨床病理特征的關(guān)系，為該地區(qū)的肺癌個(gè)體化靶向治療奠定基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)外周血中EGFR基因第18、19、20及2l外顯子突變情況，統(tǒng)計(jì)分析各類(lèi)突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 在364例患者中，EGFR基因突變者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突變占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突變占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突變分別占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突變分別占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；雙突變比例占11.8%，其中3例樣本3.2%(3/93)存在G719X、S768I雙突變，4例樣本4.3%(4/93)存在19Del、T790M雙突變，1例樣本1.1%(1/93)存在19Del、L858R雙突變，1例樣本1.1%(1/93)存在L858R、S768I雙突變，2例樣本2.2%(2/93)存在S768I、T790M雙突變。EGFR基因突變與患者性別、臨床分期、組織學(xué)類(lèi)型相關(guān)(P<0.005)，而與患者年齡、是否吸煙無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 云南地區(qū)ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者外周血中，女性腺癌突變率較高，且該地區(qū)NSCLC患者外周血EGFR基因突變存在外顯子19缺失突變?yōu)橹骷半p突變率較高的特征。使用ARMS技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者外周血EGFR基因突變可為臨床使用EGFR-TKIs提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)。

肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；表皮生長(zhǎng)因子受體；外周血；突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年因肺癌死亡的人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)，其中非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)最常見(jiàn)，占全部肺癌的80%～90%[1]。我國(guó)肺癌病死率較高，而云南的肺癌發(fā)病率與病死率位居國(guó)內(nèi)榜首，存在區(qū)域性點(diǎn)狀高發(fā)、女性高發(fā)的特征。分子靶向治療被認(rèn)為是治療晚期NSCLC的主要方法，其中表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變狀態(tài)是決定EGFR-TKIs療效最重要的預(yù)測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)是決定患者是否能夠應(yīng)用EGFR-TKIs治療的先決條件[2]。目前腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關(guān)信息的主要來(lái)源，然而大部分患者就診時(shí)已是晚期，組織標(biāo)本獲得比較困難、組織異質(zhì)性及無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等諸多因素限制了有效的EGFR基因突變檢測(cè)，為臨床醫(yī)師是否選擇使用TKIs治療帶來(lái)困難。相關(guān)研究報(bào)道[3]，實(shí)體腫瘤患者的外周血中存在來(lái)源于凋亡、壞死腫瘤細(xì)胞的游離DNA。多項(xiàng)回顧性和前瞻性研究也表明，當(dāng)腫瘤組織難以獲取時(shí)，血液循環(huán)游離或腫瘤DNA(cf/ctDNA)檢測(cè)是突變分析合適的替代品[4-5]?！斗切〖?xì)胞肺癌血液EGFR基因突變檢測(cè)中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》明確指出：無(wú)法獲取足夠腫瘤組織及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的晚期肺腺癌患者，可用血液標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS)檢測(cè)NSCLC患者外周血EGFR突變狀態(tài)，探討云南地區(qū)NSCLC患者外周血EGFR基因突變的流行狀況，同時(shí)與患者臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，為不能進(jìn)行組織EGFR突變檢測(cè)的患者使用分子靶向治療提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取云南省腫瘤醫(yī)院2015年11月～2016年9月期間存檔的NSCLC Ⅱb～Ⅳ期患者外周血液標(biāo)本364例。364例NSCLC患者中，男性217例(59.6%)，女性147例(40.4%)；中位年齡60歲(26～86歲)，其中≥60歲者185例(50.8%)，<60歲者179例(49.2%)；病理分型：腺癌254例(69.8%)，非腺癌110例(30.2%)；臨床分期：ⅡB～ⅢA期76例(20.9%)，ⅢB～Ⅳ期288例(79.1%)；曾經(jīng)或正在吸煙者165例(45.3%)，從未有過(guò)吸煙史者199例(54.7%)。

熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P)購(gòu)自安捷倫科技公司，微量紫外分光光度計(jì)(Nano Drop 2000)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，核酸提取試劑Circulating DNA Kit(Spin Column)及人類(lèi)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)均購(gòu)于廈門(mén)艾德生物公司。

1.2 樣本處理及DNA提取 用含EDTA抗凝劑采血管，抽吸體積為10 mL外周血，立即將采集好血樣的采血管輕柔地上下顛倒混勻；然后2 000g4 ℃離心10 min，取上清，將獲得的上清再8 000g4 ℃離心10 min，取上清，此上清即為血漿。按Circulating DNA Kit(Spin Column)說(shuō)明書(shū)提取DNA，所提取的DNA保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 ARMS 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)EGFR基因突變。分別取42.3 μL樣品DNA、陽(yáng)性及陰性質(zhì)控品，加入2.7 μL Taq酶，混勻后加入八聯(lián)PCR管中，每管5 μL。每次反應(yīng)均設(shè)置陽(yáng)性及陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)參數(shù)：第一階段：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；第三階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)；并在第三階段60 ℃時(shí)收集FAM和HEX(或VIC)信號(hào)。突變結(jié)果根據(jù)說(shuō)明書(shū)判讀原則進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析EGFR基因突變與臨床分期、患者性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型、有無(wú)吸煙等臨床病理特征的相關(guān)性，χ2檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變頻率與類(lèi)型 364例患者中，EGFR基因突變患者93例(25.5%)。其中EGFR 18 G719X突變占3.2%(3/93)，EGFR 19缺失突變占48.4%(45/93)，EGFR 20 S768I、T790M、20ins突變分別占3.2%(3/93)、2.2%(2/93)、3.2%(3/93)，EGFR 21 L858R、L861Q突變分別占26.9%(25/93)、1.1%(1/93)；且有3例標(biāo)本(3.2%，3/93)存在G719X、S768I雙突變，4例標(biāo)本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M雙突變，1例標(biāo)本(1.1%，1/93)存在19Del、L858R雙突變，1例標(biāo)本(1.1%，1/93)存在L858R、S768I雙突變，2例標(biāo)本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M雙突變(圖1)。

圖1 云南地區(qū)非小細(xì)胞肺癌患者 外周血EGFR基因突變分布

2.2 EGFR基因突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性 147例女性患者中，52例(35.3%)有EGFR基因突變，明顯高于男性患者(18.9%)(P<0.001，表1)。ⅢB～Ⅳ期NSCLC患者88例(30.6%)有EGFR基因突變，顯著高于ⅡB～ⅢA期患者(6.6%，P<0.001)。腺癌患者EGFR基因突變率高于非腺癌患者(33.5%vs7.3%)，差異有顯著性(P<0.001)，而與年齡、是否吸煙無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 云南地區(qū)外周血EGFR突變與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

3 討論

EGFR基因位于人第7號(hào)染色體p13-q22區(qū)域，全長(zhǎng)約20萬(wàn)個(gè)堿基，共有28個(gè)外顯子，分別編碼胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)三個(gè)部分，共1 186個(gè)氨基酸，其糖基化蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為17.0×104，胞內(nèi)區(qū)具有絡(luò)氨酸激酶活性，負(fù)責(zé)將胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)。EGFR可通過(guò)與配體結(jié)合后自動(dòng)激活其同源或異源二聚體以及酪氨酸酶的自身磷酸化，從而導(dǎo)致其下游：Ras→Raf→MAPK和PI3K→PKC→IKK途徑的激活。這些信號(hào)途徑的激活可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、生存、侵襲和轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成，是許多惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展惡化、預(yù)后差的原因。大量研究表明[6-7]，EGFR基因第18、19、21外顯子發(fā)生突變的NSCLC患者服用EGFR-TKIs類(lèi)藥物的療效較好，而EGFR野生型患者則無(wú)法從中獲益。因此，檢測(cè)肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)，對(duì)是否應(yīng)用EGFR-TKI藥物及療效預(yù)測(cè)意義重大。腫瘤組織樣本(手術(shù)、活檢、細(xì)胞蠟塊)是檢測(cè)晚期NSCLC EGFR突變狀態(tài)最適合的樣本來(lái)源。然而并非所有患者都能提供足夠的組織樣本，可通過(guò)經(jīng)支氣管鏡、肺穿刺活檢或胸腔積液標(biāo)本來(lái)進(jìn)行突變檢測(cè)，但仍不能覆蓋所有晚期患者。目前已有大量的研究證實(shí)[5,8]，外周血游離DNA中EGFR基因突變狀態(tài)與腫瘤組織中的EGFR基因突變狀態(tài)具有高度的相關(guān)性。且2014年9月歐洲藥品管理局已批準(zhǔn)可采用ctDNA標(biāo)本來(lái)評(píng)估EGFR突變狀態(tài)；中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2015年2月也已批準(zhǔn)Gefitinib說(shuō)明書(shū)更新，在推薦所有NSCLC患者的腫瘤組織都應(yīng)進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了如果腫瘤標(biāo)本不可評(píng)估，則可使用從血液(血漿)標(biāo)本中獲得的ctDNA。 ctDNA是指人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動(dòng)的攜帶一定特征(包括突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等)來(lái)自腫瘤基因組的DNA片段。ctDNA的主要來(lái)源包括壞死的腫瘤細(xì)胞、凋亡的腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌的外排體。

云南地區(qū)肺癌發(fā)病率與病死率一直位居國(guó)內(nèi)榜首，與全球及我國(guó)其他省份的肺癌高發(fā)不同，云南的肺癌表現(xiàn)為區(qū)域性點(diǎn)狀高發(fā)，主要集中在個(gè)舊和宣威兩個(gè)地區(qū)[9]。分析其原因，除煙草暴露外，室內(nèi)污染、職業(yè)性暴露與肺癌發(fā)病有重要的關(guān)系。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，宣威地區(qū)肺癌的高發(fā)與工業(yè)污染無(wú)明顯關(guān)系，但生活燃料、室內(nèi)燃煤空氣污染卻與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)；個(gè)舊地區(qū)錫礦工人中肺癌發(fā)病率異常主要與職業(yè)性暴露因素相關(guān)，如氡子體、砷和粉塵等。本組實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)檢測(cè)外周血游離DNA中EGFR基因突變狀態(tài)，探討云南地區(qū)NSCLC患者外周血EGFR突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析，為不能進(jìn)行組織EGFR突變檢測(cè)的患者使用分子靶向治療提供證據(jù)。

目前血液EGFR基因突變檢測(cè)方法主要有ARMS技術(shù)、二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)、數(shù)字PCR等[5,10-11]。NGS技術(shù)擴(kuò)展了基因突變檢測(cè)的深度和廣度[10]，但其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用更需要大量數(shù)據(jù)積累。數(shù)字PCR在血漿EGFR突變檢測(cè)上具有較高的靈敏度和特異度[11]，但目前報(bào)道的該方法檢測(cè)EGFR突變位點(diǎn)相對(duì)有限，仍處在摸索、累積經(jīng)驗(yàn)階段，其對(duì)操作人員和環(huán)境均有較高的要求，未來(lái)應(yīng)用于臨床尚需大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證。目前成熟且常用檢測(cè)血液EGFR基因突變的方法是ARMS技術(shù)，該技術(shù)檢測(cè)血漿相比于腫瘤組織其EGFR敏感型突變的靈敏度在65%～88%，特異度在90%～100%，且已被歐盟批準(zhǔn)用于指導(dǎo)EGFR-TKIs治療的血液檢測(cè)方法[5,8]。

本組實(shí)驗(yàn)中ⅡB～ⅢA期NSCLC EGFR基因突變發(fā)生率為6.6%(5/76)，ⅢB～Ⅳ期為30.6%(88/288)，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。多項(xiàng)研究表明[6,12]，在女性、腺癌和非吸煙者中EGFR基因的突變率較高。本組實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)在腺癌患者中EGFR的突變率(33.5%vs7.3%)明顯高于非腺癌患者，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；女性患者EGFR基因突變占40.4%(147/364)，突變率(35.3%vs18.9%，P<0.001)顯著高于男性患者，與之前的研究報(bào)道相符。但吸煙患者EGFR基因突變率(21.8%)與不吸煙患者突變率(28.6%)相比，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[12]不吸煙的NSCLC患者EGFR突變率高于既往吸煙者存在差異，可能是云南部分地區(qū)主要以煙煤為主要生活燃料，煙煤燃燒后排放出含有大量以苯并(A)芘為代表的致癌性多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)的特殊煤煙污染環(huán)境有關(guān)。

在中國(guó)EGFR基因的突變存在顯著的地域差異，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]，臺(tái)灣地區(qū)的EGFR基因的突變以外顯子21為主，云南和廣東地區(qū)以外顯子19為主；本組結(jié)果顯示，云南地區(qū)NSCLC患者外周血中，EGFR基因的突變主要發(fā)生在19號(hào)外顯子，與報(bào)道一致。EGFR基因敏感性突變中最常見(jiàn)、與臨床療效最為相關(guān)的突變包括19外顯子缺失突變及21外顯子L858R突變，這兩類(lèi)經(jīng)典突變占所有EGFR突變的62%～83%[15]；本組364例患者外周血中EGFR基因19外顯子缺失突變及21外顯子L858R突變占總突變的76.3%(71/93)，與之前的研究報(bào)道相符。目前20外顯子的T790M突變的作用也比較明確，即與EGFR-TKIs原發(fā)及繼發(fā)耐藥相關(guān)。本組中T790M突變占2.2%(2/93)，均為原發(fā)耐藥；另有6例標(biāo)本(6.5%，6/93)存在繼發(fā)耐藥突變，其中4例標(biāo)本(4.3%，4/93)存在19Del、T790M雙突變，2例標(biāo)本(2.2%，2/93)存在S768I、T790M雙突變。少見(jiàn)突變即除外19缺失突變、L858R、T790M突變以外的所有突變，如E709、G719、S768、L861等位點(diǎn)的氨基酸替換突變[16]。本組少見(jiàn)突變位點(diǎn)中最常發(fā)生的突變位點(diǎn)為G719X及S768I。G719X位于EGFR基因18外顯子第719位的甘氨酸(Glysine，G719)，正好坐落在ATP結(jié)合活化位點(diǎn)附近的磷酸化結(jié)合環(huán)(phosphate-binding loop, P-loop)上，該位點(diǎn)氨基酸的核苷酸密碼子為GGC，當(dāng)該核苷酸密碼子發(fā)生點(diǎn)突變時(shí)，甘氨酸可突變?yōu)楸彼?Alanine, G719A)、絲氨酸(Serine, G719S)和半胱氨酸(Cysteine, G719C)；本組中G719X(X代表A、C或S)突變約占總突變的6.5%(6/93)，合并其他突變者3例，G719X發(fā)生雙突變的概率為50%。S768I突變是發(fā)生在EGFR基因20外顯子768號(hào)密碼子的點(diǎn)突變(G>T)；本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)S768I單突變3例，合并其他突變者6例，S768I發(fā)生雙突變的概率為66.7%，這與Chen等[17]報(bào)道在EGFR基因G719、S768、T790、L861等區(qū)域更易合并雙突變的結(jié)果部分一致。L861Q突變是由2828位點(diǎn)的T被A取代所致，本組有1例標(biāo)本1.1%(1/93)存在L861Q突變，與報(bào)道[18]EGFR-L861Q僅占EGFR突變陽(yáng)性的1.12%一致。

在云南地區(qū)NSCLC中外周血EGFR基因的突變以外顯子19的缺失突變?yōu)橹?，突變率以腺癌和女性較高。且該地區(qū)EGFR少見(jiàn)突變及雙突變相對(duì)其它地區(qū)較高，EGFR少見(jiàn)突變作為特殊類(lèi)型的EGFR突變，不同亞型對(duì)EGFR-TKIs的敏感性不盡相同。因此，檢測(cè)EGFR非常重要，但對(duì)于部分患者，特別是ⅢB～Ⅳ期患者很難取到組織標(biāo)本，為臨床醫(yī)師是否選擇使用TKIs治療帶來(lái)困難。血液ctDNA EGFR檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)、便捷、實(shí)時(shí)可獲取的特點(diǎn)，能在一定程度上幫助解決組織樣本量不足、異質(zhì)性及反復(fù)動(dòng)態(tài)活檢的問(wèn)題，可作為組織檢測(cè)的補(bǔ)充。但目前血液ctDNA EGFR檢測(cè)尚存在臨床應(yīng)用范圍、適用人群、檢測(cè)方法等方面標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一，如何有效合理的應(yīng)用血液EGFR檢測(cè)已成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。

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Relationship between EGFR gene mutation and clinicopathologicalfeatures in peripheral blood of patients with non-small celllung cancer in Yunnan area

YANG Chang-shao, DU Ya-xi, DING Xiao-jie, YANG Yan-long, LI Quan, GUO Yin-jin, LIU Jun-xi, ZHOU Yong-chun

(TumorResearchInstitute,theTumorHospitalofYunnanProvince,KeyLaboratoryofLungCancerResearchofYunnanProvince,Kunming650106,China)

Purpose To investigate the prevalence of EGFR mutation in circulating cell-free DNA in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients of Yunnan province and its relationship with clinical pathological characteristics, which can provide foundations for individualized targeted therapy of lung cancer in this area. Methods Amplification refractory mutation system (ARMS) was used to detect the EGFR exon 18, 19, 20 and 21 mutation in circulating cell-free DNA. The relationship between EGFR mutation and clinical characteristics were further analyzed. Results 93 patients (25.5%) harbored circulating EGFR mutations among 364 patients. The mutation rates of EGFR 18 G719X, 19del, 20 S768I, T790M, 20ins were 3.2% (3/93), 2.2% (2/93) and 3.2% (3/93) respectively. EGFR 21 L858R and L861Q mutation rates were 26.9% (25/93) and 1.1% (1/93), respectively. Three patients (3.2%, 3/93) harbored G719X+S768I double mutation, four patients (4.3%, 4/93) harbored 19Del+T790M mutations. 19Del+L858R, L858R+S768I, and S768I+T790M mutation rates were 1.1%(1/93), 1.1%(1/93)and 2.2%(2/93)respectively. Conclusion The EGFR mutation rate of female and adenocarcinoma patients is higher in patients with stage ⅢB-Ⅳ NSCLC in Yunnan area. 19Del is the major mutation type and double exon mutation is an obvious characteristic in NSCLC patients of Yunnan province. EGFR mutation detection in circulating cell-free DNA by ARMS method is feasible to screen patients receiving EGFR-TKIs treatment.

lung neoplasms; non-small cell lung cancer; epidermal growth factor receptor; peripheral blood; amplification refractory mutation system

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460441)、云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2016FB145)、云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NS001)

云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所/云南省肺癌研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650106

楊長(zhǎng)紹，男，技師。Tel: (0871)68179504，E-mail: yangchangshao@126.com 周永春，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。Tel: (0871)68179505，E-mail: chungui7625@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.010.html

R 734.2

A

1001-7399(2017)08-0874-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.010

接受日期：2017-04-27