橘皮提取液抑菌作用研究

路志芳 張超

（安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽 455000）

·農產品加工·

橘皮提取液抑菌作用研究

路志芳 張超

（安陽工學院生物與食品工程學院，河南安陽 455000）

本試驗以柑橘副產品橘皮為原料，烘干后分別用無水乙醇和乙醚提取橘皮中活性成分，濃度分別稀釋為1%、5%、9%、13%，用濾紙片法測定橘皮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的抑制作用，同時測定最低抑菌濃度和生長曲線。對比兩種不同橘皮提取液的抑菌效果差異，分析橘皮提取液作為防腐劑的可行性。試驗結果表明，在相同條件下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明顯強于橘皮乙醚提取液，更適于做食品防腐劑。

橘皮；提取液；抑菌作用

橘皮，又稱為陳皮，為蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮。橘皮具有良好的抑菌作用，研究發(fā)現，柑橘皮渣對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、青霉、根霉、啤酒酵母等都有抑制作用。本試驗在現有防腐劑基礎上，研究了橘皮提取液提取方法及其抑菌作用，以滿足企業(yè)生產技術的發(fā)展以及消費者對食品安全的需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為柑橘，食用級，市售；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌，安陽工學院生物與食品工程學院微生物實驗室提供；無水乙醇，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司提供；乙醚，分析純，山東檸檬生化有限公司提供；牛肉膏，生化試劑，北京奧博星生物技術有限公司提供；蛋白胨，生化試劑，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠提供；NaCL、瓊脂粉，生化試劑，天津市致遠化學試劑有限公司提供。試驗設備為隔水式恒溫培養(yǎng)箱，型號GHP-9050N，上海一恒科學儀器有限公司生產；數顯恒溫水浴鍋，型號HH-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司生產；電熱恒溫鼓風干燥箱，型號DGG-970B，上海森信實驗儀器有限公司生產；高壓滅菌鍋，型號GT7C720，廣州市番禹力豐食品機械廠生產；電子天平，型號JA21002，上海精天儀器有限公司生產；旋轉蒸發(fā)儀，型號YRE-301，鞏義市予華儀器有限責任公司生產；冰箱，型號BCD-230，青島海爾股份有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 橘皮提取液對各指示菌種的敏感性測試

用接種環(huán)挑取少量活化菌種，置于滅菌后的生理鹽水中，充分震蕩混勻，制成菌懸液。取出經高壓蒸汽滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基冷卻凝固前，在無菌操作臺上迅速將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內。培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取菌懸液200μL注入平板，用平板涂布器均勻涂布。取充分蘸取各濃度橘皮提取液的濾紙片放入平板，每個培養(yǎng)皿中放3～5個，距離適中。37℃培養(yǎng)1d后，取其抑菌圈的平均直徑，即為該提取液對此菌種的抑菌結果。

1.2.2 橘皮提取液對各指示菌種的最低抑菌濃度（MIC）［1］

觀察并測量橘皮提取液對菌種敏感性測試的結果，順濃度梯度查看，第一個起抑菌作用的橘皮提取液濃度即是此菌種最低抑菌濃度。確定不同溶劑橘皮提取液的最低抑菌濃度。

1.2.3 橘皮提取液對指示菌種生長的影響

選用橘皮乙醇提取液，用濃度為各指示菌的最低抑菌濃度1倍的濃度去作用3種指示菌種。通過比較各指示菌生長曲線的變化，觀察各橘皮提取液對指示菌生長周期的影響。用大腸桿菌為例來加以說明，取20支經高壓蒸汽滅菌的試管，每支試管分別倒入5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，每管接種1mL大腸桿菌菌懸液。然后分成2組（每組10管），1組用來測定15h內大腸桿菌的的正常生長曲線，2組用來測定15h內加橘皮提取液后大腸桿菌的生長曲線。每隔1h取樣測定其OD540值，繪制正常生長曲線和橘皮提取液作用后的生長曲線。

1.2.4 試驗過程

（1）橘皮提取液提取：選取市售新鮮柑橘2kg，用清水洗凈后剝去外皮，將剝下來的外皮放入電熱恒溫鼓風干燥箱干燥，干燥溫度60℃、時間24h。干燥完畢后放于通風處1h，再用粉碎機充分粉碎，得到橘皮粉。將橘皮粉密封避光保存?zhèn)溆?。稱取20g橘皮粉放入2個500mL容量瓶中，容量瓶中分別加入200mL無水乙醇和乙醚，瓶上分別貼上標簽，浸泡過夜。小心將容量瓶中的上部分液體倒出，用旋轉蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，即得油狀物。貼標簽后放入冰箱4℃條件下密封避光保存。（2）培養(yǎng)基的制備：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方為牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCL 5g、瓊脂15～20g、水1000mL，pH值7.4～7.6。（3）培養(yǎng)基滅菌：將濾紙片放在需要滅菌的培養(yǎng)皿中，用報紙包裹培養(yǎng)皿，實驗所需試管也用報紙包好，用繩扎緊。將放置培養(yǎng)基的三角瓶、實驗所需培養(yǎng)皿、直徑6mm的濾紙片和若干干凈試管放入滅菌鍋中滅菌，滅菌溫度121℃、時間15min，滅菌完畢后取出待用。（4）菌懸液的制備：大腸桿菌1管，金黃色葡萄球菌1管，青霉菌1管。在無菌工作臺上用接種環(huán)在酒精燈上燒烤后，打開菌種試管塞，從活化后的斜面菌種上刮少量菌，置于裝有10mL無菌生理鹽水的試管中，充分搖勻，最后貼上標簽，備用。（5）橘皮提取液抑菌：在無菌工作臺上，將還未冷卻的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個約20mL。待培養(yǎng)皿內培養(yǎng)基冷卻、凝固后，用移液槍準確量取200μL菌懸液放于固體培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，置于37℃恒溫箱中15min后取出，使得瓊脂表面干燥，備用。用無菌鑷子夾取滅菌的濾紙片，分別充分蘸取已稀釋1%、5%、9%、13%的乙醇提取液和乙醚提取液，放在上述各含菌培養(yǎng)皿上。每種濃度的濾紙在培養(yǎng)皿內間隔一定的距離放3片。每個培養(yǎng)皿上都要貼上標簽，標明溶劑類別和濃度。將培養(yǎng)皿倒置放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察各菌種的生長情況，并測定最低抑菌濃度（MIC）。

2 結果與分析

2.1 橘皮乙醇提取液的抑菌效果

由表1可知，橘皮乙醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果較明顯，對青霉菌的抑菌效果不明顯。提取液濃度達到5%時，橘皮乙醇提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌開始起抑菌作用，提取液濃度達到13%時對青霉菌開始起抑菌作用。提取液濃度為9%時，對大腸桿菌表現出抑制作用；提取液濃度為13%時，對金黃色葡萄球菌起抑制作用。

表1 各濃度橘皮乙醇提取液的抑菌效果

2.2 橘皮乙醚提取液的抑菌效果

由表2可知，橘皮乙醚提取液對3種供試菌的抑制作用不明顯，提取液濃度為9%時才對大腸桿菌起抑菌效果，濃度為13%時才對金黃色葡萄球菌起抑菌效果，而對青霉菌未表現出抑制作用。

表2 各濃度橘皮乙醚提取液的抑菌效果

2.3 最低抑菌濃度

由表1可知，本試驗橘皮乙醇提取液濃度為5%時，大腸桿菌平板中開始有抑菌圈，5%乙醇橘皮提取液為大腸桿菌最低抑菌濃度；橘皮乙醇提取液濃度為5%時，金黃色葡萄球菌平板中開始有抑菌圈出現，5%乙醇橘皮提取液為金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度；橘皮乙醇提取液濃度為13%時，青霉菌平板中開始有抑菌圈出現，13%乙醇橘皮提取液為青霉菌最低抑菌濃度。由表2可知，本試驗橘皮乙醚提取液濃度為9%時，大腸桿菌平板中開始有抑菌圈，9%乙醚橘皮提取液為大腸桿菌最低抑菌濃度；橘皮乙醚提取液濃度為13%時，金黃色葡萄球菌平板中開始有抑菌圈，13%乙醚橘皮提取液為金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度；而試驗所測濃度范圍內，橘皮乙醚提取液對青霉菌無抑菌效果。

2.4 橘皮乙醇提取液對菌種生長曲線的影響

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉菌的正常生長曲線為對照，加入各菌種1倍最低抑菌濃度的橘皮乙醇提取液后，除青霉菌外，其它菌種生長曲線皆發(fā)生明顯變化。柑橘皮提取液作用大腸桿菌7h后活菌數開始明顯下降；12h后折線開始向下，進入衰亡期，沒有達到正常的生長高峰。在柑橘皮提取物作用金黃色葡萄球菌6h或7h后，明顯可以看到有活菌下降現象，11～12h后進入衰亡期。這些數據表明，柑橘皮提取液主要抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在對數生長期的菌體分裂。

3 小結

兩種有機溶劑提取液相同濃度相同菌種抑菌效果對比下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明顯強于乙醚提取液。不同濃度的橘皮提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有一定抑制效果，抑制效果與濃度成正相關。試驗范圍內，各濃度橘皮提取液對青霉菌基本沒有效果。大腸桿菌的最低抑菌濃度最低，說明該指示菌對橘皮提取液最敏感。從試驗結果來看，橘皮提取液具有一定抑菌效果。由于我國柑橘資源豐富，廉價易得，從天然防腐劑取代人工防腐劑趨勢來看，柑橘具有較好的利用價值。從植物中提取天然防腐劑是現代食品防腐劑發(fā)展的新方向，是消費者對天然防腐劑的需求，具有很高的研究價值和開發(fā)前景。且柑橘中各物質的提取工藝相對簡單，具有橙香氣，根據其對微生物的抑制作用，可制成新型的食品防腐劑。

［1］陳濤.蘆薈與常見食品防腐劑的抑菌效果比較［J］.山西化工，2009，29（5）：20～22.